패터닝 단백질과 세포의 다목적 방법

요약

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

초록

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

서문

조직 공학 및 바이오 센서에서는 μm의 규모 단백질 및 세포의 공간 조직을 제어하는 능력은, 마지막 네 수십 ^{1, 2, 3} 위로 갈수록 중요 해지고있다. 단백질 및 세포의 정확한 공간적 조직 ^{연구자들은} 세포 증식을 유도하고, 바이오 센서 ^{4, 5, 6, 7, 8의} 제조에 생체 분자를 고정하기 위해, 세포의 유사하거나 또는 상이한 유형을 포함하는 셀과 기판 사이의 상호 작용을 조사 할 수있다 ^9.

패터닝 단백질의 현재의 방법은 포토 패터닝 및 마이크로 콘택트 인쇄를 포함한다. 포토 패터닝은 ultr에 노출시 가교 감광 재료를 사용바이올렛 (UV) 빛. (UV 광 투과를 방지하는 어두운 영역과 투명 영역으로 구성된) 포토 마스크에 관한 UV 빛은 생체 물질 또는 셀 ^{(10), (11)의} 후속 연결을 위해 사용할 수있는 특정 지역에 가교 결합시킨다. 이 방식은 매우 정확하고 배양 표면의 지형을 정밀하게 제어 할 수 있지만, 이는 UV 방사 ^(12)에 의해 패터닝 될 수 UV 성 생체 제한된다. 마이크로 콘택트 인쇄는 특정 단백질 ^{13, 14} 패턴의 또 다른 인기있는 방법입니다. 이 방법에서, 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 스탬프 선택된 생체 분자 기판의 용액에 침지되기 전에 표면 개질 다양한 시약으로 처리한다. 그 다음 부드럽게 따라서 배양 표면에 생체 분자를 "스탬프"유리 커버 슬립 또는 다른 표면 상에 가압된다. 호Wever에게는 스탬핑은 PDMS ¹⁵ 스탬프 표면에 생체 분자의 습윤성뿐만 아니라 전송 될 수있는 물질의 종류로 제한된다.

세포를 직접 패터닝은 더 어려울 수 및 특정 세포 부착 분자 ^{(16) (17)와} 스위칭 기판 공판 기반 방법 또는 패터닝과 같은 복잡한 방법에 의존 할 수있다. 이러한 방법으로 인해 호환 세포 접착 기재의 부족 패턴 셀 능력에 제한이 프로세스의 호환성이 중요한 생물학적 세포 및 제약 패터닝 재생의 불일치 및 절차의 복잡도와 함께 작동한다. 예를 들면, 전환 가능한 기질 맞춤 기판 <공정 ^17에서 사용 된 UV 광 및 ^열 노출시 열화없이 특정 세포 유형에 대한 그들의 부착 전환 모든 세포 유형을 위해 설계 될 필요 SUP 클래스 = "외부 참조"> ^{18, 19, 20.} 스텐실 기반의 패터닝 방법은 패턴 셀 능력에 다목적; 그러나, 게다가 ^{16, 21에} 해당하는 두께로 PDMS 스텐실을 제조하는 것이 곤란하다. 1) 미세 유체 채널의 제조에 용이하고 다양한 세포와 ​​기질 2) 적합성 : PDMS 미세 유체 채널로 세포를 직접 주입은 몇 가지 장점 등이있다. 그러나, 기포를 감소시키는 플라즈마 세정 또는 다른 방법을 사용하지 않고 PDMS의 소수성에 주입 공정 중에 기포 포착의 보급 문제는 어려운 일관 유리 또는 플라스틱 표면 ^(21)상의 패턴 화 된 세포를 생성 할 수있다.

이 ^작품은, 모세관 마이크로 몰딩 ^{(22), (23)에} 확장아가씨 = "외부 참조"> ^{24, 25, 26는} 마이크로 채널에 단백질 및 세포 현탁액을 주입하는 방법을보고한다. 여기에 사용 된 방법은 기판의 패터닝 및 특정 세포 유형의 직간접 패터닝을 나타낸다. 이 기술은 PDMS의 높은 소수성을 극복 PDMS ^(27)의 가스 투과성을 이용하여 하나의 기판 또는 세포 주입시 기포의 존재를 제거한다. 이 논문은 여러 가지 기판과 세포 유형과 기술을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 문서에서는 또한 기존의 포토 리소그래피뿐만 아니라 자원에서 유용 간단하고 저렴한 비용으로 접착 테이프 방법 제한 설정 ^{28, 29를} 사용하여 소프트 리소그래피를위한 금형의 제작을 강조한다.

프로토콜

참고 : 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 이 프로토콜에서 사용되는 화학 물질 중 일부는 독성 및 발암 성이다. 독성 또는 산 / 염기 재료를 사용하는 경우 모든 적절한 안전 사례 (흄 후드, 글러브 박스) 및 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지, 폐쇄 발가락 신발)를 사용하십시오.

소프트 리소그래피 사용하여 포토 리소그래피를위한 마스터 금형 1. 제작

1. 컴퓨터 지원 설계 (CAD)의 그리기 도구를 사용하여 마이크로 채널의 레이아웃을 그린다.
2. 레이저 마스크 작가를 사용하여 빈 마스크 판에 레이아웃을 인쇄합니다.
3. 어떠한 용매는 웨이퍼 상에 남지 않도록 질소 공기 총 이소프로판올 건조한 다음, 아세톤으로 4 인치 실리콘 웨이퍼를 헹군다.
4. 5 분 동안 200 ℃에서 핫 플레이트로 소성하여 웨이퍼 탈수.
5. 마이크로 채널의 원하는 높이에 대한 설계 네가티브 포토 레지스트를 선택합니다. 에프또는 예를 들어, 50 ㎛의 높이와 미세 채널을 얻었다 네가티브 포토 레지스트 SU-8 (50)를 사용한다.
6. 웨이퍼를 실온까지 냉각되도록 한 후, 스핀 코터의 척 상에 웨이퍼를 정렬.
7. 웨이퍼의 중심에 네가티브 포토 레지스트 4 ㎖ (웨이퍼 1 ㎖ / 인치 직경)를 분배.
8. 스피너를 사용하여 두 단계의 스핀 사이클에 코팅을 웨이퍼 스핀. 첫째, 10 초 100 RPM / S의 가속도와 500 rpm의 확산 사이클을 적용합니다. 그 다음 웨이퍼 상에 포토 레지스트의 50 μm의 코팅을 얻기 위해 30 초 동안 300 rpm으로 / S ^2의 가속도와 2,000 rpm의 회전주기를 적용합니다.
9. 소프트 베이크와 제조자의 지시에 따라, 핫 플레이트에 두 단계에서 웨이퍼. 포토 레지스트의 50㎛의 코팅 먼저 프리 베이크 6 분 동안 65 ° C에서의 웨이퍼 후 바로 20 분 동안 95 ° C에서 웨이퍼 베이킹 게시 열판 온도 램프 업.
10. 웨이퍼를 실온까지 냉각 한 후로드 허용리소그래피 무대에 대 웨이퍼.
11. 마스크 얼 라이너를 사용하여 웨이퍼상의 마스크를 맞추고 220 mJ을 총 UV 조사량을 적용 (146)의 1.5 mW의 / ^㎠의 강도에서 (제조자의 지시에 따라) UV 광에 웨이퍼를 노출 / cm ² 필요 포토 레지스트의 50 μm의 두께 층.
12. 핫 플레이트에 두 단계에서 웨이퍼에 포스트 노출 베이킹을 적용합니다. 포토 레지스트의 50 ㎛의 코팅 먼저 프리 베이크 즉시 1 분, 65 ℃에서 웨이퍼를 5 분 동안 95 ° C에서이를 베이킹 게시 열판 온도 램프 업.
13. SU-8 현상액에 웨이퍼를 침지하고, 기능, 웨이퍼에 명백해질 때까지 가볍게 흔들어 웨이퍼의 개발. 50 μm의 두께 포토 레지스트 ~ 6 분의 웨이퍼를 개발한다.
14. 이소프로판올 및 에탄올 과잉 현상을 씻어 다음, 질소 공기 총을 가진 웨이퍼를 건조.
15. 하드 15 분간 150 ℃에서 핫 플레이트 상에 실리콘 웨이퍼를 굽는다.
16. 놓고silanizing 제 25 μL로 데시 케이 터에서 웨이퍼 트리 데카 - 1,1,2,2- tetrahydrooctyl -1- 트리클로로한다.
    참고 : silanizing 에이전트가 적절한 개인 보호 장비, 따라서 산 / 염기 흄 후드에서 사용되어야한다, 부식성 (보안경, 장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지, 신발 - 발가락을 휴관).
17. 5 분 동안 진공을 적용하고 진공을 해제하지 않고 30 분 동안 실란의 증기에 웨이퍼를 노출합니다.
18. 적절하게 크기의 페트리 접시에 웨이퍼를 전송합니다.

접착 테이프를 사용하여 소프트 리소그래피를위한 마스터 금형 2. 제작

1. 캐드 드로잉 도구를 사용하여 마이크로 채널의 레이아웃을 그리고 흰 종이에 드로잉을 인쇄 할 수 있습니다.
2. 이소프로판올 설계를 수용 한 후 공기 총 슬라이드를 건조시키는 것이 충분히 큰 유리 슬라이드를 청소한다.
3. 세정 된 유리 슬라이드에 접착 테이프를 부착합니다. 공기 방울 트랩에주의하지 말라.
4. GLA의 측면을 테이프SS는 테이프 쪽이 위로, 설계와 용지에 밀어 넣습니다.
5. 참고로 용지 설계를 사용하여 유리 슬라이드에 테이프를 절단하고 유리 슬라이드의 원치 않는 영역에서 테이프를 벗겨 메스를 사용한다.
6. 공기 총을 가진 유리 이소프로판올과 슬라이드 한 다음 건조를 씻어. 30 분 동안 65 ° C의 오븐에서 유리 슬라이드 굽는다.
7. 부드럽게 기포를 제거하고, 슬라이드를 실온으로 냉각 할 수 있도록 고무 롤러 테이프 롤오버.

PDMS의 장치 3. 소프트 리소그래피 제작

1. 10의 비율로 PDMS 엘라스토머와 경화제를 혼합 1은 (W : w) 격렬하게 혼합 교반하고, 기포가 혼합물에 나타나지 않을 때까지 다음의 진공 챔버 내에 배치하여 상기 혼합물을 탈기.
2. 거품이 사라 모든 공기까지 1 ~ 2 mm 두께의 PDMS 층과 탈기를 얻기 위해 배양 접시에 실란 화 된 실리콘 몰드 또는 접착 테이프 금형 위에 혼합물을 붓는다.
3. 오븐에서 경화 PDMS2 시간 동안 65 ° C에서.
4. 적어도 5mm 떨어진 기능에서 PDMS 층을 잘라 메스를 사용하고 집게를 사용하여 금형 해제 경화 PDMS 벗겨.
5. 도 2a 및도 4b에 도시 된 바와 같이 1㎜의 생검 단일 입구 구멍은 바람직하게는 마이크로 채널 네트워크의 끝에서, 마이크로 아무 곳 펀치 펀치.
6. 장치에 흡착 된 먼지 입자를 제거하기 위해 접착 테이프로 캐스팅 PDMS를 청소합니다. 멸균 탈 이온수 (DI) 물에 이어 70 % 에탄올의 용액으로 세척하여 PDMS 마이크로 채널 장치 (PDMS 캐스트)을 소독하고, 30 분 동안 UV에 노출.
7. 사용할 때까지 멸균 페트리 접시에 멸균 PDMS 장치를 유지합니다.

4. 기판 패터닝

1. 멸균 유리 커버 슬립이나 배양 접시에 핀셋을 사용하여 캐스팅 멸균 PDMS를 놓고 핀셋의 끝을 사용하여 부드러운 압력을 적용합니다.
   참고 : PDMS 캐스트는 GL와 컨 포멀하지만 가역 실을 수 있습니다엉덩이 커버 슬립이나 접착제를 사용하지 않고 마이크로 채널을 형성 배양 접시.
2. 완전히 주입구를 덮는 입구에 기질 용액 - (40 μL 20) 방울을 놓는다. 마이크로 채널의 입구에 소듐 테트라 보레이트 완충액 PDL의 20 μL 방울을 배치하여 패턴 폴리 D 라이신 (PDL).
3. 10 분 동안 (생물학 실험실에서 진공 집에 상당), 거품의 형태로 채널에서 나오는 공기를 준수 ~ 254 mmHgA의 진공에서 배양 접시를 넣어.
4. 진공을 해제하고 마이크로 채널로 유입되는 기질 용액을 관찰합니다.
5. 기판 준수에 대한 적절한 조건에서 접시를 품어. 표 1 및 배양 조건 2 (이 기판에 따라 다릅니다)를 참조하십시오. PDL 패터닝를 들어, 37 ° C에서 1 시간 동안 배양한다.
6. 조심스럽게 멸균 핀셋을 사용하여 PDMS 스탬프를 벗겨 DI 물에 세 번 유리 커버 슬립에 패턴을 씻는다.
7. 접시 또는 유리 커버 슬립을 커버하고 밤새 37 ° C에서 배양을 페트리 접시에 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) 용액을 첨가.
   참고 :이 코팅되지 않은 지역이 아닌 특정 부착을 줄일 수 있습니다.
8. 1 % BSA 용액, 및 상기 패터닝 된 기판 대기음은 이제 사용할 준비가되어있다.

세포의 5. 간접 패터닝

1. 무 혈청 배지에서 세포 현탁액을 준비한다. 셀 타입 및 셀 밀도를 표 1에 나열되어있다.
2. 패터닝 된 배양 접시에 세포 현탁액을 첨가하고 완전히 세포 현탁액의 패턴 영역 잠수함.
3. 세포 패터닝 기판에 부착 할 수 있도록 15 분 동안 인큐베이터 내에서 37 ° C에서 배양 접시를 부화.
4. 페트리 접시에서 초과 세포 현탁액을 대기음 부드럽게 부착되지 않은 세포를 제거하기 위해 10 초 동안 흔들어 섞으면 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)으로 패턴 화 된 세포를 세 번 씻는다.
5. ㄱ 추가ppropriate 배양 패터닝 된 세포 배양 배지로하여 _CO2 인큐베이터에서 37 ° C에서 상기 패터닝 된 세포를 배양한다.

세포의 6. 직접 패터닝

주 :이 기술은 세포 기질 또는 코팅없이 조직 배양 표면에 패터닝이 기술에서, 단계 5와 달리 단계 5에 기재된 간접 셀 패터닝의 대안이다.

1. DI 물,이어서 70 % 에탄올의 용액으로 세척하여 미세 유체 소자를 소독.
2. PDMS로 세포 부착을 방지하기 위해, 1 % BSA 용액에 하룻밤 침지 장치.
3. 실온에서 장치를 건조하고 조직 문화 처리 된 배양 접시의 바닥에 부착.
4. 무 혈청 배지에서 세포 현탁액을 준비한다. 셀 타입 및 셀 밀도를 표 2에 나와있다.
5. 을 채우도록 세포 현탁액 - (8 μL 4) 액 적을 배치마이크로 채널은 입구에 완전히 주입구를 덮는.
6. 10 분 동안 진공 상태에서 페트리 접시에 넣고 기포의 형태로 채널에서 나오는 공기를 관찰한다. 진공을 해제하고 마이크로 채널로 유입되는 세포 현탁액을 관찰합니다.
7. 배양 조건에 따라 세포 접착 성을 촉진하는 인큐베이터에서 배양 접시를 부화하기 표 2에 언급 된 (셀 패턴의 유형에 의존). PDMS의 장치를 잠수 페트리 접시에 PBS를 추가합니다.
8. 껍질 PDMS 조심스럽게 핀셋으로 배양 접시 끄고 PBS와 패턴을 씻는다. 페트리 접시에 세포 배양 배지를 추가하고 배양기에서 세포 배양을 배치합니다.

결과

이 방법은 단백질 및 마스터 주형이 이루어지면 거의 모든 생물 실험실에서 10 μm의 가능한 장비 한 작은 치수 데드 엔드 미세 유체 채널을 사용하여 세포의 간접 패터닝의 패터닝을 허용한다. 이 기술은 기존의 소프트 리소그래피, 또는 접착 테이프의 제작 (도 1) ^{(28) (29)로} 작성된 PDMS 미세 유체 채널을 사용하여 생?...

토론

기존의 포토 리소그래피 소프트 리소그래피, 장비, 재료 및 기존의 포토 리소그래피를 사용하는 데 필요한 기술을위한 금형 제작을위한 잘 확립 된 기술이지만 대부분의 실험실에 쉽게 사용할 수 없습니다. 이 자원에 대한 접근없이 실험실을 위해, 우리는 마이크로 유체 장치를위한 비교적 단순한 기능 주형을 만드는 방법으로 접착 테이프 제조를 제시 하였다. 이 방법은 어떤 기관이 작성하고 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools	Corel Corporation, Canada	X4 Version 14.0.0.701	CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device
Laser Printer HP	Hewlett Packard, CA	1739629	Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique
Bel-Art Dessicator	Fisher Scientific, MA	08-594-16B	Used to degass the PDMS mixture
Adhesive Scotch Tape	3M Product, MN	Tape 600	Used to fabricate adhesive tape Master
PDMS Sylgard 184	Dow Corning, MI	1064291	Casting polymer
Petri Dish	Fisher Scientific, MA	08-772-23	Used to keep the mold to cast with PDMS
Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11)	Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan	2976#11	Used to cut the PDMS
Tweezers	Ted Pella, CA	5627-07	Used to handle the PDMS cast during peeling
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-546-2	Used as surface to pattern the Substrate
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-544-4	Used as surface to pattern the Substrate
Rubber Roller	Dick Blick Art Materials, IL	40104-1004	Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles
Laser Mask Writer	Heidelberg Instruments, Germany	DWL66fs	Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process
EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool)	EV Group, Germany	EVG 620T(B)	Used to expose the photoresist to UV light
Spin Coater Headway	Headway Research Inc, TX	PWM32-PS-CB15PL	Used to spin coat the photoresist on silicon wafer
Photoresists SU-8 50	MicroChem, MA	Y131269	Negative photoresist used for mold fabrication
SU-8 Devloper	MicroChem, MA	Y020100	Photoresist developer
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane	UCT Specialties, PA	T2492-KG	Coat mold to avoid PDMS adhesion
Isopropanol	Sigma-Aldrich, MO	190764	Cleaning Solvent
Ethanol	Sigma-Aldrich, MO	24102	Sterilization Solvent
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich, MO	P0899-10MG	PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer
Laminin	Sigma-Aldrich, MO	L2020	Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use
BSA	Fisher Scientific, MA	BP1605100	Cell culture
C2C12 Myoblast cell lline	ATCC, VA	CRL-1722	Used to demonstrate C2C12 patterning
PC12 Cell Line	ATCC, VA	CRL-1721	Used to demonstrate PC12 patterning
Collagen type 1, rat tail	BD Biosciences	40236	Cell culture
DMEM	GIBCO, MA	11965-084	Cell culture
Horse Serum, heat inactivated	Fisher Scientific, MA	26050-070	Cell culture
Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC)	Sigma-Aldrich, MO	P1951	To label cells
Calcein-AM live dead cell Assay kit	Invitrogen, MA	L-3224	Cell viability Assay
Biopsy Hole Punch	Ted Pella, CA	15110-10	Punched hole in PDMS