Une méthode polyvalente de patterning Les protéines et les cellules

Résumé

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Résumé

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

Introduction

Dans l' ingénierie tissulaire et les biocapteurs, la capacité de contrôler l'organisation spatiale des protéines et des cellules sur une échelle de um, est devenue de plus en plus importante au cours des quatre dernières décennies ^{1, 2, 3.} Organisation spatiale précise des protéines et des cellules a permis aux chercheurs d'étudier les interactions entre les cellules et les substrats contenant des types de cellules semblables ou différentes, afin de guider la croissance cellulaire, et pour immobiliser des biomolécules pour la fabrication de biocapteurs ^{4, 5, 6, 7, 8, 9.}

Les méthodes actuelles de protéines de motifs comprennent photopatterning et l'impression par microcontact. Photopatterning utilise un matériau sensible à la lumière qui est réticulée par exposition à ultrun violet (UV). La lumière UV dirigée sur un masque photographique (composé de régions transparentes avec des zones sombres pour empêcher la transmission de la lumière UV) provoque la réticulation dans des régions spécifiques qui peuvent ensuite être utilisées pour la fixation ultérieure des matières biologiques ou des cellules ^{10, 11.} Tandis que ce schéma est très précis et permet un contrôle précis de la topographie de la surface de culture, elle est limitée aux biomolécules sensibles aux UV qui peuvent être modelées par un rayonnement UV ^12. L' impression microcontact est une autre méthode populaire de structuration des protéines spécifiques ^{13, 14.} Dans ce procédé, un siloxane (PDMS) tampon poly-diméthyl est traité avec une variété de réactifs de modification de surface avant d'être trempé dans une solution du substrat choisi biomoléculaire. Il est ensuite doucement pressé sur une lamelle de verre ou une autre surface ainsi "estampage" la biomolécule sur la surface de culture. HoWever, l' estampage est limité au type de matériau qui peut être transféré, ainsi que la mouillabilité de biomolécules à la surface du PDMS timbre ^15.

Structuration directe des cellules peut être plus difficile et repose sur des méthodes complexes tels que des substrats commutables, les méthodes de pochoir sur la base, ou un motif avec des molécules spécifiques d'adhésion cellulaire ^{16, 17.} Ces procédés sont limités dans leur capacité à des cellules de motif en raison de l'absence de substrats d'adhérence cellulaire compatible, l'incompatibilité du processus de travailler avec des cellules sensibles et des contraintes biologiques, des incohérences dans la reproduction du motif et de la complexité de la procédure. Par exemple, avec des substrats commutables, personnalisés substrats doivent être conçus pour chaque type de cellule, pour passer leur adhésion à des types cellulaires spécifiques sans dégradation lors de l' exposition à la lumière UV et la chaleur utilisée dans le processus ^17, < classe sup = "xref"> ^{18, 19, 20.} les méthodes de mise en forme à base de pochoirs sont polyvalents dans leur capacité à cellules de motif; cependant, il est difficile de fabriquer des stencils en PDMS les épaisseurs appropriées pour une utilisation ^{16, 21.} L'injection directe de cellules dans des canaux microfluidiques PDMS ont certains avantages tels que: 1) faciliter dans la fabrication de canaux microfluidiques et 2) aptitude pour de nombreuses cellules et substrats différents. Cependant, la question courante de capture de bulles d'air pendant le processus d'injection en raison de l'hydrophobie de PDMS sans l'utilisation de nettoyage au plasma, ou d' autres méthodes pour réduire les bulles d'air, il est difficile de créer systématiquement des cellules à motifs sur les surfaces en verre ou en plastique ^21.

Ce travail se développe sur capillaire micromoulage ^{22, 23,}lass = "xref"> ^{24, 25, 26} et signale une méthode pour injecter de protéines et de cellules suspensions dans des microcanaux. La méthode utilisée ici démontre la structuration de substrats et à la fois un motif direct et indirect des types cellulaires spécifiques. Cette technique permet de surmonter la forte hydrophobicité du PDMS et élimine la présence de bulles lors de l' injection , soit des substrats ou des cellules en tirant profit de la perméabilité aux gaz de PDMS ^27. Ce document illustre l'utilisation de la technique avec plusieurs substrats différents et des types de cellules. L'article souligne également la fabrication de moules pour la lithographie douce utilisant la photolithographie classique ainsi qu'une méthode simple et adhésif à faible coût bande utile dans des ressources limitées paramètres ^{28, 29.}

Protocole

NOTE: S'il vous plaît consulter toutes les fiches de données de sécurité des matériaux pertinents (MSDS) avant utilisation. Certains des produits chimiques utilisés dans ce protocole sont toxiques et cancérigènes. S'il vous plaît utiliser toutes les pratiques de sécurité appropriées (hottes, glovebox) et l'équipement de protection individuelle (lunettes de sécurité, gants, blouse de laboratoire, pantalons pleine longueur, des chaussures fermées) lors de l'utilisation de matériaux toxiques ou de l'acide / base.

1. Fabrication de maître moules pour la lithographie douce en utilisant la photolithographie

1. Dessinez la disposition des microcanaux en utilisant un outil de dessin de conception assistée par ordinateur (CAO).
2. Imprimer la mise en page sur une plaque de masque blanc en utilisant un masque laser écrivain.
3. Rinçage d'une plaque de silicium de 4 pouces avec de l'acétone suivi par de l'isopropanol et séché avec un pistolet à air d'azote pour s'assurer qu'aucun solvant ne soit laissée sur la plaquette.
4. Déshydrater la plaque par cuisson sur une plaque chauffante à 200 ° C pendant 5 min.
5. Choisir une résine photosensible négative destiné à la hauteur désirée des microcanaux. Fou par exemple, utiliser photorésist négatif SU-8 50 pour obtenir des microcanaux avec une hauteur de 50 um.
6. Laisser la plaquette refroidir à la température ambiante, puis aligner la plaquette sur le mandrin d'une tournette.
7. Distribuer 4 ml (1 ml diamètre / pouce) de la plaque de résine photosensible négative sur le centre de la plaquette.
8. Spin revêtir la plaquette avec un cycle d'essorage en deux étapes en utilisant un spinner. Tout d'abord, appliquer un cycle de propagation de 500 tours par minute avec une accélération de 100 tr / s pendant 10 s. Appliquer ensuite un cycle de rotation de 2000 tours par minute avec une accélération de 300 tours par minute / s ² pendant 30 secondes pour obtenir un revêtement de 50 um de résine photosensible sur une plaquette.
9. cuisson douce la plaquette en deux étapes sur une plaque chaude selon les instructions du fabricant. Pour un revêtement de 50 um de résine photosensible, d'abord pré-cuire la plaquette à 65 ° C pendant 6 min, puis la rampe immédiatement la température de la plaque chaude post-bake la plaquette à 95 ° C pendant 20 min.
10. Laisser la plaquette refroidir à température ambiante, puis charger lewafer sur la scène de la lithographie.
11. Alignez le masque sur la tranche en utilisant un masque d' alignement et d' exposer la plaquette à la lumière UV (selon les instructions du fabricant) à une intensité de 1,5 mW / cm ² pour 146 s pour appliquer la dose totale d'UV de 220 mJ / cm ² requise pour un 50 um d'épaisseur couche de résine photosensible.
12. Appliquer post-cuisson de l'exposition à la tranche en deux étapes sur une plaque chauffante. Pour un revêtement de 50 um de résine photosensible, d'abord pré-cuire la plaquette à 65 ° C pendant 1 min et immédiatement rampe jusqu'à la température de la plaque chaude post-bake il à 95 ° C pendant 5 min.
13. Développer la plaquette en immergeant la plaquette dans SU-8 développeur et en secouant doucement jusqu'à ce que les caractéristiques deviennent claires sur la plaquette. Développer la plaquette pour ~ 6 min pour les 50 um d'épaisseur photoresist.
14. Rincer l'excès développeur avec de l'isopropanol et de l'éthanol, puis sécher la tranche avec un pistolet à air d'azote.
15. Dur cuire au four la plaquette de silicium sur une plaque chaude à 150 ° C pendant 15 min.
16. Placer lela plaquette dans un dessicateur avec 25 uL de l'agent de silanisation tridécafluoro-1,1,2,2-tétrahydrooctyl-1-trichlorosilane.
    NOTE: L'agent de silanisation est corrosif, devrait donc être utilisé dans une hotte acide / base, avec des équipements de protection individuelle (lunettes de sécurité, gants, blouse, pantalon de longueur, fermé orteils chaussures).
17. Appliquer le vide pendant 5 min et exposer la plaquette aux vapeurs de silane pendant 30 minutes sans relâcher le vide.
18. Transférer la tranche dans une boîte de Pétri de taille appropriée.

2. Fabrication de maître moules pour la lithographie douce avec du ruban adhésif

1. Dessinez la disposition des microcanaux en utilisant un outil de dessin CAO et imprimer le dessin sur papier blanc.
2. Nettoyer une lame de verre assez grand pour accueillir la conception avec de l'isopropanol, puis sécher la lame avec un pistolet à air.
3. Attacher du ruban adhésif sur la lame de verre nettoyé. Veillez à ne pas piéger les bulles d'air.
4. Collez les côtés de la glass glisser sur le papier avec la conception, avec la bande vers le haut.
5. Utiliser un scalpel pour couper le ruban sur la lame de verre en utilisant la conception de papier comme une référence, puis décoller la bande dans les zones non désirées de la lame de verre.
6. Rincer la lame de verre avec de l'isopropanol, puis sécher avec un pistolet à air. Cuire la lame de verre dans un four à 65 ° C pendant 30 min.
7. Roulez doucement sur la bande avec un rouleau en caoutchouc pour éliminer les bulles d'air et permettre à la diapositive à refroidir à la température ambiante.

3. lithographie douce Fabrication des dispositifs PDMS

1. Mélanger PDMS élastomère et son agent de durcissement dans un rapport de 10: 1 (p: p), agiter vigoureusement le mélange, puis dégazer le mélange en le plaçant dans une chambre à vide jusqu'à ce qu'aucune bulle d'air apparaissent dans le mélange.
2. Verser le mélange sur un moule de silicium silanisé ou moule de ruban adhésif dans une boîte de Pétri pour obtenir un ~ 2 mm d'épaisseur de couche de PDMS et dégazer jusqu'à ce que tout l'air des bulles disparaissent.
3. Cure les PDMS dans un fourà 65 ° C pendant 2 h.
4. Utilisez un scalpel pour couper la couche PDMS au moins 5 mm des caractéristiques puis peler les PDMS durcis hors du moule en utilisant pincette.
5. Poinçonner un trou d' entrée avec un poinçon de 1 mm biopsie n'importe où sur le micro - canal, de préférence à l'extrémité d'un réseau de micro - canaux comme on le voit sur la figure 2a et 4b.
6. Nettoyez les PDMS exprimés avec du ruban adhésif pour éliminer les particules de poussière adsorbées sur le dispositif. Stériliser le dispositif à microcanaux PDMS (PDMS coulée) par un rinçage avec une solution d'éthanol à 70% suivie d'une déminéralisée stérile (DI), et d'exposer aux rayons UV pendant 30 min.
7. Gardez le dispositif de PDMS stérile dans une boîte de Pétri stérile jusqu'à utilisation.

4. Substrat Patterning

1. Placez les PDMS stériles exprimés en utilisant des pinces sur une lamelle de verre stérile ou boîte de Pétri et appliquer une légère pression à l'aide de la pointe de la pince à épiler.
   NOTE: Le casting de PDMS fait un conformationnelle mais joint réversible avec le gllamelle de cul ou de boîte de Pétri formant des microcanaux sans utilisation de tout adhésif.
2. Placer une goutte (20 - 40 pi) de la solution de substrat à l'entrée recouvrant complètement l'orifice d'entrée. Motif poly-D-lysine (PDL) en plaçant une goutte de 20 pi de PDL dans un tampon de tetraborate de sodium à l'entrée des microcanaux.
3. Mettez la boîte de Pétri dans un vide de ~ 254 mmHgA (équivalent à la maison vide dans les laboratoires biologiques) pendant 10 min, et observer l'air sortant du canal sous la forme de bulles.
4. Libérer le vide et à observer la solution de substrat circulant dans le microcanal.
5. Incuber le plat dans les conditions appropriées pour le substrat adhérence. Voir les tableaux 1 et 2 pour des conditions d'incubation (ceux - ci varient en fonction du substrat). Pour PDL patterning, incuber pendant 1 h à 37 ° C.
6. Décollez délicatement le timbre PDMS en utilisant des pinces stériles et laver le motif sur lamelle de verre trois fois avec de l'eau DI.
7. Ajouter 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) à une solution à la boîte de Petri pour couvrir la cuvette ou de la lamelle couvre-objet en verre et on incube pendant une nuit à 37 ° C.
   NOTE: Cela permettra de réduire l'adhérence non spécifique dans les régions non revêtues.
8. Aspirer la solution de BSA à 1%, et le substrat à motifs est maintenant prêt à utiliser.

5. Modélisation indirecte des cellules

1. Préparer la suspension cellulaire dans un milieu de culture sans sérum. Le type de cellule et la densité cellulaire sont énumérées dans le tableau 1.
2. Ajouter la suspension cellulaire à la boîte de Pétri à motifs et submerger complètement la région à motifs en suspension cellulaire.
3. Incuber la boîte de Pétri à 37 ° C dans un incubateur pendant 15 minutes pour permettre aux cellules de se fixer sur le substrat à motifs.
4. Aspirer la suspension cellulaire en excès de la boîte de Pétri et laver les cellules à motifs à trois reprises avec un tampon phosphate salin (PBS) en agitant doucement pendant 10 s pour éliminer les cellules seules.
5. Ajouter l'unppropriate milieu de culture pour les cultures de cellules modelées et incuber les cellules modelés à 37 ° C dans un incubateur à _CO2.

6. La structuration directe des cellules

Remarque: cette technique est une alternative à la formation de motifs de cellule indirecte décrite à l'étape 5. Cependant, contrairement à l'étape 5, dans cette technique, les cellules sont modelés sur des surfaces de culture de tissu avec ou sans revêtement de substrat.

1. Stériliser le dispositif microfluidique par rinçage avec une solution de 70% d'éthanol puis de l'eau déminéralisée.
2. Faire tremper l'appareil pendant une nuit dans une solution de 1% de BSA pour empêcher l'adhérence des cellules au PDMS.
3. Sécher le dispositif à la température ambiante et l'attacher au fond de la boîte de Pétri de culture de tissu traité.
4. Préparer la suspension de cellules dans un milieu de culture sans sérum. Le type de cellule et la densité cellulaire sont répertoriés dans le tableau 2.
5. Placez une goutte (4-8 pi) de la suspension cellulaire, assez pour remplir lamicrocanaux, à l'entrée recouvrant complètement l'orifice d'entrée.
6. Mettez la boîte de Pétri dans un vide pendant 10 min et observer l'air sortant du canal sous la forme de bulles. Relâchez le vide et observer la suspension de cellules circulant dans le microcanal.
7. Incuber la boîte de Petri dans un incubateur pour favoriser l' adhésion cellulaire selon les conditions d'incubation ( en fonction du type de cellule à motifs) mentionnés dans le tableau 2. Ajouter PBS à la boîte de Pétri submergeant le dispositif PDMS.
8. Peler le PDMS avec précaution la boîte de Pétri avec des pincettes et laver le modèle avec du PBS. Ajouter un milieu de culture cellulaire pour la boîte de Petri et placer la culture de cellules dans l'incubateur.

Résultats

Cette méthode permet la structuration des protéines et des motifs indirecte des cellules en utilisant des impasses canaux microfluidiques avec des dimensions aussi petites que 10 um et de l'équipement disponible dans presque tous les laboratoires biologiques une fois que le moule maître est faite. Cette technique peut être utilisée avec des canaux microfluidiques PDMS créés en utilisant la photolithographie traditionnelle douce, ou avec des canaux microfluidiques PDMS créés...

Discussion

Alors que la photolithographie classique est une technique bien établie pour la création de moules pour la lithographie douce, l'équipement, les matériaux et les compétences nécessaires pour utiliser la photolithographie classique ne sont pas facilement disponibles pour la plupart des laboratoires. Pour les laboratoires sans accès à ces ressources, nous avons présenté un ruban adhésif de fabrication comme une méthode de création de moules avec des caractéristiques relativement simples pour les disposit...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools	Corel Corporation, Canada	X4 Version 14.0.0.701	CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device
Laser Printer HP	Hewlett Packard, CA	1739629	Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique
Bel-Art Dessicator	Fisher Scientific, MA	08-594-16B	Used to degass the PDMS mixture
Adhesive Scotch Tape	3M Product, MN	Tape 600	Used to fabricate adhesive tape Master
PDMS Sylgard 184	Dow Corning, MI	1064291	Casting polymer
Petri Dish	Fisher Scientific, MA	08-772-23	Used to keep the mold to cast with PDMS
Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11)	Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan	2976#11	Used to cut the PDMS
Tweezers	Ted Pella, CA	5627-07	Used to handle the PDMS cast during peeling
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-546-2	Used as surface to pattern the Substrate
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-544-4	Used as surface to pattern the Substrate
Rubber Roller	Dick Blick Art Materials, IL	40104-1004	Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles
Laser Mask Writer	Heidelberg Instruments, Germany	DWL66fs	Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process
EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool)	EV Group, Germany	EVG 620T(B)	Used to expose the photoresist to UV light
Spin Coater Headway	Headway Research Inc, TX	PWM32-PS-CB15PL	Used to spin coat the photoresist on silicon wafer
Photoresists SU-8 50	MicroChem, MA	Y131269	Negative photoresist used for mold fabrication
SU-8 Devloper	MicroChem, MA	Y020100	Photoresist developer
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane	UCT Specialties, PA	T2492-KG	Coat mold to avoid PDMS adhesion
Isopropanol	Sigma-Aldrich, MO	190764	Cleaning Solvent
Ethanol	Sigma-Aldrich, MO	24102	Sterilization Solvent
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich, MO	P0899-10MG	PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer
Laminin	Sigma-Aldrich, MO	L2020	Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use
BSA	Fisher Scientific, MA	BP1605100	Cell culture
C2C12 Myoblast cell lline	ATCC, VA	CRL-1722	Used to demonstrate C2C12 patterning
PC12 Cell Line	ATCC, VA	CRL-1721	Used to demonstrate PC12 patterning
Collagen type 1, rat tail	BD Biosciences	40236	Cell culture
DMEM	GIBCO, MA	11965-084	Cell culture
Horse Serum, heat inactivated	Fisher Scientific, MA	26050-070	Cell culture
Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC)	Sigma-Aldrich, MO	P1951	To label cells
Calcein-AM live dead cell Assay kit	Invitrogen, MA	L-3224	Cell viability Assay
Biopsy Hole Punch	Ted Pella, CA	15110-10	Punched hole in PDMS