약초의 준비 : Er-Xian의 달임과 Er-Xian 함유 세럼<em&gt; In Vivo</em&gt; 및<em&gt; 체외에서</em&gt; 실험

요약

여기에서는 4 가지 단계 (담금질, 달인, 여과 및 농축)의 erxian decoction (EXD) 준비 과정을 제시하고 준비된 EXD 함유 혈청을 쥐에게 투여하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 생약과 생체 외 연구에 적용 할 수 있습니다.

초록

임상 약제로 사용되는 대체 의학 인 한약은 최근 몇 년 동안 주목을 받아 왔습니다. 인체에 전달하기 전에 원료 약초에서 활성 성분을 방출하기 위해 일반적으로 추가 추출 절차가 필요합니다. 수분 섭취는 여전히 임상 환경에서 광범위하게 사용되는 고전적인 추출 과정입니다. 여기에서는 실험적 연구에 약초 즙을 적용하기 위해 erxian decoction (EXD)에 대한 상세한 프로토콜을 제안합니다. EXD의 4 가지 주요 단계 (수적, 수분 섭취, 여과 및 농축)뿐만 아니라 동물에 적합한 용량의 계산이 기술되어있다. 또한, 혈청 함유 EXD는 생체 외 검증을위한 수단으로 쥐에게 도입됩니다. 여기에 쥐에게 EXD를 3 일간 경구 투여 하였다. 혈액 샘플을 채취하고, 불 활성화시키고, 원심 분리하고, 여과시켰다. 배양 배지로 희석 된 혈청은 세포 또는 조직 을 vitro. 예를 들어, EXD는 in vivo 및 in vitro 연구에 모두 적용되었으며 EXD가 골 형성을 향상시키는 것으로 나타났습니다. 이 프로토콜은 약초의 제조 및 응용에 대한 참고 자료로 사용할 수 있습니다.

서문

전통적인 약초의 연구와 응용에 대한 관심이 현재 커지고 있습니다. 화학 성분이 확실한 현대 의약품과는 달리, 허브 성분에는 미지 성분이 포함되어 있으며 활성 성분을 전달할 수 있도록 추출 과정이 필요합니다. 많은 연구가 잘 알려진 구조를 가진 하나의 작은 화합물을 전체 약초 또는 허브 공식의 대표자로 선택하려고 시도하지만 약리학 적 효능이나 메커니즘은 동등한 것으로 간주 될 수 없다. 핑거 프린팅 (fingerprinting)은 복잡한 허브 수식의 구성 성분을 분석 할 수 있지만, 일부 성분은 아직 명확하게 분석되지 않아 연구 ^3에서 모든 추출물을 결합 할 때 어려움을 겪습니다. 수많은 성분 / 추출물의 상호 작용은 약초의 치료 효과를 중재합니다. 이러한 장점을 유지하기 위해 전통적인 추출물 형태이온은 여전히 ​​클리닉에서 널리 사용됩니다. 추출 과정은 치료 효능에 큰 영향을 미치기 때문에, 특히 생체 내 연구 ^4,5 에서 전통적 물 추출법의 표준 프로토콜이 필요합니다.

반면에, 약리학 적 기작을 탐색 할 때, 생체 외 또는 생체 외 연구 중에 약초를 처치하는 것은 도전 과제입니다. 약물 함유 혈청의 개념은 1988 년 Tashino에 의해 처음 제안되었다. 그 이후로 점점 많은 연구자들이 한약 ^{7 , 8 , 9} 에 그것을 적용 해왔다. 약물 함유 혈청의 방법은 혈청의 특정 성분의 영향과 같은 몇 가지 제한이 있지만, 여전히 생리 학적 조건을 밀접하게 모방하는 방법으로 간주됩니다.

er-xian 달임은 갱년기 증상 ^{10 , 11 , 12 , 13} 을 완화하기 위해 1950 년대 초에 개발되었습니다. 또한 재생 불량성 빈혈 ¹⁴ , 폐경기 골다공증 ^{15 , 16 , 17} , 조기 난소 부전 ¹⁸ , 유방암 ¹⁹ , 난소 암 ²⁰ 및 사춘기 지연 ^{21에도 적용} 되었습니다. 여기, 우리는 에르 - 시안 (erxian) 추출 (EXD)과 그 약물 함유 혈청의 제조를위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 또한 폐경기 골다공증 모델에 EXD 및 EXD를 함유 한 혈청을 적용하는 방법을 설명합니다.

EXD는 Curculigo orchioides Gaertn , Herba Epimedii Radix Morindae Officinalis , Radix Angelicae Sinensis , Cortex Phellodendri 및 Rhizoma Anemarrhenae 각각 6 g을 하루에 성인 1 인당 투여한다. 마우스의 등가 선량은 다음 식 ²² 에 따라 0.1418 EXD / kg / day입니다. dB = dA * RB / RA * (WA / WB) ^1/3 . dA와 dB는 각각 사람과 마우스의 체중 당 투여 량 (mg / kg)을 의미합니다. 용량 (mg / kg)은 EXD / kg의 수로 대체됩니다. RA와 RB는 각각 신체 표면적 (m ² ) / 체중 (kg) ^2/3 ( 표 1 참조)에 비례하는 인간 신체 계수와 마우스 몸 계수를 나타냅니다. WA 및 WB는 각각 사람 ​​및 마우스의 체중 (kg)을 나타낸다.

프로토콜

이 프로토콜은 상하이 한의대의 동물 관리 지침을 따르며 동물 실험 상하이 동물 윤리위원회의 승인을 받았습니다.

1. 프로토콜 I : EXD 준비

1. 계산
   1. EXD를 6 주령의 ICR (female Imprinting Control Region) 마우스 (0.02 kg / mouse) 10 마리의 치료 그룹에 12 주 동안 주 5 회 투여하십시오.
      참고 : 총 1.702 EXD가 필요합니다. EXD는 개별 증분으로 측정되기 때문에 실제로는 2 개의 EXD를 관리해야합니다.
   2. 마우스 당 EXD 부피를 계산하십시오 ( 예 : V = (0.1418 EXD / kg • 일) * (0.02 kg / 마우스) * 50 mL / EXD = 0.14 mL / 마우스 • 일).
2. 몸을 담그다
   1. 두 가지 EXD ( 즉, Curculigo orchioides Gaertn (18g), Herba Epimedii (18g), Radix Morindae Officinalis (18g), RAdix Angelicae Sinensis (18g), Cortex Phellodendri (12g), Rhizoma Anemarrhenae (12g), 총 96g)를 뚜껑이 달린 용기에 넣습니다.
      참고 : 세라믹 용기를 사용하는 것이 좋습니다.
   2. 생 약초를 500 mL의 증류수로 1 시간 동안 담그고; 물은 허브를 약 1 인치까지 덮어야합니다. 모든 허브가 완전히 흡수되도록하십시오.
3. 첫 번째 물 추출
   1. 물이 끓을 때까지 (약 5 ~ 10 분, 시간은 가열 력, 용기 및 허브와 물의 양에 따라 달라질 때까지) 가스 밥솥이나 고주파 밥솥을 사용하여 약초를 가열하십시오. 2 시간 동안 낮은 끓는 물로 전원을 끕니다.
4. 첫 번째 여과
   1. 일반 여과지 또는 거즈와면을 사용하여 500mL 유리 비이커를 덮으십시오. 조심스럽게 필터를 통해 비누에 달걀을 붓습니다. 컨테이너에 허브를 남겨주세요.
   2. 남은 허브 잔여 물을 반환하십시오.용기에 걸러진 여과지.
5. 2 차 수분 섭취
   1. 허브와 함께 증류수를 용기에 넣으십시오. 약 1 인치 정도의 약초를 가려야합니다.
   2. 단계 1.3을 반복하십시오.
6. 2 차 여과
   1. 1.4.1 및 1.4.2 단계를 반복하십시오.
   2. 같은 비이커에 두 번째 달인을 붓는다. 첫 번째와 두 번째 즙을 함께 섞는다.
7. 집중
   1. 비누를 사이에 석면이없는 철제 거즈가 달린 가스 밥솥에 올려 놓고 낮은 끓인 물로 가열하고 천천히 연속적으로 유리 막대로 저어 준다.
   2. 달임이 200 mL로 줄어들면 500 mL 비이커로 옮긴다.
   3. 달여가 100 mL가 될 때까지 1.7.1 단계를 반복하십시오.
8. 보관 및 관리
   1. 농축 된 달걀을 멸균 유리 병에 옮기십시오. 그것은 room temperatu로 식도록 내버려둬 라.re (RT). 장기간 보관할 경우 1 주일 이내에 -70 ° C에서 사용하는 경우 4 ° C에서 보관하십시오.
   2. 위관 (gavage) 바늘을 사용하여 1 일 1 회, 12 주 동안 1 주일에 1 회, 난소 절제 (OVX) 마우스에 0.14 mL / 마우스 췌장을 투여하십시오.

2. 프로토콜 II : EXD 함유 세럼의 제조

1. 계산
   1. 각 쥐 ​​(1 개월)의 체중으로 0.15 kg을 사용하여 쥐 - 등가 선량 (RED)을 계산하십시오 : dB = (1/60) * (90/100) * (60 / 0.15) ^1/3 = 0.111 EXD / kg / 일.
      참고 : 100 mL의 배지 (10 % EXD 함유 혈청)를 준비하기 위해 총 10 mL의 EXD 함유 혈청이 필요합니다. 각 쥐는 2 mL의 혈청을 제공해야합니다. 따라서 하루 3 회 EXD 투여를 위해서는 6 마리의 쥐 (20 %의 손실을 감안)가 필요합니다. EXD의 수는 다음과 같습니다 : (0.111 EXD / kg • day) * (0.15 kg / rat) * (6 마리) * (3 일) = 0.300 EXD. 다시, EXD는 이산 증분으로 측정되기 때문에,1 EXD를 사용하십시오.
   2. 쥐 ( 즉, V = (0.111 EXD / kg • day) * (0.15 kg / rat) * (50 mL / EXD) = 0.83 mL / rat • day) 당 적용된 EXD의 부피를 계산합니다.
2. 몸을 담그다
   1. 1 EXD 용 원료를 뚜껑이 달린 용기에 넣으십시오. 생약을 증류수에 1 시간 동안 담가 두십시오. 물은 허브를 약 1 인치까지 덮어야합니다. 모든 허브가 완전히 흡수되도록하십시오.
3. 첫 번째 물 추출
   1. 물이 끓을 때까지 고전력의 유도 밥솥을 사용하여 약초를 가열하십시오 (약 5 ~ 10 분, 시간은 화력, 용기 및 허브와 물의 양에 따라 다릅니다). 2 시간 동안 낮은 끓는 물로 전원을 끕니다.
4. 첫 번째 여과
   1. 일반 여과지 또는 거즈와면을 사용하여 500mL 유리 비이커를 덮으십시오. 조심스럽게 필터를 통해 비누에 달걀을 붓습니다. 컨테이너에 허브를 남겨주세요.
   2. 여과지에있는 생약 잔여 물을 용기에 넣으십시오.
5. 2 차 수분 섭취
   1. 허브와 함께 증류수를 용기에 넣으십시오. 약 1 인치 정도의 약초를 가려야합니다.
   2. 2.4 단계를 반복하십시오.
6. 2 차 여과
   1. 2.5.1 및 2.5.2 단계를 반복하십시오.
   2. 두 번째 달인을 2.4.1 단계에서와 같은 비이커에 붓고 첫 번째와 두 번째 데오스를 함께 섞는다.
7. 집중
   1. 비누를 사이에 석면없는 철사 거즈가 달린 가스 밥솥에 올려 놓고 낮은 끓인 물로 가열하고 유리 막대로 천천히 연속적으로 저어 준다.
   2. 달이기가 100 mL가 될 때까지 100 mL 비이커에 옮긴다.
   3. 달임이 50 mL가 될 때까지 2.7.1 단계를 반복하십시오.
8. 보관 및 관리
   1. 농축 된 달걀을 증기로 옮기십시오.ile 유리 병입니다. 그것을 RT로 식히자. 장기간 보관할 경우 1 주일 이내에 -70 ° C에서 사용하는 경우 4 ° C에서 보관하십시오.
   2. 1 일 1 회, 0.83 mL / 래트를 3 일간 위내에 투여한다.
9. EXD 함유 혈청 제제
   1. EXD의 마지막 투여 후 1 시간에 300mg / 100g의 80mg / kg ketamine과 10mg / kg xylazine을 복강 내 주사하여 쥐를 마취시킨다. 발끝으로 적절한 마취를 확인하십시오.
   2. 메스를 사용하여 쥐의 피부와 복막을 복부에서 흉부 바닥으로 절개하십시오 (또는 가위를 똑바로 세우십시오). 각각 약 5cm와 0.5cm의 길이와 깊이의 절개를 만듭니다. 티슈 페이퍼를 사용하여 복부 내장을 왼쪽으로 움직입니다.
   3. 휴지를 사용하여 복부 대동맥의 결합 조직을 제거하여 혈관을 명확하게 노출시킵니다.
   4. 10 ML, 22 게이지 주사기를 사용하여 복부 대동맥에서 천천히 혈액을 그리십시오. 전송 대상 :바늘을 제거한 후 15mL 멸균 튜브; 한 마리의 쥐가 8-10 mL의 혈액을 생산할 수 있습니다.
      참고 : 쥐는 혈액이 채워지기 시작할 때 ( 즉, 복부 대동맥이 맥박이있는 상태에서) 살아 있어야합니다.
   5. 방 RT에서 30-60 분 동안 똑바로 세워 혈액을 채 웁니다. 20 분 동안 500-600 XG에서 원심 분리기. 조심스럽게 모든 상등액 (혈청)을 50 mL 멸균 튜브 1 개에 넣고 여러 동물의 모든 혈청을 함께 섞으십시오.
   6. 30 분 동안 56 ° C 수조에서 혈청을 배양하여 열 불 활성화를 수행하십시오. 0.22 μm의 공극 크기의 친수성 폴리 에테르 설폰 막을 가진 주사기 필터를 사용하여 혈청을 여과합니다. 신선한 혈청을 사용하거나 -20 ° C에서 보관하십시오.
10. 대조군 약물 함유 혈청 제제 (대조군에서 사용)
    1. 1 일 1 회 3 일 동안 동일한 용량의 생리 식염수 (0.83 mL)로 각 랫트를 투여하십시오. 다른 단계는 2.9 단계와 동일합니다.
11. 신청
    1. EXD 함유 혈청 또는 약물 함유 혈청 10 mL를 각 100 mL의 배지에 첨가하고 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (PS) ^23을 첨가합니다.

결과

EXX가 OVX 마우스의 골밀도에 미치는 영향

요추 척수 절편의 Hematoxylin과 eosin (H & E) 염색은 OVX 군 ( 그림 1A , 왼쪽 패널)과 비교하여 생체 내 EXD 치료 후 증가 된 골소주 ( 그림 1A , 오른쪽 패널)를 보여줍니다. 그림 1B 는 OVX 마우스 ( 그림 1B , 왼쪽 패널)와 EXX 치료 12 주 (

토론

최근 몇 년 동안 동부 지역의 임상 환경에서 수천 년 동안 적용 되어온 대체 의학의 한 유형 인 한약에 많은 관심이 쏟아졌습니다. 전통적인 약초 의학은 현대 의학의 "벤치에서 침대로"패턴과는 달리 처음에는 "bed to bench"패턴을 통해 자신의 메커니즘을 설명해야합니다. 이것은 벤치 단계에서 수행 된 검증과 새로 최적화 된 약물의 개발을위한 처리에 이어 수행 될 수 있습니다. 지?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Curculigo orchioides Gaertn (9 g), Herbaa Epimedii (9 g), Radix Morindae Officinalis (9 g), Radix Angelicae Sinensis (9 g), Cortex Phellodendri (6 g), and Rhizoma Anemarrhenae (6 g)	Kang-qiao Chinese Medicine Yinpian Co. Ltd (Shanghai, CN)	160922	EXD components
Filter paper	GElifesciences	99-103-952	Filter EXD decoction before concentration
Imprinting Control Region (ICR) mice	Shanghai Laboratory Animal Center	SCXK 2007-0005	In vivo study
Sprague Dawley rats	Shanghai Laboratory Animal Center	SCXK 2007-0005	EXD-containing serum preparation
Syringe filter	Millipore	SLGP033RB	0.22 µm
gavage needles (10 ml)	Shanghai BO Ge trade sales department	59104274	Adminstration of EXD
Ketamine (80 mg/kg)	Fujian Gutian Pharma Co. Ltd	H35020148	Anesthesia
Xylazine (10 mg/kg)	Sunway Pharma Co. Ltd	CB07591	Anesthesia
Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco (DMEM) culture medium	Gibco	12800-116	DMEM with 2 mM L-glutamine and without ribonucleosides and ribonucleotides
Streptomycin	Sigma	1277	100 µg / ml
Penicillin	Sigma	4687	100 µg / ml