パターニングタンパク質および細胞の多彩な方法

要約

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

要約

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

概要

組織工学とバイオセンシングでは、ミクロンスケールのタンパク質や細胞の空間的な組織を制御する能力は、最後の四十年^1、2、3の上にますます重要になってきています。タンパク質および細胞の正確な空間的な組織は^、研究者は、細胞増殖を誘導すること、およびバイオセンサー^{4、5、6、7、8}の製造のために生体分子を固定化するために、細胞の同様のまたは異なる種類を含む細胞と基板の間の相互作用を調べることを可能にしました^9。

パターニングタンパク質の現在の方法は、光パターン及びマイクロコンタクト印刷が挙げられます。フォトパターンはultrに曝露されると架橋されている感光材料を利用しますバイオレット（UV）光。 （UV光の透過を防止するために、暗い領域と透明な領域からなる）、フォトマスクに向けられたUV光は、生体材料またはセル^10,11の後続の結合のために使用することができる特定の領域に架橋させます。この方式は非常に正確であり、培養表面のトポグラフィーを正確に制御することができるが、それは、UV放射¹²によってパターニングすることができるUV感受性生体分子に限定されます。マイクロコンタクトプリント法は、特定のタンパク質^13、14をパターニングする別の一般的な方法です。この方法では、ポリジメチルシロキサン（PDMS）スタンプは、選択された生体分子の基質の溶液に浸漬される前に、表面改質剤の様々な治療されます。次に、それを静かにこのように培養表面上に生体分子を「スタンプ」カバーガラスまたは他の表面に押し付けられます。ホーweverは、スタンプはPDMS ^15をスタンプの表面への生体分子の濡れ性と同様に転写することができる材料の種類に限定されます。

細胞の直接パターニングがより困難になり、そのような特定の細胞接着分子^16、17と切り替え可能基板、ステンシルベースの方法、またはパターニングのような複雑な方法に依存していることができます。これらの方法は、原因互換性細胞接着基板の欠如、敏感な生体細胞および制約で動作するプロセスの不適合、パターニング再生の矛盾、及び手順の複雑さにパターン細胞の能力が制限されています。例えば、切替可能な基質と、カスタム基板は^、<、プロセス¹⁷において使用されるUV光及び熱への暴露時に劣化することなく、特定の細胞型への付着を切り替え、すべての細胞型のために設計される必要があります SUPクラス= "外部参照"> ^{18、19、20。}ステンシルベースのパターニング方法は、パターンのセルにその能力に多目的です。しかしながら、使用^16、21のために適切な厚さでPDMSステンシルを製造することは困難です。 1）マイクロ流体チャネルの製造及び2に容易に）多くの異なる細胞と基質のための適性：PDMSマイクロ流体チャネルへの細胞の直接注射は、次のようないくつかの利点を持っています。しかし、注入プロセス中に気泡の捕捉の流行問題は、気泡を減少させるプラズマ洗浄、または他の方法を使用せずにPDMSの疎水性のために、それが困難一貫ガラスまたはプラスチック表面²¹上にパターン化された細胞を作製することができます。

この作品は^、毛細管マイクロモールド^22、23と膨張します小娘= "外部参照"> ^24、25、26およびマイクロチャネルへのタンパク質や細胞懸濁液を注入する方法を報告します。ここで使用される方法は、基板のパターン形成および特定の細胞型の両方の直接的および間接的なパターニングを示しています。この技術は、PDMSの高い疎水性を克服し、PDMS ²⁷のガス透過性を利用して基板または細胞のいずれかの注入時の気泡の存在を排除します。本稿では、いくつかの異なる基質と細胞型と技術の使用を示しています。記事はまた、従来のフォトリソグラフィと同様に、リソースの限定された設定^28、29で有用なシンプルかつ低コストの粘着テープ法を用いたソフトリソグラフィ用の金型の製造を強調しています。

プロトコル

注：使用前に、関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。このプロトコルで使用される化学物質の一部は有毒で発ガン性があります。毒性または酸/基材を使用した場合、すべての適切な安全対策（ヒュームフード、グローブボックス）および個人用保護具（安全眼鏡、手袋、白衣、完全長ズボン、閉じたつま先の靴）を使用してください。

フォトリソグラフィを用いて、ソフトリソグラフィのためのマスター金型の1製作

1. コンピュータ支援設計（CAD）図面ツールを使用してマイクロチャネルのレイアウトを描きます。
2. レーザーマスク描画装置を用いて、マスクブランク板にレイアウトを印刷します。
3. いかなる溶媒をウェハ上に残っていないことを確実にするために窒素エアガンイソプロパノール及びドライ続いアセトンで4インチシリコンウエハをすすぎます。
4. 5分間、200℃のホットプレート上で焼成することにより、ウエハを脱水。
5. マイクロチャネルの所望の高さのために設計されたネガ型フォトレジストを選択します。 Fまたは、例えば、50μmの高さのマイクロチャネルを得るために、ネガティブフォトレジストSU-8 50を使用します。
6. ウェハを室温に戻します、その後、スピンコーターのチャック上にウエハを合わせます。
7. ウェーハの中心に、ネガ型フォトレジストの4mLの（ウェーハの1ミリリットル/インチ直径）を分配します。
8. スピナーを用いた2段階の回転周期にコートにウェハをスピン。まず、10秒間100回転/秒の加速度で500回転の広がりサイクルを適用します。その後、ウエハ上のフォトレジストの50μmのコーティングを得るために、30秒間300回転/秒²の加速度で2000回転の回転サイクルを適用します。
9. ソフトメーカーの指示に従って、ホットプレート上の2つのステップでウェハを焼きます。フォトレジストの50μmのコーティングについては、6分間の65℃でのウエハプリベーク最初にして、すぐに20分間95℃でポストベークするウエハホットプレートの温度を上昇します。
10. ウェハを室温まで冷却した後、ロードしますリソグラフィステージ上にウエハ。
11. マスクアライナを用いてウェハ上にマスクを合わせ、ために必要な220ミリジュール/ cm ²の総UV線量を適用するために146秒間、1.5ミリワット/ cm ²の強度で（製造業者の指示に従って）UV光にウェハを公開フォトレジストの厚さ50μmの層。
12. ホットプレート上の2つのステップでウェハに露光後ベークを適用します。フォトレジストの50μmのコーティングのために、1分間65℃、ウェハプリベーク、直ちに最初のポストベークすること、95℃で5分間、ホットプレートの温度をランプアップ。
13. SU-8現像液にウェハを浸漬し、特徴は、ウェハ上明確になるまで、穏やかに振とうすることにより、ウェーハを開発します。厚さ50μmのフォトレジスト用〜6分間ウェハを開発します。
14. その後、窒素エアガンでウェハを乾燥、イソプロパノール及びエタノールで余剰の現像を洗い流してください。
15. ハード15分間、150℃のホットプレート上にシリコンウェハを焼きます。
16. 置きシラン化剤25μLのトリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル-1-トリクロロシランでデシケーター中でウェハ。
    注：シラン化剤は、腐食性のある、このようにして、適切な個人用保護具（安全眼鏡、手袋、白衣、完全長ズボン、閉じたつま先の靴）と、酸/塩基ドラフト内で使用されるべきです。
17. 5分間の真空を適用し、真空を解除せずに30分間シランの蒸気にウェハを公開します。
18. 適切なサイズのペトリ皿にウェハを転送します。

粘着テープを使用したソフトリソグラフィ用のマスター金型の2製作

1. CADの描画ツールを使用して、マイクロチャネルのレイアウトを描き、白い紙に図面を印刷します。
2. イソプロパノールで設計を収容した後、空気銃でスライドを乾燥するのに十分な大きスライドガラスを清掃してください。
3. 清浄なガラススライド上に粘着テープを取り付けます。任意の気泡をトラップに注意しないこと。
4. GLAの両側をテープssはテープ側を上にして、デザインを紙の上にスライドさせます。
5. 参考として、紙のデザインを使用して、スライドガラス上にテープをカットした後、スライドガラスの不要な領域からテープを剥離するメスを使用してください。
6. イソプロパノールでガラススライドを洗浄した後、エアガンで乾燥。 30分間65℃のオーブン中にスライドガラスを焼きます。
7. 穏やかに気泡を除去し、スライドを室温に冷却させるために、ゴムローラーを用いてテープの上に転がります。

PDMSデバイスの3ソフトリソグラフィ製作

1. 10の比でPDMSエラストマーと硬化剤を混合する：1（W：W）、混合物を激しく撹拌し、その後に気泡を混合物に表示されなくなるまで真空チャンバ内に配置することによって混合物を脱気。
2. すべての気泡が消えるまで、PDMSと脱ガスの〜2ミリメートルの厚さの層を得るために、ペトリ皿の中でシラン化されたシリコン型や粘着テープの金型に混合物を注ぎます。
3. オーブンでPDMSを治します2時間65℃。
4. 離れの特徴から少なくとも5ミリメートルPDMS層をカットした後、ピンセットを用いて、金型から硬化PDMSを剥離するメスを使用してください。
5. 好ましくは、 図2a及び図4bに見られるように、マイクロチャネルのネットワークの端部で、任意の場所にマイクロチャネルに、1mmの生検パンチを備えた単一の入口穴を開ける。
6. デバイス上に吸着ダスト粒子を除去するために、粘着テープでキャストPDMSを清掃してください。滅菌脱イオン（DI）水、続いて70％エタノール溶液ですすぐことにより、PDMSマイクロチャネルデバイス（PDMSキャスト）を滅菌し、30分間UVにさらします。
7. 使用するまで滅菌ペトリ皿中の滅菌PDMSデバイスを保管してください。

4.基板のパターニング

1. 滅菌ガラスカバースリップまたはペトリ皿の上にピンセットを用いて鋳造滅菌PDMSを置き、ピンセットの先端を使用して穏やかな圧力を適用します。
   注：PDMSキャストはGLと共形が、可逆的シールを作りますお尻のカバースリップまたは任意の接着剤を使用せずにマイクロチャネルを形成するペトリ皿。
2. 完全入口孔を覆って、入口に基質溶液の - （40μL20）の液滴を配置します。マイクロチャネルの入口に四ホウ酸ナトリウム緩衝液中のPDLの20μLの液滴を配置することにより、パターンポリ-D-リジン（PDL）。
3. 10分間（生物学研究所内の真空を収容するのに相当）、および気泡の形でチャネルから出てくる空気を観察〜254 mmHgAの真空中でペトリ皿を置きます。
4. 真空を解除し、マイクロチャネルに流入基質溶液を観察します。
5. 基板密着性のための適切な条件で皿をインキュベートします。 （これらは基板に応じて変化）インキュベーション条件を表1及び表 2を参照のこと。 PDLのパターニングに、37℃で1時間インキュベートします。
6. 慎重に滅菌ピンセットを使用してPDMSスタンプをはがしし、DI水で3回カバーガラス上にパターンを洗います。
7. 皿またはガラス製カバースリップをカバーし、37℃で一晩インキュベートするペトリ皿に、1％ウシ血清アルブミン（BSA）溶液を加えます。
   注：これはコーティングされていない地域での非特異的付着を軽減します。
8. 1％BSA溶液を吸引除去し、パターニングされた基板を使用する準備が整いました。

細胞の5.間接パターニング

1. 無血清培地中の細胞懸濁液を調製します。細胞型および細胞密度を表1に示します。
2. パターン化されたペトリ皿に細胞懸濁液を添加し、完全に細胞懸濁液中のパターン領域を水没。
3. 細胞がパターン化された基板に付着することを可能にするために15分間インキュベーター中で37℃でペトリ皿をインキュベートします。
4. ペトリ皿からの過剰の細胞懸濁液を吸引し、穏やかに付着していない細胞を除去するために10秒間振盪しながらリン酸緩衝生理食塩水（PBS）でパターン形成細胞を3回洗浄します。
5. Aを追加パターン化された細胞培養物にppropriate培地及びCO ₂インキュベーター中37℃でパターン化細胞をインキュベートします。

細胞の6.ダイレクトパターニング

注：この方法は、しかし、ステップ5とは異なり、この技術では、細胞を基板コーティングの有無にかかわらず、組織培養表面上にパターン化された手順5で説明した間接的な細胞パターン形成に代わるものです。

1. DI水、続いて70％エタノールの溶液で洗浄することにより、マイクロ流体デバイスを滅菌します。
2. PDMSへの細胞接着を防止するために、1％BSAの溶液中で一晩デバイスを浸します。
3. 室温でデバイスを乾燥させ、組織培養処理ペトリ皿の底に取り付けます。
4. 無血清培地中の細胞懸濁液を調製します。細胞型および細胞密度を表2に示します。
5. 満たすのに十分の細胞懸濁液 - （8μL4）、液滴を配置マイクロチャネルは、入口に完全に入口穴をカバーしています。
6. 10分間真空中でペトリ皿を入れ、泡の形でチャネルから出てくる空気を観察します。真空を解除し、マイクロ流路に流入する細胞懸濁液を観察します。
7. 表2に記載された（パターン化細胞のタイプに依存）インキュベーション条件に従って、細胞接着を促進するためのインキュベーターでペトリ皿をインキュベートします。 PDMSデバイスを沈めるシャーレにPBSを追加します。
8. ピールPDMS慎重にピンセットでシャーレを切り、PBSでパターンを洗います。ペトリ皿に細胞培養培地を加え、インキュベーター内で細胞培養を置きます。

結果

この方法は、タンパク質およびマスターモールドが行われた後、ほぼすべての生物学研究室では10μmと利用可能な機器と小さい寸法のデッドエンドマイクロ流体チャネルを用いた細胞の間接的なパターニングのパターニングを可能にします。この技術は、伝統的なソフトフォトリソグラフィ、または粘着テープの製造（ 図^{1）28、29<...}

ディスカッション

従来のフォトリソグラフィは、ソフトリソグラフィ用の金型を作成するための十分に確立された技術、設備、材料、従来のフォトリソグラフィを使用するために必要なスキルですが、ほとんどの研究室に容易に入手できません。これらのリソースへのアクセスのない研究室のために、我々は、マイクロ流体デバイスのための比較的単純な機能を備えた金型を作成する方法として、粘着テープ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools	Corel Corporation, Canada	X4 Version 14.0.0.701	CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device
Laser Printer HP	Hewlett Packard, CA	1739629	Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique
Bel-Art Dessicator	Fisher Scientific, MA	08-594-16B	Used to degass the PDMS mixture
Adhesive Scotch Tape	3M Product, MN	Tape 600	Used to fabricate adhesive tape Master
PDMS Sylgard 184	Dow Corning, MI	1064291	Casting polymer
Petri Dish	Fisher Scientific, MA	08-772-23	Used to keep the mold to cast with PDMS
Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11)	Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan	2976#11	Used to cut the PDMS
Tweezers	Ted Pella, CA	5627-07	Used to handle the PDMS cast during peeling
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-546-2	Used as surface to pattern the Substrate
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-544-4	Used as surface to pattern the Substrate
Rubber Roller	Dick Blick Art Materials, IL	40104-1004	Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles
Laser Mask Writer	Heidelberg Instruments, Germany	DWL66fs	Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process
EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool)	EV Group, Germany	EVG 620T(B)	Used to expose the photoresist to UV light
Spin Coater Headway	Headway Research Inc, TX	PWM32-PS-CB15PL	Used to spin coat the photoresist on silicon wafer
Photoresists SU-8 50	MicroChem, MA	Y131269	Negative photoresist used for mold fabrication
SU-8 Devloper	MicroChem, MA	Y020100	Photoresist developer
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane	UCT Specialties, PA	T2492-KG	Coat mold to avoid PDMS adhesion
Isopropanol	Sigma-Aldrich, MO	190764	Cleaning Solvent
Ethanol	Sigma-Aldrich, MO	24102	Sterilization Solvent
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich, MO	P0899-10MG	PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer
Laminin	Sigma-Aldrich, MO	L2020	Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use
BSA	Fisher Scientific, MA	BP1605100	Cell culture
C2C12 Myoblast cell lline	ATCC, VA	CRL-1722	Used to demonstrate C2C12 patterning
PC12 Cell Line	ATCC, VA	CRL-1721	Used to demonstrate PC12 patterning
Collagen type 1, rat tail	BD Biosciences	40236	Cell culture
DMEM	GIBCO, MA	11965-084	Cell culture
Horse Serum, heat inactivated	Fisher Scientific, MA	26050-070	Cell culture
Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC)	Sigma-Aldrich, MO	P1951	To label cells
Calcein-AM live dead cell Assay kit	Invitrogen, MA	L-3224	Cell viability Assay
Biopsy Hole Punch	Ted Pella, CA	15110-10	Punched hole in PDMS