Preparación de Herbal Medicine: Decocción de Er-Xian y suero que contiene Er-Xian para<em&gt; In Vivo</em&gt; Y<em&gt; In Vitro</em&gt; Experimentos

Resumen

Aquí, se presenta la preparación de una decocción er-xian (EXD) en cuatro pasos-empapamiento, decocción, filtración y concentración- y demuestran la administración de un suero preparado para EXD a ratas. Estos métodos son aplicables al estudio in vivo e in vitro de las decocciones a base de hierbas como las medicinas tradicionales chinas.

Resumen

La medicina herbal tradicional, una medicina alternativa en el ambiente clínico, ha recibido una atención creciente en los últimos años. Antes de la entrega al cuerpo, se requiere comúnmente un procedimiento de extracción adicional para liberar los componentes activos de las hierbas crudas. La decocción acuosa es un procedimiento de extracción clásico que todavía se utiliza ampliamente en los entornos clínicos. Aquí, proponemos un protocolo detallado para la decocción er-xian (EXD) con el fin de aplicar las decocciones a base de hierbas a los estudios experimentales. Se describe el cálculo de una dosis apropiada para animales, así como los cuatro pasos principales de EXD: remojo, decocción de agua, filtración y concentración. Además, el suero que contiene EXD se introduce a las ratas como un medio de validación in vitro . En este caso, las ratas fueron administradas por vía oral EXD durante tres días. Las muestras de sangre se recogieron entonces, se inactivaron, se centrifugaron y se filtraron. El suero, diluido con el medio de cultivo, puede utilizarse para tratar células o tejidos en vItro Por ejemplo, EXD se aplicó tanto a estudios in vivo e in vitro y demostró que EXD mejora la osteogénesis. Este protocolo puede utilizarse como referencia para la preparación y aplicación de medicamentos herbales.

Introducción

El interés en el estudio y la aplicación de la medicina herbaria tradicional está creciendo actualmente. A diferencia de las drogas modernas, en las cuales los ingredientes químicos son definidos, las fórmulas herbarias tienen algunos ingredientes desconocidos y requieren procesos de extracción para permitir la entrega de sus compuestos activos. Aunque muchos estudios tratan de seleccionar un pequeño compuesto con una estructura bien conocida como representante de toda la hierba o fórmula herbaria, ni las eficacias farmacológicas ni los mecanismos pueden considerarse equivalentes ^{1 , 2} . Mientras que las huellas dactilares permiten el análisis de los constituyentes de fórmulas herbarias complejas, algunos constituyentes todavía no se analizan claramente, lo que conduce a un desafío cuando se combinan todos los extractos para el estudio ³ . Las interacciones de numerosos constituyentes / extractos median los efectos terapéuticos de las hierbas medicinales. Para conservar esta ventaja, la forma tradicional de extracto-decocciónIon-todavía es ampliamente utilizado en la clínica. Dado que el procedimiento de extracción tiene un gran impacto en la eficacia terapéutica, es necesario un protocolo estándar de decocción tradicional de agua, especialmente para estudios in vivo ^{4 , 5} .

Por otro lado, al explorar mecanismos farmacológicos, la administración de decocciones a base de hierbas durante estudios in vitro o ex vivo es también un desafío. El concepto de un suero que contenía fármacos fue propuesto por primera vez por Tashino en 1988 ⁶ . Desde entonces, un número creciente de investigadores lo han aplicado a la medicina herbal ^{7 , 8 , 9} . Aunque el método del suero que contiene fármaco tiene algunas limitaciones, tales como la influencia de ciertos componentes del suero, todavía se considera que es un método que imita de cerca las condiciones fisiológicas.

La decocción er-xian se desarrolló a principios de los años 1950 para aliviar los síntomas de la menopausia ^{10 , 11 , 12 , 13} . También se ha aplicado al tratamiento de la anemia aplásica ¹⁴ , osteoporosis menopáusica ^{15 , 16 , 17} , fallo ovárico prematuro ¹⁸ , cáncer de mama ¹⁹ , cáncer de ovario ²⁰ y pubertad tardía ²¹ . Aquí presentamos protocolos detallados para la preparación de la decocción er-xian (EXD) y su suero que contiene fármaco. Además, se describe la aplicación de EXD y EXD conteniendo suero a los modelos de osteoporosis menopáusicas murinos.

Un EXD se compone de 9 g cada uno de Curculigo orchioides Gaertn , Herbaa Epimedii Radix Morindae Officinalis y Radix Angelicae Sinensis y 6 g de Cortex Phellodendri y Rhizoma Anemarrhenae por paciente adulto al día. La dosis equivalente para un ratón es de 0,1418 EXD / kg / día basándose en la siguiente ecuación ²² : dB = dA * RB / RA * (WA / WB) ^1/3 . DA y dB se refieren a la dosis por peso corporal (mg / kg) del ser humano y del ratón, respectivamente. La dosis, en mg / kg, se sustituye por el número de EXD / kg. RA y RB representan el factor del cuerpo humano y el factor corporal del ratón respectivamente, que son proporcionales a la (superficie corporal (m ² ) / peso corporal (kg)) ^2/3 (ver Tabla 1 ). WA y WB indican el peso corporal (kg) del humano y del ratón, respectivamente.

Protocolo

El protocolo sigue las pautas del cuidado animal de la universidad de Shangai de la medicina china tradicional y es aprobado por el experimento animal Comité de Ética animal de Shangai.

1. Protocolo I: Preparación de EXD

1. Cálculo
   1. Administrar el EXD a un grupo de tratamiento de 10 ratones hembra de seis meses de edad de Imprinting Control Region (ICR) (0,02 kg / ratón), 5 días a la semana durante 12 semanas.
      NOTA: Se necesitan un total de 1.702 EXDs. Debido a que los EXDs se miden en incrementos discretos, en la práctica real, administrar 2 EXDs.
   2. Calcular el volumen de EXD aplicado por ratón ( es decir, V = (0,1418 EXD / kg • día) * (0,02 kg / ratón) * 50 ml / EXD = 0,14 ml / ratón • día).
2. Remojo
   1. Colocar todas las materias primas de dos EXD ( es decir, Curculigo orchioides Gaertn (18 g), Herbaa Epimedii (18 g), Radix Morindae Officinalis (18 g), RAdix Angelicae Sinensis (18 g), Cortex Phellodendri (12 g) y Rhizoma Anemarrhenae (12 g), 96 g en total) en un recipiente con tapa.
      NOTA: Se recomienda un recipiente de cerámica.
   2. Macerar las hierbas crudas con 500 mL de agua destilada durante 1 h; El agua debe cubrir las hierbas por cerca de una pulgada. Deja que todas las hierbas se empapen completamente.
3. Primera decocción acuosa
   1. Calentar las hierbas utilizando una cocina de gas o una cocina de inducción de alta potencia hasta que el agua hierve (alrededor de 5 - 10 minutos, el tiempo depende de la potencia de calefacción, el recipiente y la cantidad de hierbas y agua). Baja la potencia a fuego lento durante 2 h.
4. Primera filtración
   1. Cubra un vaso de precipitados de 500 ml con papel de filtro regular o con gasa y algodón. Vierta cuidadosamente la decocción en el vaso de precipitados a través del filtro. Deje las hierbas en el recipiente.
   2. Devolver el residuo de hierbas restanteN el papel de filtro al recipiente.
5. Segunda decocción acuosa
   1. Añadir agua destilada al recipiente con las hierbas; Deje cubrir las hierbas por cerca de una pulgada.
   2. Repita el paso 1.3.
6. Segunda filtración
   1. Repita los pasos 1.4.1 y 1.4.2.
   2. Vierta la segunda decocción en el mismo vaso. Mezclar la primera y la segunda decocciones juntas.
7. Concentración
   1. Colocar el vaso en una cocina de gas con gasa de alambre libre de amianto entre ellos, calentar la decocción con un bajo cocción a fuego lento y revolver lentamente y continuamente con una barra de vidrio.
   2. Cuando la decocción se reduce a 200 ml, se transfiere a un vaso de precipitados de 500 ml.
   3. Repita el paso 1.7.1 hasta que la decocción se reduzca a 100 mL.
8. Almacenamiento y administración
   1. Transferir la decocción concentrada a una botella de vidrio estéril. Dejar enfriar a temperatura ambienteRe (RT). Almacenar a 4 ° C si se utiliza dentro de una semana oa -70 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
   2. Usando una aguja de sonda, administre 0,14 mL / ratón de la decocción a ratones ovariectomizados (OVX) una vez al día, 5 días a la semana durante 12 semanas.

2. Protocolo II: Preparación de suero que contiene EXD

1. Cálculo
   1. Calcular la dosis equivalente de rata (RED) usando 0,15 kg como el peso corporal de cada rata (1 mes de edad): dB = (1/60) * (90/100) * (60 / 0.15) ^1/3 = 0.111 EXD / Kg / día.
      NOTA: Se necesita un total de 10 ml de suero que contenga EXD para preparar 100 ml de medio de cultivo (10% de suero que contenga EXD). Se espera que cada rata proporcione 2 ml de suero. Por lo tanto, 6 ratas (una pérdida del 20% se tienen en cuenta) son necesarios para la administración de EXD una vez al día durante 3 días. El número de EXD es: (0.111 EXD / kg • día) * (0.15 kg / rata) * (6 ratas) * (3 días) = ​​0.300 EXD. De nuevo, debido a que los EXDs se miden en incrementos discretos,Utilice 1 EXD.
   2. Calcular el volumen de EXD aplicado por rata ( es decir, V = (0.111 EXD / kg • día) * (0.15 kg / rata) * (50 mL / EXD) = 0.83 mL / rata • día).
2. Remojo
   1. Ponga las materias primas para 1 EXD en un recipiente con una tapa. Macerar las hierbas crudas en agua destilada durante 1 h; El agua debe cubrir las hierbas por cerca de una pulgada. Deja que todas las hierbas se empapen completamente.
3. Primera decocción acuosa
   1. Calentar las hierbas utilizando una cocina de inducción de alta potencia hasta que el agua hierve (alrededor de 5 - 10 min, el tiempo depende de la potencia calorífica, el recipiente y la cantidad de hierbas y agua). Apague la alimentación a fuego lento durante 2 h.
4. Primera filtración
   1. Cubra un vaso de precipitados de 500 ml con papel de filtro regular o con gasa y algodón. Vierta cuidadosamente la decocción en el vaso de precipitados a través del filtro. Deje las hierbas en el recipiente.
   2. Devuelva el residuo de hierbas en el papel de filtro al recipiente.
5. Segunda decocción acuosa
   1. Añadir agua destilada al recipiente con las hierbas; Deje cubrir las hierbas por cerca de una pulgada.
   2. Repita el paso 2.4.
6. Segunda filtración
   1. Repita los pasos 2.5.1 y 2.5.2.
   2. Vierta la segunda decocción en el mismo vaso de precipitados que en el paso 2.4.1 y mezcle la primera y la segunda decocciones juntas.
7. Concentración
   1. Colocar el vaso en una cocina de gas con gasa de alambre libre de amianto entre ellos, calentar la decocción con un bajo a fuego lento y revolver lentamente y continuamente con una varilla de vidrio.
   2. Cuando la decocción se reduce a 100 ml, se transfiere a un vaso de precipitados de 100 ml.
   3. Repita el paso 2.7.1 hasta que la decocción se reduzca a 50 ml.
8. Almacenamiento y administración
   1. Transferir la decocción concentrada en unaBotella de vidrio. Dejar enfriar a RT. Almacenar a 4 ° C si se utiliza dentro de una semana oa -70 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
   2. Administrar intragástralmente 0,83 mL / rata una vez al día durante 3 días.
9. Preparación de suero que contiene EXD
   1. Anestesiar las ratas por inyección intraperitoneal de 300 ml / 100 g de 80 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina a 1 h después de la última administración de EXD. Confirme la adecuada anestesia por pellizco del dedo del pie.
   2. Inciso de la piel y el peritoneo de la rata desde el abdomen hasta el fondo del tórax con un bisturí (o tijeras de operación recta). Crear una incisión de longitud y profundidad de unos 5 cm y 0,5 cm, respectivamente. Mueva las vísceras abdominales a la izquierda utilizando papel de seda.
   3. Usando papel tisú, retire el tejido conectivo de la aorta abdominal para exponer claramente el vaso.
   4. Saque la sangre lentamente de la aorta abdominal usando una jeringa calibre 22 de 10 ml. Transferirlo aUn tubo estéril de 15 ml después de retirar la aguja; Una rata puede producir 8-10 ml de sangre.
      NOTA: La rata debe estar viva ( es decir, con la aorta abdominal pulsando) al comenzar el dibujo de sangre y muerta después de que el dibujo se complete.
   5. Coagular la sangre en posición vertical durante 30 - 60 min a la habitación RT. Centrifugar a 500-600 xg durante 20 min. Colocar cuidadosamente todo el sobrenadante (suero) en un tubo estéril de 50 ml y mezclar todo el suero (de diferentes animales).
   6. Realizar la inactivación por calor mediante la incubación del suero en un baño de agua a 56 ° C durante 30 min. Filtrar el suero utilizando un filtro de jeringa con una membrana de polietersulfona hidrófila de 0,22 μm de tamaño de poro. Utilice el suero fresco o guárdelo a -20 ° C.
10. La preparación de suero que contiene un fármaco de control (utilizada en el grupo de control)
    1. Administrar cada rata con el mismo volumen de solución salina (0,83 mL) una vez al día durante 3 días. Los otros pasos son los mismos que en el paso 2.9.
11. Solicitud
    1. Añadir 10 ml de suero que contenga EXD o suero que contenga fármaco a cada 100 ml de medio, más 1% de penicilina-estreptomicina (PS) [ ^23] .

Resultados

El efecto de EXD sobre la densidad ósea de ratones OVX

La tinción con hematoxilina y eosina (H & E) de la sección de la vértebra lumbar muestra un aumento de las trabéculas óseas después del tratamiento EXD in vivo ( Figura 1A , panel derecho) en comparación con las del grupo OVX ( Figura 1A , panel izquierdo). La Figura 1B muestra las imágenes representativ...

Discusión

En los últimos años, se ha prestado más atención a las hierbas medicinales, un tipo de medicina alternativa que se ha aplicado en el entorno clínico en el mundo oriental durante miles de años. Diferente del patrón de "banco a la cama" de la medicina moderna, la medicina herbal tradicional primero requiere la "cama al banco" patrón para explicar sus mecanismos. Esto puede ser seguido por la validación realizada en la etapa de banca y el procesamiento para el desarrollo de fármacos recién op...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Curculigo orchioides Gaertn (9 g), Herbaa Epimedii (9 g), Radix Morindae Officinalis (9 g), Radix Angelicae Sinensis (9 g), Cortex Phellodendri (6 g), and Rhizoma Anemarrhenae (6 g)	Kang-qiao Chinese Medicine Yinpian Co. Ltd (Shanghai, CN)	160922	EXD components
Filter paper	GElifesciences	99-103-952	Filter EXD decoction before concentration
Imprinting Control Region (ICR) mice	Shanghai Laboratory Animal Center	SCXK 2007-0005	In vivo study
Sprague Dawley rats	Shanghai Laboratory Animal Center	SCXK 2007-0005	EXD-containing serum preparation
Syringe filter	Millipore	SLGP033RB	0.22 µm
gavage needles (10 ml)	Shanghai BO Ge trade sales department	59104274	Adminstration of EXD
Ketamine (80 mg/kg)	Fujian Gutian Pharma Co. Ltd	H35020148	Anesthesia
Xylazine (10 mg/kg)	Sunway Pharma Co. Ltd	CB07591	Anesthesia
Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco (DMEM) culture medium	Gibco	12800-116	DMEM with 2 mM L-glutamine and without ribonucleosides and ribonucleotides
Streptomycin	Sigma	1277	100 µg / ml
Penicillin	Sigma	4687	100 µg / ml