إعداد الأدوية العشبية: إير-زيان ديكوتيون و إير-زيان التي تحتوي على مصل ل<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; التجارب

Summary

هنا، نقدم إعداد مغلي إشيان (إكسد) في أربع خطوات، تمرغ، مغلي، والترشيح، والتركيز، وإظهار إدارة مصل يحتوي على إكسد المحضرة إلى الفئران. هذه الأساليب قابلة للتطبيق على الجسم الحي وفي دراسة المختبر من الاستغناء العشبية مثل الأدوية الصينية التقليدية.

Abstract

وقد حظيت الأدوية العشبية التقليدية، وهي طب بديل في الإطار السريري، باهتمام متزايد في السنوات الأخيرة. قبل التسليم إلى الجسم، وعادة ما يتطلب إجراء استخراج إضافية للافراج عن المكونات النشطة من الأعشاب الخام. ديكوتيون المياه هو إجراء استخراج الكلاسيكية التي لا تزال تستخدم على نطاق واسع في الإعدادات السريرية. هنا، نقترح بروتوكول مفصل ل إر-زيان مغلي (إكسد) من أجل تطبيق ديكوكتيونس العشبية للدراسات التجريبية. يتم وصف حساب الجرعة المناسبة للحيوان، وكذلك الخطوات الرئيسية الأربعة من إكسد: تمرغ، مغلي الماء، والترشيح، والتركيز. وبالإضافة إلى ذلك، يتم عرض إكسد المصل المحتوية على المصل إلى الفئران كوسيلة للتحقق من صحة المختبر . هنا، كانت الفئران تدار شفويا إكسد لمدة ثلاثة أيام. ثم تم جمع عينات الدم، المعطل، الطرد المركزي، وتصفيتها. المصل، المخفف مع الوسط الثقافي، يمكن أن تستخدم لعلاج الخلايا أو الأنسجة في الخامسإترو. على سبيل المثال، تم تطبيق إكسد على حد سواء في الجسم الحي وفي الدراسات المختبرية وأظهرت أن إكسد يعزز تكوين العظم. هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم كمرجع لإعداد وتطبيق الأدوية العشبية.

Introduction

الاهتمام في دراسة وتطبيق الأدوية العشبية التقليدية ينمو حاليا. على عكس الأدوية الحديثة، التي المكونات الكيميائية هي محددة، الصيغ العشبية لديها بعض المكونات غير معروفة وتتطلب عمليات استخراج لتمكين تسليم المركبات النشطة. على الرغم من أن العديد من الدراسات في محاولة لتحديد مجمع صغير واحد مع بنية معروفة كممثل من عشب كامل أو صيغة العشبية، لا يمكن اعتبار أي فعالية الدوائية أو آليات يعادل ^{1 ، 2} . في حين أن البصمات تمكن من تحليل مكونات الصيغ العشبية المعقدة، وبعض المكونات لا تزال غير تحليلها بشكل واضح، مما يؤدي إلى تحدي عند الجمع بين جميع مقتطفات للدراسة ³ . التفاعلات من العديد من المكونات / مقتطفات توسط الآثار العلاجية للأدوية العشبية. للحفاظ على هذه الميزة، استخراج التقليدية شكل ديكوكت أيون-لا يزال يستخدم على نطاق واسع في العيادة. منذ إجراء استخراج له تأثير كبير على فعالية العلاجية، وبروتوكول قياسي من مغلي المياه التقليدية ضروري، وخاصة بالنسبة للدراسات في الجسم الحي ^{4 ، 5} .

من ناحية أخرى، عند استكشاف الآليات الدوائية، وإدارة الاستغناء العشبية أثناء الدراسات في المختبر أو خارج الجسم الحي هو أيضا تحديا. وقد اقترح تاشينو في عام 1988 مفهوم المصل الذي يحتوي على المخدرات ⁶ . ومنذ ذلك الحين، طبقت أعداد متزايدة من الباحثين على الأدوية العشبية ^{7 و 8 و 9} . على الرغم من أن طريقة المصل يحتوي على المخدرات لديها بعض القيود، مثل تأثير بعض مكونات المصل، فإنه لا يزال يعتبر أن الطريقة التي تحاكي عن كثب الظروف الفسيولوجية.

"jove_content"> تم تطوير مغلي إير-زيان في أوائل 1950s لتخفيف أعراض انقطاع الطمث ^{10 ، 11 ، 12 ، 13} . كما تم تطبيقه على علاج فقر الدم اللاتنسجي ¹⁴ ، هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث ^{15 ، 16 ، 17} ، سابق لأوانه فشل المبيض ¹⁸ ، سرطان الثدي ¹⁹ ، سرطان المبيض ²⁰ ، وتأخر سن البلوغ ²¹ . هنا، نقدم بروتوكولات مفصلة لإعداد كل من مغلي إشيان (إكسد) والمصل الذي يحتوي على المخدرات. بالإضافة إلى ذلك، نحن تصف تطبيق إكسد و إكسد التي تحتوي على المصل إلى نماذج هشاشة العظام الفئران الفئران.

ويتكون إكسد من 9 غرام كل من كوركوليغو أورشيوادس غايرتن ، هيربا إبيمديي ، الرقم الأساسي مورينداي المخزنية ، والجذر انجليكا سينينسيس و 6 غرام كل من اللحاء فيلودندري و ريزوما أنيمارهيني لكل مريض بالغ يوميا. الجرعة المكافئة للفأرة هي 0.1418 إكسد / كغ / يوم استنادا إلى المعادلة التالية ²² : دب = دا * رب / را * (وا / وب) ^1/3 . دا و دب يشير إلى الجرعة لكل وزن الجسم (ملغ / كلغ) من الإنسان والفأر، على التوالي. يتم استبدال الجرعة، في ملغ / كغ، بعدد إكسد / كغ. ويمثل را و رب عامل الجسم البشري وعامل جسم الفأر، على التوالي، والتي تتناسب مع (مساحة سطح الجسم (م ² ) / وزن الجسم (كغ)) ^2/3 (انظر الجدول 1 ). وا و وب تشير إلى وزن الجسم (كلغ) من الإنسان والفأر، على التوالي.

Protocol

بروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من جامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي، وهي معتمدة من قبل التجربة الحيوانية لجنة الأخلاقيات الحيوانية شنغهاي.

1 - البروتوكول الأول: إعداد إكسد

1. عملية حسابية
   1. إدارة إكسد لمجموعة العلاج من 10 الفئران إمبرينتينغ السيطرة المنطقة (إكر) الفئران (0.02 كجم / ماوس)، 5 أيام في الأسبوع لمدة 12 أسبوعا.
      ملاحظة: هناك حاجة إلى ما مجموعه 1.702 إكسد. لأن إكسدس تقاس بزيادات منفصلة، ​​في الممارسة الحقيقية، إدارة 2 إكسدس.
   2. حساب حجم إكسد تطبيقها في الماوس ( أي V = (0.1418 إكسد / كغ • يوم) * (0.02 كجم / الماوس) * 50 مل / إكسد = 0.14 مل / ماوس • اليوم).
2. تمرغ
   1. وضع جميع المواد الخام من اثنين إكسدز ( أي، كوركوليغو أورشيوادس غايرتن (18 غرام)، هيربا إبيمديي (18 غرام)، الرقم الأساسي موريندي أوفيسيناليس (18 غرام)، Rأديكس أنجليسا سينينسيس (18 غراما)، اللحاء فيلودندري (12 غراما)، و ريزوما أنيمارهيني (12 غراما)، 96 غرام في المجموع) في وعاء مع غطاء.
      ملاحظة: يوصى بحاوية خزفية.
   2. مكررات الأعشاب الخام مع 500 مل من الماء المقطر لمدة 1 ساعة. يجب أن تغطي المياه الأعشاب بنحو بوصة واحدة. السماح لجميع الأعشاب نقع جيدا.
3. أول مغلي الماء
   1. تسخين الأعشاب باستخدام طباخ الغاز أو طباخ التعريفي على الطاقة العالية حتى يغلي الماء (حوالي 5-10 دقيقة؛ الفترة الزمنية يعتمد على قوة التدفئة، والحاوية، وكمية من الأعشاب والمياه). رفض السلطة إلى انخفاض ينضج لمدة 2 ساعة.
4. الترشيح الأول
   1. غطاء كوب 500 مل مع ورقة الترشيح العادية أو مع الشاش والقطن. صب بعناية قبالة مغلي في الدورق من خلال مرشح. ترك الأعشاب في الحاوية.
   2. إعادة بقايا الأعشاب المتبقية سn ورق الترشيح إلى الحاوية.
5. مغلي الماء الثاني
   1. إضافة الماء المقطر إلى الحاوية مع الأعشاب. والسماح لها تغطية الأعشاب بنحو بوصة واحدة.
   2. كرر الخطوة 1.3.
6. الترشيح الثاني
   1. كرر الخطوات 1.4.1 و 1.4.2.
   2. صب قبالة مغلي الثاني في نفس الدورق. خلط ديكوكتيونس الأولى والثانية معا.
7. تركيز
   1. وضع الكأس على طباخ الغاز مع الاسبستوس خالية من الشاش الأسلاك بينهما، حرارة ديكوتيون باستخدام ينضج منخفضة، وببطء وبشكل مستمر اثارة مع قضيب من الزجاج.
   2. عندما يقلل ديكوتيون إلى 200 مل، نقله إلى كوب 500 مل.
   3. كرر الخطوة 1.7.1 حتى ديكوتيون يقلل إلى 100 مل.
8. التخزين والإدارة
   1. نقل ديكوتيون المركزة إلى زجاجة معقمة. السماح لها باردة إلى غرفة تمبراتوري (رت). تخزين في 4 درجات مئوية إذا كان استخدامه في غضون أسبوع واحد أو في -70 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
   2. باستخدام إبرة التزقيم، وإدارة 0.14 مل / الماوس من ديكوتيون ل أوفاريكتوميزد (أوفكس) الفئران مرة واحدة يوميا، 5 أيام في الأسبوع لمدة 12 أسبوعا.

2. البروتوكول الثاني: إعداد المصل المحتوي على إكسد

1. عملية حسابية
   1. حساب الجرعة المكافئة للفئران (ريد) باستخدام 0.15 كغ وزن الجسم لكل فئران (1 شهر من العمر): ديسيبل = (1/60) * (90/100) * (60 / 0.15) ^1/3 = 0.111 إكسد / كغ / يوم.
      ملاحظة: هناك حاجة إلى ما مجموعه 10 مل من المصل المحتوي على إكسد لإعداد 100 مل من الوسط الثقافي (10٪ من المصل يحتوي على إكسد). ومن المتوقع أن توفر 2 مل من الفئران كل الفئران. وبالتالي، هناك حاجة إلى 6 الفئران (خسارة 20٪ في الاعتبار) لإدارة إكسد مرة واحدة يوميا لمدة 3 أيام. عدد إكسدس هو: (0.111 إكسد / كغ • يوم) * (0.15 كجم / الفئران) * (6 الفئران) * (3 أيام) = 0.300 إكسد. مرة أخرى، لأن إكسدس يتم قياسها في زيادات منفصلة،استخدام 1 إكسد.
   2. حساب حجم إكسد تطبيقها في الفئران ( أي، V = (0.111 إكسد / كجم في اليوم) * (0.15 كجم / الفئران) * (50 مل / إكسد) = 0.83 مل / الفئران • اليوم).
2. تمرغ
   1. وضع المواد الخام ل 1 إكسد في وعاء مع غطاء. مكررات الأعشاب الخام في الماء المقطر لمدة 1 ساعة؛ يجب أن تغطي المياه الأعشاب بنحو بوصة واحدة. السماح لجميع الأعشاب نقع جيدا.
3. أول مغلي الماء
   1. تسخين الأعشاب باستخدام طباخ التعريفي على الطاقة العالية حتى يغلي الماء (حوالي 5-10 دقيقة؛ الفترة الزمنية يعتمد على الطاقة الحرارية، والحاوية، وكمية من الأعشاب والمياه). تحويل الطاقة إلى انخفاض ينضج لمدة 2 ساعة.
4. الترشيح الأول
   1. غطاء كوب 500 مل مع ورقة الترشيح العادية أو مع الشاش والقطن. صب بعناية قبالة مغلي في الدورق من خلال مرشح. ترك الأعشاب في الحاوية.
   2. أعد بقايا الأعشاب على ورق الترشيح إلى الحاوية.
5. مغلي الماء الثاني
   1. إضافة الماء المقطر إلى الحاوية مع الأعشاب. والسماح لها تغطية الأعشاب بنحو بوصة واحدة.
   2. كرر الخطوة 2.4.
6. الترشيح الثاني
   1. كرر الخطوات 2.5.1 و 2.5.2.
   2. صب قبالة مغلي الثاني في نفس الدورق كما في الخطوة 2.4.1 وتخلط ديكوكتيونس الأولى والثانية معا.
7. تركيز
   1. وضع الكأس على طباخ الغاز مع الشاش الأسلاك خالية من الاسبستوس بينهما، حرارة ديكوتيون باستخدام ينضج منخفضة، وإثارة ببطء وبشكل مستمر مع قضيب من الزجاج.
   2. عندما يقلل ديكوتيون إلى 100 مل، نقله إلى كوب 100 مل.
   3. كرر الخطوة 2.7.1 حتى يقلل ديكوتيون إلى 50 مل.
8. التخزين والإدارة
   1. نقل ديكوتيون المركزة إلى سترإيل، قنينة الزجاج. السماح لتبرد ل رت. تخزين في 4 درجات مئوية إذا كان استخدامه في غضون أسبوع واحد أو في -70 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
   2. إدارة عن طريق الفم 0.83 مل / الفئران مرة واحدة يوميا لمدة 3 أيام.
9. إكسد التي تحتوي على إعداد المصل
   1. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من 300 مل / 100 غرام من 80 ملغ / كغ من الكيتامين و 10 ملغ / كغ زيلازين في 1 ساعة بعد آخر إدارة إكسد. تأكيد التخدير الصحيح عن طريق قرصة أخمص قدميه.
   2. شق الجلد والبريتوني من الفئران من البطن إلى الجزء السفلي من الصدر باستخدام مشرط (أو مقص التشغيل على التوالي). إنشاء شق طول وعمق حوالي 5 سم و 0.5 سم، على التوالي. نقل أحشاء البطن إلى اليسار باستخدام ورقة الأنسجة.
   3. باستخدام ورقة الأنسجة، وإزالة النسيج الضام من الشريان الأورطي البطني للكشف بوضوح السفينة.
   4. رسم الدم ببطء من الشريان الأورطي البطني باستخدام 10 مل، 22-حقنة قياس. نقله إلىأنبوب معقم 15 مل بعد إزالة الإبرة. فئران واحدة يمكن أن تنتج 8-10 مل من الدم.
      ملاحظة: يجب أن يكون الفئران على قيد الحياة ( أي، مع البطن الشريان الأورطي النابض) عند بدء رسم الدم والموتى بعد اكتمال الرسم.
   5. تخثر الدم في وضع مستقيم لمدة 30 - 60 دقيقة في الغرفة رت. أجهزة الطرد المركزي في 500-600 x ج لمدة 20 دقيقة. وضع بعناية كل طاف (المصل) في أنبوب 50 مل واحد معقمة وتخلط كل المصل (من الحيوانات المختلفة) معا.
   6. أداء تعطيل الحرارة عن طريق احتضان المصل في حمام مائي 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تصفية المصل باستخدام مرشح حقنة مع 0.22 ميكرون حجم المسام غشاء بوليثرزولفون ماء. استخدام المصل جديدة أو تخزينه في -20 درجة مئوية.
10. السيطرة على المخدرات التي تحتوي على إعداد المصل (المستخدمة في مجموعة السيطرة)
    1. إدارة كل الفئران مع نفس الحجم من المياه المالحة (0.83 مل) مرة واحدة يوميا لمدة 3 أيام. الخطوات الأخرى هي نفسها كما في الخطوة 2.9.
11. الوضعية
    1. إضافة 10 مل من المصل تحتوي على إكسد المصل أو المخدرات التي تحتوي على كل 100 مل من المتوسطة، بالإضافة إلى 1٪ البنسلين الستربتومايسين (بس) ²³ .

النتائج

تأثير إكسد على كثافة العظام من الفئران أوفكس

يظهر هيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ القسم الفقرات القطنية زيادة ترابيك العظام بعد العلاج إكسد في الجسم الحي ( الشكل 1A ، اللوحة اليمن?...

Discussion

في السنوات الأخيرة، تم إيلاء المزيد من الاهتمام للأدوية العشبية، وهو نوع واحد من الطب البديل الذي تم تطبيقه في الإعداد السريري في العالم الشرقي لآلاف السنين. مختلفة من "مقعد إلى السرير" نمط الطب الحديث، والأدوية العشبية التقليدية تتطلب أولا "السرير إلى مقاعد...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Curculigo orchioides Gaertn (9 g), Herbaa Epimedii (9 g), Radix Morindae Officinalis (9 g), Radix Angelicae Sinensis (9 g), Cortex Phellodendri (6 g), and Rhizoma Anemarrhenae (6 g)	Kang-qiao Chinese Medicine Yinpian Co. Ltd (Shanghai, CN)	160922	EXD components
Filter paper	GElifesciences	99-103-952	Filter EXD decoction before concentration
Imprinting Control Region (ICR) mice	Shanghai Laboratory Animal Center	SCXK 2007-0005	In vivo study
Sprague Dawley rats	Shanghai Laboratory Animal Center	SCXK 2007-0005	EXD-containing serum preparation
Syringe filter	Millipore	SLGP033RB	0.22 µm
gavage needles (10 ml)	Shanghai BO Ge trade sales department	59104274	Adminstration of EXD
Ketamine (80 mg/kg)	Fujian Gutian Pharma Co. Ltd	H35020148	Anesthesia
Xylazine (10 mg/kg)	Sunway Pharma Co. Ltd	CB07591	Anesthesia
Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco (DMEM) culture medium	Gibco	12800-116	DMEM with 2 mM L-glutamine and without ribonucleosides and ribonucleotides
Streptomycin	Sigma	1277	100 µg / ml
Penicillin	Sigma	4687	100 µg / ml