Eine vielseitige Methode von Patterning Proteinen und Zellen

Zusammenfassung

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Zusammenfassung

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

Einleitung

In Tissue Engineering und der Biosensorik, die Fähigkeit , die räumliche Organisation von Proteinen und Zellen auf einer Skala um zu kontrollieren, hat sich in den letzten vier Jahrzehnten zunehmend an Bedeutung ^{1, 2, 3.} Genaue räumliche Organisation von Proteinen und Zellen hat Forscher erlaubt die Wechselwirkung zwischen Zellen und Substrate mit ähnlichen oder verschiedenen Arten von Zellen zu untersuchen, das Zellwachstum zu führen, und Biomolekülen zur Herstellung von Biosensoren , ^{4, 5, 6, 7, 8,} zu immobilisieren ^9.

Aktuelle Methoden der Muster Proteine ​​schließen Photopatterning und Mikrokontaktdruck. Photopatterning nutzt lichtempfindliche Material, das bei Bestrahlung mit ultr vernetzteine violette (UV) Licht. UV - Licht bei einer Photomaske ( die aus transparenten Bereichen mit dunkleren Bereichen UV Lichtdurchlässigkeit zu verhindern) gerichtet verursacht in bestimmten Regionen Vernetzungs die dann ¹⁰ für die nachfolgende Befestigung von Biomaterialien oder Zellen verwendet werden ^{können, 11.} Während dieses System sehr genau ist und ermöglicht eine präzise Steuerung der Topographie der Kulturoberfläche, ist es gegenüber UV-empfindlichen Biomolekülen begrenzt , die durch UV - Strahlung ¹² gemustert werden kann. Mikrokontakt- Drucken ist eine weitere beliebte Methode zur Strukturierung spezifischer Proteine ^{13, 14.} In diesem Verfahren wird ein poly-dimethylsiloxan (PDMS) Tempel ist mit einer Vielzahl von Oberflächenmodifikationsreagenzien behandelt, bevor sie in einer Lösung des gewählten biomolekularen Substrat getränkt wird. Es wird dann auf einem Deckglas oder einer anderen Oberfläche so "Stanzen" des Biomoleküls auf die Kulturoberfläche schonend gepresst. However wird Prägen auf die Art des Materials begrenzt , die ebenso wie die Benetzbarkeit von Biomolekülen an der Oberfläche übertragen werden kann , die von PDMS ¹⁵ stempeln.

Direkte Strukturierung von Zellen kann schwieriger sein , und stützt sich auf komplexe Verfahren wie schaltbare Substrate, stencil basierte Verfahren oder Strukturieren mit spezifischen Zelladhäsionsmoleküle ^{16, 17.} Diese Verfahren sind begrenzt in ihrer Fähigkeit zur Musterzellen aufgrund des Fehlens von kompatiblen Zelladhäsion Substraten Inkompatibilität des Verfahrens mit empfindlichen biologischen Zellen und Randbedingungen zu arbeiten, Inkonsistenz in der Strukturierungs Wiedergabe- und Komplexität des Verfahrens. Beispielsweise bei schaltbaren Substrate, müssen individuelle Substrate für jeden Zelltyp gestaltet werden, deren Einhaltung bestimmter Zelltypen ohne Abbau bei Einwirkung von UV - Licht und Wärme in Prozess ¹⁷ verwendet , um ^Schalter, < sup class = "xref"> ^{18, 19, 20.} Stencil Basis Strukturierungsverfahren sind vielseitig in ihrer Fähigkeit zur Musterzellen; jedoch ist es schwierig , PDMS Schablonen an den entsprechenden Dicken ^{16, 21} Verwendung herzustellen. Direkte Injektion von Zellen in PDMS mikrofluidischen Kanälen haben einige Vorteile wie: 1) erleichtern bei der Herstellung von mikrofluidischen Kanälen und 2) Eignung für viele verschiedene Zellen und Substraten. Das vorherrschende Problem der Luftblasenerfassung während des Injektionsvorgangs aufgrund der Hydrophobizität von PDMS ohne die Verwendung von Plasma - Reinigung oder andere Verfahren jedoch Luftblasen zu verringern, macht es schwierig , Oberflächen ²¹ konsequent gemusterten Zellen auf Glas- oder Kunststoff erstellen.

Diese Arbeit baut auf Kapillar - Mikroform ^{22, 23,}lass = "Xref"> ^{24, 25, 26} und berichtet ein Verfahren Protein- und Zellsuspensionen in Mikrokanäle einzuspritzen. Das hier verwendete Verfahren zeigt die Strukturierung von Substraten und sowohl direkte als auch indirekte Strukturierung von spezifischen Zelltypen. Diese Technik überwindet die hohe Hydrophobizität von PDMS und eliminiert das Vorhandensein von Blasen während der Injektion von entweder Substrate oder Zellen durch Ausnutzung der Gasdurchlässigkeit von PDMS ²⁷ nehmen. Dieses Papier zeigt die Verwendung der Technik mit verschiedenen Substraten und Zelltypen. Der Artikel zeigt auch die Herstellung von Formen für Weich - Lithographie herkömmliche Photolithographie sowie eine einfache und kostengünstige Klebeband Verfahren nützlich in ressourcenbeschränkten Einstellungen ^{28, 29} verwendet wird .

Protokoll

HINWEIS: Bitte wenden Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Einige der Chemikalien in diesem Protokoll verwendet werden, sind giftig und krebserregend. Bitte verwenden Sie alle geeigneten Sicherheitspraktiken (Dunstabzug, Glovebox) und persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen, geschlossene Schuhe), wenn giftige oder Säure / Base-Materialien.

1. Herstellung von Urformen für Soft Lithography mit Lithografie

1. Zeichnen Sie das Layout der Mikrokanal ein Computer-Aided Design (CAD) Zeichenwerkzeug verwenden.
2. Drucken Sie das Layout auf einer leeren Maskenplatte mit Lasermaskenschreiber.
3. Spülen einen 4 Zoll Silicium-Wafer mit Aceton, gefolgt von Isopropanol und trockenem Stickstoff mit einem Luftgebläse, um sicherzustellen, daß kein Lösungsmittel auf dem Wafer verbleibt.
4. Dehydratisieren des Wafers, indem es auf einer Heizplatte bei 200 ° C für 5 min Einbrennen.
5. Wählen eines negativen Photoresist für die gewünschte Höhe der Mikrokanäle gestaltet. Foder verwenden beispielsweise negativer Photoresist SU-8 50 Mikro von 50 & mgr; m mit einer Höhe zu erhalten.
6. Erlauben der Wafer auf Raumtemperatur abkühlen, und dann Ausrichten der Wafer auf dem Spannfutter einer Schleuderbeschichtungsvorrichtung.
7. Dispense 4 ml (1 ml / inch Durchmesser des Wafers) negativer Photoresist auf die Mitte des Wafers.
8. Schleuderbeschichten des Wafers mit einem zweistufigen Schleudergang unter Verwendung eines Spinners. Zuerst wird ein Spread-Zyklus von 500 UpM mit einer Beschleunigung von 100 Upm / s für 10 s anwenden. Danach ist eine Schleuderzyklus von 2000 UpM mit einer Beschleunigung von 300 Upm / s ² 30 s 50 & mgr; m Beschichtung aus Photoresist auf einem Wafer zu erhalten.
9. Soft bake der Wafer in zwei Schritten auf einer heißen Platte gemäß den Anweisungen des Herstellers. Für eine 50 & mgr; m Beschichtung aus Photoresist, erste Pre-Bake-Wafer bei 65 ° C für 6 min und dann sofort die Heizplattentemperatur Rampe bis zu post-bake dem Wafer bei 95 ° C für 20 min.
10. Erlauben der Wafer auf Raumtemperatur abkühlen und dann laden dieWafer auf dem Lithographiestufe.
11. Richten Sie die Maske auf dem Wafer Mask Aligner mit und um den Wafer mit UV - Licht ausgesetzt werden (gemäß den Anweisungen des Herstellers) bei einer Intensität von 1,5 mW / cm ² für 146 s die gesamte UV - Dosis von 220 mJ / cm ² erforderlich für eine anzuwenden 50 & mgr; m dicke Schicht aus Photolack.
12. Bewerben Einbrennen nach der Belichtung auf den Wafer in zwei Schritten auf einer heißen Platte. Für eine 50-um-Beschichtung aus Photoresist, erste Pre-Bake-Wafer bei 65 ° C für 1 min und sofort die Heizplattentemperatur Rampe bis zu post-bake es bei 95 ° C für 5 min.
13. Entwickeln des Wafers durch Eintauchen des Wafers in SU-8-Entwickler in und sanft schütteln, bis die Merkmale auf dem Wafer deutlich werden. Entwickeln des Wafers für ~ 6 min für die 50 & mgr; m dicken Photoresist.
14. Spülen Sie überschüssige Entwickler mit Isopropanol und Ethanol, dann trocknen die Wafer mit einem Stickstoffluftpistole.
15. Hartbacken des Silizium-Wafers auf einer Heizplatte bei 150 ° C für 15 min.
16. Setze dasWafer in einem Exsikkator mit 25 & mgr; l des Silanisierungsmittel Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-Trichlorsilan.
    HINWEIS: Das Silanisierungsmittel ist ätzend, also in einer Säure / Base-Abzugshaube verwendet werden soll, geeignete persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen, geschlossene Schuhe).
17. Setzen Sie das Vakuum für 5 Minuten und setzen den Wafer zu den Dämpfen von Silan für 30 Minuten, ohne das Vakuum freigibt.
18. Übertragen Sie die Wafer in eine ausreichend große, Petrischale.

2. Herstellung von Urformen für Soft Lithography mit Klebeband

1. Zeichnen Sie das Layout der Mikrokanal eine CAD-Zeichnung Werkzeug und die Zeichnung auf weißem Papier gedruckt.
2. Reinigen Sie einen Objektträger aus Glas groß genug, um das Design mit Isopropanol aufzunehmen und dann trocknen Sie die Folie mit einer Luftpistole.
3. Befestigen Klebeband auf die gereinigte Glasobjektträger. Achten Sie darauf, keine Luftblasen zu stoppen.
4. Kleben Sie die Seiten des glass gleiten auf das Papier mit dem Design, mit der Bandseite nach oben.
5. Verwenden Sie ein Skalpell, das Band auf dem Glasträger zu schneiden Sie das Papier Design als Referenz verwendet und dann abziehen Band von unerwünschten Bereichen der Glasträger.
6. Spülen Sie die Glasobjektträger mit Isopropanol und dann trocken mit einer Luftpistole. Backen Sie die Objektträger aus Glas in einem Ofen bei 65 ° C für 30 min.
7. rollen sanft über das Band mit einer Gummiwalze von Luftblasen und damit die Folie auf Raumtemperatur abkühlen zu entfernen.

3. Weiche Lithography Die Herstellung der PDMS-Geräte

1. Mischungs PDMS-Elastomer und dessen Härtungsmittel in einem Verhältnis von 10: 1 (w: w), rühre die Mischung kräftig und dann entgast die Mischung, indem sie in einer Vakuumkammer platziert, bis keine Luftblasen in der Mischung auftreten.
2. Gießen Sie die Mischung auf eine silanisierte Silikonform oder Klebeband Form in einer Petrischale ein ~ 2 mm dicke Schicht aus PDMS und Entgasen, bis alle Luftblasen verschwinden zu erhalten.
3. Cure die PDMS in einem Ofenbei 65 ° C für 2 h.
4. Verwenden Sie ein Skalpell die PDMS-Schicht zu schneiden mindestens 5 mm entfernt von den Eigenschaften und dann schälen die gehärteten PDMS aus der Form unter Verwendung von tweezer.
5. Stanzen eine einzelne Einlassöffnung mit einer 1 mm - Biopsie überall auf dem Mikrokanal stanzen, vorzugsweise am Ende eines Netzes von Mikrokanälen , wie in 2a zu sehen und 4b.
6. Reinigen Sie die mit Klebeband gegossen PDMS zu Staubpartikel zu entfernen auf das Gerät adsorbiert. Sterilisieren Sie die PDMS-Mikrokanal-Gerät (PDMS gegossen) mit einer Lösung von 70% Ethanol, gefolgt von sterilem deionisiertem (DI) Wasser gespült wird, und setzen für 30 min mit UV.
7. Halten Sie die sterile PDMS-Gerät in eine sterile Petrischale bis zur Verwendung.

4. Substrat Patterning

1. Legen Sie die sterile PDMS gegossen Pinzette auf eine sterile Deckglas oder Petrischale mit und anwenden sanften Druck mit der Spitze der Pinzette.
   HINWEIS: Die PDMS Guss macht eine konforme, aber reversible Dichtung mit dem glass Deckglas oder Petrischale Mikro ohne Verwendung eines Klebstoffs zu bilden.
2. Setzen Sie einen Tropfen (20 bis 40 & mgr; l) der Substratlösung auf dem Einlass vollständig die Einlassöffnung abdeckt. Muster Poly-D-Lysine (PDL), indem ein 20 & mgr; l Tröpfchen der PDL in Natriumtetraboratpuffer auf den Einlass der Mikrokanäle platzieren.
3. Legen Sie die Petrischale in einem Vakuum von ~ 254 mmHgA (entspricht Vakuum in biologischen Laboratorien zu Haus) für 10 min, und beobachten Sie die Luft aus dem Kanal in Form von Blasen kommen.
4. Lassen Sie die Vakuum und beobachten Sie die Substratlösung in den Mikrokanal fließt.
5. Inkubieren Sie die Schale an den geeigneten Bedingungen für die Substrathaftung. Siehe Tabellen 1 und 2 für Inkubationsbedingungen (diese auf dem Substrat variieren). Für PDL Strukturierung bei 37 ° C für 1 h inkubiert.
6. abblättern vorsichtig die PDMS-Stempel sterile Pinzette und waschen Sie das Muster auf Deckglas dreimal mit VE-Wasser.
7. Fügen Sie eine 1% Rinderserumalbumin (BSA) -Lösung in die Petrischale die Schale oder das Deckglas zu bedecken und über Nacht bei 37 ° C inkubiert.
   HINWEIS: Dies reduziert unspezifische Haftung in unbeschichteten Regionen.
8. Absaugen der 1% BSA-Lösung und dem strukturierten Substrat ist nun einsatzbereit.

5. Indirekte Patterning von Zellen

1. Vorbereitung der Zellsuspension in einem serumfreien Kulturmedium. Der Zelltyp und der Zelldichte sind in Tabelle 1 aufgeführt.
2. Fügen Sie die Zellsuspension auf das strukturierte Petrischale und vollständig versenken die strukturierte Region in Zellsuspension.
3. Inkubieren der Petrischale bei 37 ° C in einem Inkubator für 15 min Zellen zu ermöglichen, um das strukturierte Substrat zu befestigen.
4. Aspirieren die überschüssige Zellsuspension aus der Petrischale und wasche die gemusterte Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) unter leichtem Schütteln für 10 s ungebundene Zellen zu entfernen.
5. Fügen Sie die appropriate Kulturmedium auf die strukturierte Zellkulturen und inkubiere die gemusterte Zellen bei 37 ° C in einem CO ₂ -Inkubator.

6. Direct Patterning von Zellen

ANMERKUNG: Diese Technik ist eine Alternative zu der indirekten Zelle Strukturieren in Schritt 5 beschrieben jedoch, anders als in Schritt 5 in dieser Technik Zellen werden strukturiert auf Gewebekulturoberflächen mit oder ohne Substratbeschichtung.

1. Sterilisieren der mikrofluidischen Vorrichtung, indem sie mit einer Lösung von 70% Ethanol mit DI-Wasser gespült wurde.
2. Tränken das Gerät über Nacht in einer Lösung von 1% BSA, die Zelladhäsion zu den PDMS zu verhindern.
3. Trocknen Sie die Vorrichtung bei Raumtemperatur und befestigen es an der Unterseite der Gewebekultur-behandelte Petrischale.
4. Vorbereitung der Zellsuspension in serumfreien Kulturmedien. Der Zelltyp und der Zelldichte sind in Tabelle 2 aufgeführt.
5. Legen Sie ein Tröpfchen (4 - 8 ul) der Zellsuspension, genug, um zu füllen dieMikrokanäle, vollständig auf den Einlass für den Einlassloch.
6. Legen Sie die Petrischale in einem Vakuum für 10 min und beobachten Luft aus dem Kanal in Form von Blasen kommen. Lassen Sie die Vakuum und beobachten Sie die Zellsuspension in den Mikrokanal fließt.
7. Die Petrischale in einem Inkubator inkubieren Zelladhäsion gemäß den Inkubationsbedingungen (abhängig von der Art der Zelle strukturiert) in Tabelle 2 erwähnt zu fördern. In PBS in die Petrischale Untertauchen des PDMS-Gerät.
8. Ziehen Sie die PDMS vorsichtig von der Petrischale mit einer Pinzette und waschen Sie das Muster mit PBS. In Zellkulturmedien zu der Petrischale und legen Sie die Zellkultur in den Inkubator.

Ergebnisse

Dieses Verfahren erlaubt die Strukturierung von Proteinen und indirekte Strukturierung von Zellen Sackgassen mikrofluidischen Kanäle mit Abmessungen so klein wie 10 & mgr; m und Anlagen in fast allen biologischen Laboratorien verwendet, sobald der Masterform hergestellt. Diese Technik kann mit PDMS mikrofluidischen Kanälen verwendet werden , unter Verwendung von herkömmlichen Weich photolithographischen erstellt oder mit PDMS mikrofluidischen Kanälen mit Klebeband Herstellungs er...

Diskussion

Während herkömmliche Photolithographie eine gut etablierte Technik für die Herstellung von Formen für Weich-Lithographie ist, die Ausrüstung, Materialien und Fähigkeiten erforderlich sind herkömmliche Photolithographie zu verwenden, nicht ohne weiteres auf den meisten Labors zur Verfügung. Für Laboratorien, ohne Zugang zu diesen Ressourcen haben wir Klebebandherstellung als Methode der dargestellten Formen mit relativ einfachen Funktionen für mikrofluidische Vorrichtungen zu schaffen. Diese Methode ermöglicht...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools	Corel Corporation, Canada	X4 Version 14.0.0.701	CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device
Laser Printer HP	Hewlett Packard, CA	1739629	Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique
Bel-Art Dessicator	Fisher Scientific, MA	08-594-16B	Used to degass the PDMS mixture
Adhesive Scotch Tape	3M Product, MN	Tape 600	Used to fabricate adhesive tape Master
PDMS Sylgard 184	Dow Corning, MI	1064291	Casting polymer
Petri Dish	Fisher Scientific, MA	08-772-23	Used to keep the mold to cast with PDMS
Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11)	Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan	2976#11	Used to cut the PDMS
Tweezers	Ted Pella, CA	5627-07	Used to handle the PDMS cast during peeling
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-546-2	Used as surface to pattern the Substrate
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-544-4	Used as surface to pattern the Substrate
Rubber Roller	Dick Blick Art Materials, IL	40104-1004	Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles
Laser Mask Writer	Heidelberg Instruments, Germany	DWL66fs	Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process
EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool)	EV Group, Germany	EVG 620T(B)	Used to expose the photoresist to UV light
Spin Coater Headway	Headway Research Inc, TX	PWM32-PS-CB15PL	Used to spin coat the photoresist on silicon wafer
Photoresists SU-8 50	MicroChem, MA	Y131269	Negative photoresist used for mold fabrication
SU-8 Devloper	MicroChem, MA	Y020100	Photoresist developer
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane	UCT Specialties, PA	T2492-KG	Coat mold to avoid PDMS adhesion
Isopropanol	Sigma-Aldrich, MO	190764	Cleaning Solvent
Ethanol	Sigma-Aldrich, MO	24102	Sterilization Solvent
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich, MO	P0899-10MG	PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer
Laminin	Sigma-Aldrich, MO	L2020	Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use
BSA	Fisher Scientific, MA	BP1605100	Cell culture
C2C12 Myoblast cell lline	ATCC, VA	CRL-1722	Used to demonstrate C2C12 patterning
PC12 Cell Line	ATCC, VA	CRL-1721	Used to demonstrate PC12 patterning
Collagen type 1, rat tail	BD Biosciences	40236	Cell culture
DMEM	GIBCO, MA	11965-084	Cell culture
Horse Serum, heat inactivated	Fisher Scientific, MA	26050-070	Cell culture
Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC)	Sigma-Aldrich, MO	P1951	To label cells
Calcein-AM live dead cell Assay kit	Invitrogen, MA	L-3224	Cell viability Assay
Biopsy Hole Punch	Ted Pella, CA	15110-10	Punched hole in PDMS