Um método versátil de padronização proteínas e células

Resumo

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Resumo

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

Introdução

Em engenharia de tecidos e biosensing, a capacidade de controlar a organização espacial de proteínas e células em uma escala um, tornou-se cada vez mais importante ao longo das últimas quatro décadas ^{1, 2, 3.} Organização espacial precisa de proteínas e células tem permitido aos pesquisadores examinar a interação entre as células e os substratos que contêm tipos semelhantes ou diferentes de células, para orientar o crescimento celular, e para imobilizar biomoléculas para a fabricação de biossensores ^{4, 5, 6, 7, 8, 9.}

Os métodos atuais de proteínas padronização incluem photopatterning e impressão microcontact. Photopatterning utiliza material sensível à luz que é reticulado por exposição a ultruma violeta (UV). Luz UV dirigida a uma fotomáscara (consistindo em áreas transparentes com regiões mais escuras para evitar a transmissão de luz UV) provoca reticulação em regiões específicas que podem então ser utilizados para a subsequente ligação de biomateriais ou células ^{10, 11.} Embora este esquema é muito preciso e permite o controle preciso da topografia da superfície da cultura, é limitada a biomoléculas sensíveis aos raios UV, que pode ser modelado por radiação UV ^12. Impressão microcontact é outro método popular de padronização proteínas específicas ^{13, 14.} Neste método, um siloxano (PDMS) selo poli-dimetil é tratada com uma variedade de reagentes de modificação da superfície antes de ser embebido numa solução de substrato escolhido biomolecular. Em seguida, é suavemente pressionado para uma lamela de vidro ou outra superfície assim "estampagem" a biomolécula sobre a superfície da cultura. HoWever, estampagem se limita ao tipo de material que pode ser transferido assim como a molhabilidade de biomoléculas à superfície do PDMS selo ^15.

Padronização directa de células pode ser mais difícil e baseia-se em métodos de complexos, tais como substratos comutáveis, métodos com base estêncil, ou modelação com moléculas de adesão celular específicos ^{16, 17.} Estes métodos estão limitados na sua capacidade de células de teste padrão, devido à falta de substratos de adesão celular compatíveis, a incompatibilidade do processo para o trabalho com células sensíveis biológicos e constrangimentos, inconsistência em reproduzir o padrão e a complexidade do processo. Por exemplo, substratos com comutáveis, substratos mercadorias necessitam de ser concebido para cada tipo de célula, para mudar a sua adesão a tipos específicos de células, sem a degradação por exposição à luz UV e calor usado no processo ^17, < classe sup = "xref"> ^{18, 19, 20.} Estêncil métodos de padronização com base são versáteis em sua capacidade de células padrão; No entanto, é difícil fabricar matrizes PDMS nas espessuras adequadas para utilização ^{16, 21.} injeção direta de células em canais microfluídicos PDMS tem algumas vantagens, tais como: 1) facilidade na fabricação de canais microfluídicos e 2) adequação para muitas células e diferentes substratos. No entanto, o problema predominante de captura de bolhas de ar durante o processo de injecção devido à hidrofobicidade dos PDMS sem o uso de limpeza de plasma, ou outros métodos para diminuir as bolhas de ar, faz com que seja difícil criar consistentemente células modelado sobre superfícies de vidro ou de plástico ^21.

Este trabalho expande micromolding capilar ^{22, 23,}lass = "refex"> ^{24, 25, 26} e relata um método para injectar suspensões de células de proteína e em microcanais. O método utilizado aqui demonstra a padronização de substratos e ambos padronização direta e indireta de tipos específicos de células. Esta técnica ultrapassa a elevada hidrofobicidade de PDMS e elimina a presença de bolhas durante a injecção quer de substratos ou células, tirando proveito da permeabilidade aos gases de PDMS ^27. Este documento revela a utilização da técnica com vários substratos diferentes e tipos de células. O artigo também destaca a fabricação de moldes para litografia macia usando fotolitografia convencional, bem como um método simples e adesivo de baixo custo tape útil em recursos configurações limitadas ^{28, 29.}

Protocolo

NOTA: Por favor, consulte todas as folhas de dados de segurança pertinentes (MSDS) antes do uso. Alguns dos produtos químicos utilizados no presente protocolo são tóxicos e cancerígenos. Por favor, use todas as práticas de segurança adequadas (extractor de fumo, porta-luvas) e equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça de corpo inteiro, sapatos fechados) ao utilizar materiais tóxicos ou ácido / base.

1. Fabricação de Mestre Moldes para macio Litografia usando fotolitografia

1. Desenhar o layout dos microcanais, utilizando uma ferramenta de desenho assistido por computador (CAD).
2. Imprimir o layout em uma placa de máscara em branco usando escritor máscara laser.
3. Lavar uma bolacha de silício de 4 polegadas com acetona seguido de isopropanol e seco com uma pistola de ar de azoto para assegurar que não solvente é deixado sobre a bolacha.
4. Desidratar a bolacha cozendo-o sobre uma placa quente a 200 ° C durante 5 min.
5. Selecione um fotorresiste negativo projetado para a altura desejada dos microcanais. Fou exemplo, usar fotorresistente negativo SU-8 50 para obter microcanais com uma altura de 50 mm.
6. Permitir que a bolacha se arrefecer até à temperatura ambiente, e depois alinhar a bolacha sobre o mandril de uma máquina de revestimento de centrifugação.
7. Dispensar 4 mL (um diâmetro / polegada mL da bolacha) de material fotosensitivo negativo para o centro da bolacha.
8. Girar revestir o wafer com um ciclo de centrifugação de duas etapas usando um spinner. Em primeiro lugar, aplicam-se um ciclo de propagação de 500 rpm, com uma aceleração de 100 rotações / s para 10 s. Em seguida, aplicar um ciclo de centrifugação de 2000 rpm, com uma aceleração de 300 rotações / s para 30 s ² para se obter um revestimento de 50 um de material fotosensitivo sobre uma bolacha.
9. coza macia do wafer em duas etapas em uma placa quente de acordo com as instruções do fabricante. Para um revestimento de 50 um de foto-resistente, em primeiro lugar pré-cozem a bolacha a 65 ° C durante 6 minutos e depois rampa imediatamente acima da temperatura da placa quente para o pós-coza a bolacha a 95 ° C durante 20 min.
10. Permitir que a bolacha se arrefecer até à temperatura ambiente e, em seguida, carregar owafer para o palco litografia.
11. Alinhar a máscara sobre a bolacha usando alinhador máscara e expõe a bolacha à luz UV (de acordo com as instruções do fabricante), a uma intensidade de 1,5 mW / ^cm2 durante 146 s de aplicar a dose total de UV de 220 mJ / cm ² necessária para uma 50 um espessa camada de fotorresiste.
12. Aplicar coza pós exposição ao wafer em duas etapas em uma placa quente. Para um revestimento de 50 mícrons de material fotosensitivo, primeiro pré-cozem a bolacha a 65 ° C durante 1 min e imediatamente rampa até a temperatura da placa quente para o pós-asse a 95 ° C durante 5 min.
13. Desenvolver o wafer em submergindo a bolacha em SU-8 desenvolvedor e agitando até que os recursos tornam-se claras sobre o wafer. Desenvolver o wafer de ~ 6 min para o fotorresiste de espessura 50 mm.
14. Lavar o excesso de desenvolvedor com isopropanol e etanol, em seguida, secar o wafer com uma pistola de ar de azoto.
15. Disco cozer a bolacha de silício sobre uma placa quente a 150 ° C durante 15 min.
16. Coloque obolacha num exsicador com 25 uL do agente de silanização tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-triclorossilano.
    NOTA: O agente de silanização é corrosivo, portanto, deve ser usado em um exaustor de ácido / base, com equipamento adequado de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça de corpo inteiro, fechou-toe sapatos).
17. Aplicar vácuo durante 5 minutos e expor a bolacha aos vapores de silano durante 30 min sem libertar o vácuo.
18. Transferir a bolacha em um prato de Petri de tamanho adequado.

2. Fabricação de Mestre Moldes para macio Litografia com fita adesiva

1. Desenhar o layout dos microcanais, utilizando uma ferramenta de desenho CAD e imprimir o desenho em papel branco.
2. Limpar uma lâmina de vidro grande o suficiente para acomodar o projeto com isopropanol e depois secar o slide com uma pistola de ar.
3. Anexar fita adesiva sobre a lâmina de vidro limpa. Seja não tomar cuidado para prender as bolhas de ar.
4. Tape os lados do GLAss deslizar sobre o papel com o design, com o lado da fita para cima.
5. Usar um bisturi para cortar a fita sobre a lâmina de vidro usando o design de papel como uma referência e, em seguida, descascar fita de áreas não desejadas de a lâmina de vidro.
6. Lavar a lâmina de vidro com isopropanol e depois seque com uma pistola de ar. Cozer a lâmina de vidro em um forno a 65 ° C durante 30 min.
7. Rolar suavemente sobre a fita adesiva com um rolo de borracha para retirar as bolhas de ar e permitir que a corrediça se arrefecer até à temperatura ambiente.

3. Macio Litografia Fabricação dos dispositivos PDMS

1. Misture PDMS elastómero e o seu agente de cura numa proporção de 10: 1 (w: w), agita-se a mistura vigorosamente, e, em seguida, desgaseificar a mistura, colocando-o em uma câmara de vácuo até que não há bolhas de ar aparecer na mistura.
2. Verter a mistura para um molde de silício silanizada ou molde de fita adesiva num prato de petri para obter um ~ 2 espessa camada de PDMS e desgaseificar mm até todo o ar bolhas desaparecem.
3. Curar o PDMS em um fornoa 65 ° C durante 2 h.
4. Use um bisturi para cortar a camada de PDMS pelo menos 5 mm de distância das características e, em seguida, descasque as PDMS curado fora do molde usando pinça.
5. Um único orifício de entrada com uma biópsia de um milímetro perfurar qualquer lugar no microcanal, de preferência ao fim de uma rede de microcanais como pode ser visto na Figura 2-A e 4-B.
6. Limpar o PDMS expressos com fita adesiva para remover partículas de poeira adsorvidos sobre o dispositivo. Esteriliza-se o dispositivo de microcanal PDMS (PDMS fundido) por lavagem com uma solução de etanol a 70%, seguido por estéril desionizada (DI) de água, e expor a UV durante 30 min.
7. Manter o dispositivo PDMS estéril numa placa de Petri estéril até à sua utilização.

4. Substrato Padronização

1. Coloque as PDMS estéreis expressos usando uma pinça para uma lamela de vidro esterilizada ou placa de petri e aplique uma leve pressão com a ponta da pinça.
   NOTA: O elenco PDMS faz um conformado, mas vedação reversível com a gllamela asno ou placa de petri formando microcanais sem o uso de qualquer adesivo.
2. Coloque uma gota (20 - 40 ul) da solução de substrato na entrada cobrindo completamente o orifício de entrada. Padrão poli-D-lisina (PDL), colocando uma gota de 20 ul de PDL em tampão tetraborato de sódio na entrada dos microcanais.
3. Colocar a placa de Petri num vácuo de ~ 254 mmHgA (equivalente a uma câmara de vácuo em laboratórios biológicos) durante 10 min, e observar o ar que sai do canal sob a forma de bolhas.
4. Desligar o vácuo e observar a solução de substrato que flui para o microcanal.
5. Incubar o prato com as condições adequadas para a adesão substrato. Ver Quadros 1 e 2 para as condições de incubação (estes variam dependendo do substrato). Para padronização PDL, incubar durante 1 h a 37 ° C.
6. Retire cuidadosamente o selo PDMS usando uma pinça estéreis e lavar o padrão na lamela de vidro três vezes com água DI.
7. Adicionar uma solução a 1% de albumina de soro bovino (BSA) para a placa de petri para cobrir o prato ou a lamela de vidro e incubar durante a noite a 37 ° C.
   NOTA: Isto irá reduzir a aderência não específica em regiões não revestidos.
8. Aspirar fora a solução de BSA a 1%, e o substrato modelado está agora pronto para usar.

5. Padronização indireta de Células

1. Preparar a suspensão de células em meio de cultura isento de soro. O tipo de célula e a densidade de células são listadas na Tabela 1.
2. Adicionar a suspensão de células para o prato modelado Petri e completamente imersa a região modelada em suspensão de células.
3. Incubar a placa de Petri a 37 ° C em uma incubadora durante 15 minutos para permitir que as células para anexar o substrato modelado.
4. Aspirar o excesso de suspensão de células a partir da placa de Petri e lavar as células modelado três vezes com salina tamponada com fosfato (PBS), enquanto agitando durante 10 segundos para remover células não ligadas.
5. Adicionar a umppropriate cultura médio para as culturas de células padronizadas e incubar as células padronizadas a 37 ° C em uma incubadora de CO _2.

6. Padronização direta de células

NOTA: Esta técnica é uma alternativa à padronização de células indirecto descrito no passo 5. No entanto, ao contrário de no passo 5, nesta técnica células são modelados em superfícies de cultura de tecidos com ou sem revestimento de substrato.

1. Esteriliza-se o dispositivo de microfluidos por lavagem com uma solução de 70% de etanol seguido por água desionizada.
2. Embeber o dispositivo durante a noite numa solução de 1% de BSA para evitar a adesão celular ao PDMS.
3. Seca-se o dispositivo à temperatura ambiente e coloque-o da parte inferior da placa de petri tratadas com cultura de tecidos.
4. Preparar a suspensão de células em meio de cultura isento de soro. O tipo de célula e a densidade de células são listadas na Tabela 2.
5. Coloque uma gota (4-8 mL) da suspensão de células, suficiente para encher omicrocanais, na entrada cobrindo completamente o orifício de entrada.
6. Colocar a placa de petri em vácuo durante 10 minutos e observar ar que sai do canal sob a forma de bolhas. Desligar o vácuo e observar a suspensão de células que flui para o microcanal.
7. Incubar a placa de Petri dentro de uma incubadora para promover a adesão celular de acordo com as condições de incubação (dependem do tipo de célula modelado) mencionado na Tabela 2. Adicionar PBS numa placa de Petri submergindo o dispositivo de PDMS.
8. Descasque o PDMS com cuidado para fora da placa de Petri com uma pinça e lavar o padrão com PBS. Adicionar meio de cultura de células para a placa de Petri e colocar a cultura de células na incubadora.

Resultados

Este método permite a padronização de proteínas e padronização indireta de células usando canais microfluídicos sem saída com dimensões tão pequenas quanto 10 mm e equipamentos disponíveis em quase todos os laboratórios biológicos uma vez que o molde mestre é feita. Esta técnica pode ser utilizada com canais microfluídicos PDMS criados usando fotolitografia suave tradicional, ou com canais microfluídicos PDMS criadas com fita adesiva de fabricação (Figura 1)

Discussão

Enquanto fotolitografia convencional é uma técnica bem estabelecida para a realização de moldes de litografia macia, o equipamento, materiais, e as competências necessárias para utilizar fotolitografia convencional não estão prontamente disponíveis para a maioria dos laboratórios. Para laboratórios que não têm acesso a esses recursos, nós apresentamos a fabricação de fita adesiva como um método de criação de moldes com características relativamente simples para dispositivos microfluídicos. Este mét...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools	Corel Corporation, Canada	X4 Version 14.0.0.701	CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device
Laser Printer HP	Hewlett Packard, CA	1739629	Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique
Bel-Art Dessicator	Fisher Scientific, MA	08-594-16B	Used to degass the PDMS mixture
Adhesive Scotch Tape	3M Product, MN	Tape 600	Used to fabricate adhesive tape Master
PDMS Sylgard 184	Dow Corning, MI	1064291	Casting polymer
Petri Dish	Fisher Scientific, MA	08-772-23	Used to keep the mold to cast with PDMS
Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11)	Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan	2976#11	Used to cut the PDMS
Tweezers	Ted Pella, CA	5627-07	Used to handle the PDMS cast during peeling
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-546-2	Used as surface to pattern the Substrate
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-544-4	Used as surface to pattern the Substrate
Rubber Roller	Dick Blick Art Materials, IL	40104-1004	Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles
Laser Mask Writer	Heidelberg Instruments, Germany	DWL66fs	Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process
EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool)	EV Group, Germany	EVG 620T(B)	Used to expose the photoresist to UV light
Spin Coater Headway	Headway Research Inc, TX	PWM32-PS-CB15PL	Used to spin coat the photoresist on silicon wafer
Photoresists SU-8 50	MicroChem, MA	Y131269	Negative photoresist used for mold fabrication
SU-8 Devloper	MicroChem, MA	Y020100	Photoresist developer
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane	UCT Specialties, PA	T2492-KG	Coat mold to avoid PDMS adhesion
Isopropanol	Sigma-Aldrich, MO	190764	Cleaning Solvent
Ethanol	Sigma-Aldrich, MO	24102	Sterilization Solvent
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich, MO	P0899-10MG	PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer
Laminin	Sigma-Aldrich, MO	L2020	Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use
BSA	Fisher Scientific, MA	BP1605100	Cell culture
C2C12 Myoblast cell lline	ATCC, VA	CRL-1722	Used to demonstrate C2C12 patterning
PC12 Cell Line	ATCC, VA	CRL-1721	Used to demonstrate PC12 patterning
Collagen type 1, rat tail	BD Biosciences	40236	Cell culture
DMEM	GIBCO, MA	11965-084	Cell culture
Horse Serum, heat inactivated	Fisher Scientific, MA	26050-070	Cell culture
Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC)	Sigma-Aldrich, MO	P1951	To label cells
Calcein-AM live dead cell Assay kit	Invitrogen, MA	L-3224	Cell viability Assay
Biopsy Hole Punch	Ted Pella, CA	15110-10	Punched hole in PDMS