JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем подготовку эрсианского отвара (EXD) в четыре этапа - вымачивание, отвар, фильтрацию и концентрацию - и демонстрируем введение готовой EXD-содержащей сыворотки крысам. Эти методы применимы к исследованиям in vivo и in vitro травяных отваров, таких как традиционные китайские лекарства.

Аннотация

Традиционная фитотерапия, альтернативная медицина в клинических условиях, получила повышенное внимание в последние годы. Перед доставкой в ​​организм обычно требуется дополнительная процедура экстракции для выделения активных компонентов из сырых трав. Отвар воды - классическая процедура экстракции, которая до сих пор широко используется в клинических условиях. Здесь мы предлагаем подробный протокол для отсасывания er-xian (EXD), чтобы применить травяные отвары к экспериментальным исследованиям. Описывается расчет подходящей для животных дозы, а также четыре основных этапа EXD: вымачивание, отвар воды, фильтрация и концентрация. Кроме того, сыворотку, содержащую EXD, вводят крысам в качестве средства проверки in vitro . Здесь крысам перорально вводили EXD в течение трех дней. Затем образцы крови собирали, инактивировали, центрифугировали и фильтровали. Сыворотка, разбавленная культуральной средой, может быть использована для лечения клеток или тканей в vИтро. Например, EXD применяли как к in vivo, так и in vitro исследованиям и продемонстрировали, что EXD усиливает остеогенез. Этот протокол может использоваться в качестве справочника для подготовки и применения лекарственных трав.

Введение

В настоящее время растет интерес к изучению и применению традиционной фитотерапии. В отличие от современных лекарств, в которых химические ингредиенты являются определенными, растительные формулы имеют некоторые неизвестные ингредиенты и требуют экстракционных процессов, чтобы обеспечить доставку их активных соединений. Хотя многие исследования пытаются выбрать одно небольшое соединение с хорошо известной структурой как представитель всей травы или растительной формулы, ни фармакологическая эффективность, ни механизмы не могут считаться эквивалентными 1 , 2 . В то время как отпечатки пальцев позволяют анализировать составляющие сложных лекарственных препаратов, некоторые составляющие до сих пор неясно анализируются, что приводит к сложной проблеме при объединении всех экстрактов для исследования 3 . Взаимодействие многочисленных компонентов / экстрактов опосредует терапевтические эффекты лекарственных трав. Чтобы сохранить это преимущество, традиционная форма экструзии-decoctИон - все еще широко используется в клинике. Поскольку процедура экстракции оказывает большое влияние на терапевтическую эффективность, необходим стандартный протокол традиционного отвара воды, особенно для исследований in vivo 4 , 5 .

С другой стороны, при исследовании фармакологических механизмов введение травяных отваров во время исследований in vitro или ex vivo также является проблемой. Концепция лекарственно-содержащей сыворотки была впервые предложена Ташино в 1988 году 6 . С тех пор все большее число исследователей применили его к фитотерапии 7 , 8 , 9 . Хотя метод лекарственно-содержащей сыворотки имеет некоторые ограничения, такие как влияние некоторых компонентов сыворотки, он по-прежнему считается методом, который точно имитирует физиологические условия.

Отвар er-xian был разработан в начале 1950-х годов, чтобы облегчить симптомы менопаузы 10 , 11 , 12 , 13 . Он также применяется для лечения апластической анемии 14 , менопаузального остеопороза 15 , 16 , 17 , преждевременной овариальной недостаточности 18 , рака молочной железы 19 , рака яичников 20 и задержки полового созревания 21 . Здесь мы приводим подробные протоколы для подготовки как er-xian decoction (EXD), так и его содержащей лекарственные средства сыворотки. Кроме того, мы описываем применение сыворотки, содержащей EXD и EXD, к моделям остеопороза мышиных менопаузы.

EXD состоит из 9 г каждого из Curculigo orchioides Gaertn , Herbaa Epimedii , Radix Morindae Officinalis и Radix Angelicae Sinensis и 6 г каждого из Cortex Phellodendri и Rhizoma Anemarrhenae на взрослого пациента в день. Эквивалентная доза для мыши составляет 0,1418 EXD / кг / день на основе следующего уравнения 22 : дБ = dA * RB / RA * (WA / WB) 1/3 . ДА и дБ относятся к дозе на вес тела (мг / кг) человека и мыши, соответственно. Доза в мг / кг заменяется на количество EXD / кг. RA и RB представляют собой фактор человеческого тела и фактор тела мыши, соответственно, которые пропорциональны (площадь поверхности тела (м 2 ) / масса тела (кг)) 2/3 (см. Таблицу 1 ). WA и WB указывают вес тела (кг) человека и мыши соответственно.

протокол

Протокол соответствует руководящим принципам ухода за животными в Шанхайском университете традиционной китайской медицины и одобрен экспериментальным комитетом по этике животных в Шанхае.

1. Протокол I: Подготовка EXD

  1. расчет
    1. Администрируйте EXD в группу лечения из 10 шестимесячных мышей Imprinting Control Region (ICR) (0,02 кг / мышь), 5 дней в неделю в течение 12 недель.
      ПРИМЕЧАНИЕ. В общей сложности требуется 1,702 EXD. Поскольку EXD измеряются дискретными приращениями, в реальной практике администрируйте 2 EXD.
    2. Рассчитайте объем EXD, нанесенный на мышь ( т.е. V = (0,1418 EXD / кг • день) * (0,02 кг / мышь) * 50 мл / EXD = 0,14 мл / мышь • день).
  2. намокание
    1. Поместите все исходные материалы двух EXD ( т. Е. Curculigo orchioides Gaertn (18 г), Herbaa Epimedii (18 г), Radix Morindae Officinalis (18 г), RAdix Angelicae Sinensis (18 г), Cortex Phellodendri (12 г) и Rhizoma Anemarrhenae (12 г), всего 96 г) в контейнер с крышкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Рекомендуется использовать керамический контейнер.
    2. Мацевать сырые травы с 500 мл дистиллированной воды в течение 1 часа; Вода должна покрывать травы примерно на дюйм. Пусть все травы полностью впитаются.
  3. Первый отвар воды
    1. Нагрейте травы с помощью газовой плиты или индукционной плиты на высокой мощности до тех пор, пока вода не закипит (около 5 - 10 минут, временной интервал зависит от мощности нагрева, емкости, количества трав и воды). В течение 2 часов отключите питание до низкой температуры.
  4. Первая фильтрация
    1. Накройте стеклянный стакан емкостью 500 мл с обычной фильтровальной бумагой или с марлей и хлопка. Осторожно вылейте отвар в стакан через фильтр. Оставьте травы в контейнере.
    2. Возвратите оставшийся травяной остаток oN фильтровальную бумагу в контейнер.
  5. Второй отвар воды
    1. Добавить дистиллированную воду в контейнер с травами; Пусть он покрывает травы примерно на дюйм.
    2. Повторите шаг 1.3.
  6. Вторая фильтрация
    1. Повторите шаги 1.4.1 и 1.4.2.
    2. Вылейте второй отвар в тот же стакан. Смешайте первый и второй отвары вместе.
  7. концентрация
    1. Поместите стакан на газовую плиту с сеткой из асбеста без проволоки между ними, нагреть отвар с помощью небольшого кипения и медленно и непрерывно перемешать стеклянным стержнем.
    2. Когда отвар уменьшают до 200 мл, перенесите его в 500-мл стакан.
    3. Повторите шаг 1.7.1 до тех пор, пока отвар не уменьшится до 100 мл.
  8. Хранение и администрирование
    1. Перенесите концентрированный отвар в стерильную стеклянную бутылку. Пусть он охлаждается до комнатной температурыRe (RT). Хранить при температуре 4 ° C при использовании в течение одной недели или при -70 ° C для длительного хранения.
    2. Используя иглу для желудка, вводите 0,14 мл / мышь отвара мышам с овариэктомией (OVX) один раз в день, 5 дней в неделю в течение 12 недель.

2. Протокол II: Получение EXD-содержащей сыворотки

  1. расчет
    1. Рассчитайте эквивалентную дозу крысы (RED), используя 0,15 кг в качестве массы тела каждой крысы (1 месяц): дБ = (1/60) * (90/100) * (60 / 0,15) 1/3 = 0,111 EXD / кг / сут.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Для приготовления 100 мл культуральной среды (10% EXD-содержащей сыворотки) требуется 10 мл сыворотки, содержащей EXD. Ожидается, что каждая крыса будет содержать 2 мл сыворотки. Таким образом, 6 крыс (20% потерь принимается во внимание) необходимы для приема EXD один раз в день в течение 3 дней. Количество EXD: (0.111 EXD / кг • день) * (0,15 кг / крыса) * (6 крыс) * (3 дня) = 0,300 EXD. Опять же, поскольку EXD измеряются дискретными приращениями,Используйте 1 EXD.
    2. Рассчитайте объем EXD, нанесенного на крысу ( т. Е. V = (0.111 EXD / кг • день) * (0,15 кг / крыса) * (50 мл / EXD) = 0,83 мл / крыса • день).
  2. намокание
    1. Поместите сырье для 1 EXD в контейнер с крышкой. Мацевать сырые травы в дистиллированной воде в течение 1 часа; Вода должна покрывать травы примерно на дюйм. Пусть все травы полностью впитаются.
  3. Первый отвар воды
    1. Нагрейте травы, используя индукционную плиту на высокой мощности до тех пор, пока вода не закипит (около 5-10 минут, временной интервал зависит от тепловой мощности, емкости, количества трав и воды). Поверните питание до низкого кипячения в течение 2 часов.
  4. Первая фильтрация
    1. Накройте стеклянный стакан емкостью 500 мл с обычной фильтровальной бумагой или с марлей и хлопка. Осторожно вылейте отвар в стакан через фильтр. Оставьте травы в контейнере.
    2. Верните травяной остаток на фильтровальную бумагу в контейнер.
  5. Второй отвар воды
    1. Добавить дистиллированную воду в контейнер с травами; Пусть он покрывает травы примерно на дюйм.
    2. Повторите шаг 2.4.
  6. Вторая фильтрация
    1. Повторите шаги 2.5.1 и 2.5.2.
    2. Вылейте второй отвар в тот же стакан, что и на шаге 2.4.1, и смешайте первый и второй отвары вместе.
  7. концентрация
    1. Поместите стакан на газовую плиту с сеткой из асбеста без проволоки между ними, нагреть отвар с помощью небольшого кипения и медленно и непрерывно перемешать стеклянным стержнем.
    2. Когда отвар уменьшает до 100 мл, переведите его в стакан емкостью 100 мл.
    3. Повторите шаг 2.7.1, пока отвар не уменьшится до 50 мл.
  8. Хранение и администрирование
    1. Перенос концентрированного отвара в стерильныйIle стеклянная бутылка. Пусть он охлаждается до RT. Хранить при температуре 4 ° C при использовании в течение одной недели или при -70 ° C для длительного хранения.
    2. Внутрижелудочно вводить 0,83 мл / крысу один раз в день в течение 3 дней.
  9. EXD-содержащий сывороточный препарат
    1. Анестезируйте крыс путем внутрибрюшинного введения 300 мл / 100 г 80 мг / кг кетамина и 10 мг / кг ксилазина через 1 час после последнего введения EXD. Подтвердите правильную анестезию пальцем.
    2. Сожмите кожу и брюшину крысы от живота до нижней части грудной клетки, используя скальпель (или прямые операционные ножницы). Создайте разрез длиной и глубиной около 5 см и 0,5 см соответственно. Переместите брюшные внутренние органы в левую сторону, используя салфетку.
    3. Используя салфетку, удалите соединительную ткань брюшной аорты, чтобы четко разоблачить сосуд.
    4. Нанесите кровь медленно из брюшной аорты с помощью шприца с размерами 10 мл, 22 калибра. Передайте его15 мл стерильной трубки после удаления иглы; Одна крыса может продуцировать 8-10 мл крови.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Крыса должна быть живой ( т. Е. При пульсации брюшной аорты), когда начинается рисование крови и мертвые после завершения рисунка.
    5. Сгустите кровь в вертикальном положении в течение 30-60 мин в помещении RT. Центрифуга при 500-600 мкг в течение 20 мин. Осторожно поместите весь супернатант (сыворотку) в одну стерильную пробирку на 50 мл и смешайте всю сыворотку (от разных животных) вместе.
    6. Выполните инактивацию тепла, инкубируя сыворотку в водяной бане с температурой 56 ° C в течение 30 мин. Отфильтруйте сыворотку с помощью шприцевого фильтра с гидрофильной полиэфирсульфоновой мембраной размера пор 0,22 мкм. Используйте сыворотку свежей или хранить ее при -20 ° C.
  10. Контролирующее лекарственное средство, содержащее сыворотку (используемое в контрольной группе)
    1. Администрируйте каждую крысу с тем же объемом физиологического раствора (0,83 мл) один раз в день в течение 3 дней. Другие шаги такие же, как на шаге 2.9.
  11. заявка
    1. Добавьте 10 мл сыворотки, содержащей EXD, или содержащую лекарственное средство сыворотку в каждую 100 мл среды, плюс 1% пенициллина-стрептомицина (PS) 23 .

Результаты

Эффект EXD на плотность костей мышей OVX

Гематоксилин и эозин (H & E) окрашивание поясничного отдела позвонков показывает увеличенные костные трабекулы после обработки EXD in vivo ( рис. 1A , правая панель) по сравнению с групп?...

Обсуждение

В последние годы больше внимания уделяется травяным лекарствам, одним из видов альтернативной медицины, которые применялись в клинических условиях в Восточном мире в течение тысяч лет. В отличие от «современной скамьи на кровать» современной медицины, традиционная травяная медицина ...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным научным фондом Китая (81573992). Мы благодарим Эмили К. Ло и Кэтлин ДиНаполи за помощь в редактировании языка.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Curculigo orchioides Gaertn (9 g), Herbaa Epimedii (9 g), Radix Morindae Officinalis (9 g), Radix Angelicae Sinensis (9 g), Cortex Phellodendri (6 g), and Rhizoma Anemarrhenae (6 g)Kang-qiao Chinese Medicine Yinpian Co. Ltd (Shanghai, CN)160922EXD components
Filter paperGElifesciences99-103-952Filter EXD decoction before concentration
Imprinting Control Region (ICR) miceShanghai Laboratory Animal CenterSCXK 2007-0005In vivo study
Sprague Dawley ratsShanghai Laboratory Animal CenterSCXK 2007-0005EXD-containing serum preparation
Syringe filterMilliporeSLGP033RB0.22 µm
gavage needles (10 ml)Shanghai BO Ge trade sales department59104274Adminstration of EXD
Ketamine (80 mg/kg) Fujian Gutian Pharma Co. LtdH35020148Anesthesia
Xylazine (10 mg/kg)Sunway Pharma Co. LtdCB07591Anesthesia
Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco (DMEM) culture mediumGibco12800-116DMEM with 2 mM L-glutamine and without ribonucleosides and ribonucleotides
StreptomycinSigma1277100 µg / ml
PenicillinSigma4687100 µg / ml

Ссылки

  1. Zhang, L. G., Ouyang, X. W., Wu, T. T., Ni, L. J., Shi, W. Z. Quantitative evaluation of in vitro effects and interactions of active fractions in a Chinese medicinal formula (Yaotongning Capsule) on rat chondrocytes. J Ethnopharmacol. 155 (3), 1424-1432 (2014).
  2. Ogawa, Y., Fujii, Y., Sugiyama, R., Konishi, T. The role of the seven crude drug components in the sleep-promoting effect of Yokukansan. J Ethnopharmacol. 177, 19-27 (2016).
  3. Kim, J. H., Doh, E. J., Lee, G. Evaluation of Medicinal Categorization of Atractylodes japonica Koidz. by Using Internal Transcribed Spacer Sequencing Analysis and HPLC Fingerprinting Combined with Statistical Tools. Evid Based Complement Alternat Med. 2016, 2926819 (2016).
  4. Sheridan, H., et al. The potential of metabolic fingerprinting as a tool for the modernisation of TCM preparations. J Ethnopharmacol. 140 (3), 482-491 (2012).
  5. Planas, G. M., Kucacute, J. Contraceptive Properties of Stevia rebaudiana. Science. 162 (3857), 1007 (1968).
  6. Tashino, S. "Serum pharmacology" and "serum pharmaceutical chemistry": from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Ther Drug Monit Res. 5, 54-64 (1988).
  7. Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha-induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Exp Ther Med. 8 (3), 998-1004 (2014).
  8. Fu, L., et al. Ex Vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evid Based Complement Alternat Med. 2016, 7380439 (2016).
  9. Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chin J Integr Med. 20 (6), 450-455 (2014).
  10. Sze, S. C., et al. A novel mechanism: Erxian Decoction, a Chinese medicine formula, for relieving menopausal syndrome. J Ethnopharmacol. 123 (1), 27-33 (2009).
  11. Sze, S. C., et al. Effects of Erxian decoction, a Chinese medicinal formulation, on serum lipid profile in a rat model of menopause. Chin Med. 6, 40 (2011).
  12. Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
  13. Wang, S. W., et al. Steroidogenic effect of Erxian decoction for relieving menopause via the p-Akt/PKB pathway in vitro and in vivo. J Ethnopharmacol. , (2016).
  14. Lin, L., Wu, S., Tang, J. [Clinical observation and experimental study of the treatment of aplastic anemia by warming and tonifying the spleen and kidney]. Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 10 (5), 272-274 (1990).
  15. Nian, H., et al. Antiosteoporotic activity of Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, in ovariectomized rats. J Ethnopharmacol. 108 (1), 96-102 (2006).
  16. Qin, L., et al. Antiosteoporotic chemical constituents from Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula. J Ethnopharmacol. 118 (2), 271-279 (2008).
  17. Xue, L., et al. A HNMR-based metabonomics study of postmenopausal osteoporosis and intervention effects of Er-Xian Decoction in ovariectomized rats. Int J Mol Sci. 12 (11), 7635-7651 (2011).
  18. Lu, X. N., Xu, X. R., Lin, L. J. [Clinical observation of bushen er'xian decoction in treating premature ovarian failure]. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 28 (7), 594-596 (2008).
  19. Yu, X., et al. Anti-angiogenic activity of Erxian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, in zebrafish. Biol Pharm Bull. 35 (12), 2119-2127 (2012).
  20. Chu, E. S., et al. An in vitro and in vivo investigation of the antimetastatic effects of a Chinese medicinal decoction, erxian decoction, on human ovarian cancer models. Integr Cancer Ther. 12 (4), 336-346 (2013).
  21. Zhu, Z., Li, L., Jin, X., Fang, J., Zhang, D. Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, intervening early in hypothalamic-pituitary axis of male rats with delayed puberty. Pharmacogn Mag. 10 (40), 517-521 (2014).
  22. Miao, M. S. . Experimental animals and technology. 1997, 145 (1997).
  23. Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
  24. Lu, S., Huang, J., Wang, J., et al. Er-Xian Decoction Stimulates Osteoblastic Differentiation of Bone Mesenchymal Stem Cells in Ovariectomized Mice and Its Gene Profile Analysis. Stem Cells International. 2016, 4079210 (2016).
  25. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  26. Wu, C., et al. Simultaneous determination of seven flavonoids in dog plasma by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and its application to a bioequivalence study of bioactive components in Herba Epimedii and Er-Xian Decoction. J Pharm Biomed Anal. 54 (1), 186-191 (2011).
  27. Hu, Y. M., et al. Identification of the major chemical constituents and their metabolites in rat plasma and various organs after oral administration of effective Erxian Decoction (EXD) fraction by liquid chromatography-mass spectrometry. Biomed Chromatogr. 24 (5), 479-489 (2010).
  28. Xue, L., et al. Effects and interaction of icariin, curculigoside, and berberine in er-xian decoction, a traditional chinese medicinal formula, on osteoclastic bone resorption. Evid Based Complement Alternat Med. , (2012).
  29. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. J Basic Clin Pharm. 7 (2), 27-31 (2016).
  30. Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. Int J Clin Exp Med. 8 (2), 1768-1779 (2015).
  31. Li, Z., Wang, J. On the methods for Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Guo Zhong Yi Yao Xing Xi Za Zhi. 9 (2), 5-6 (2002).
  32. Jiang, Y. R., et al. Effect of chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors' expression in endothelial cells. Chin J Integr Med. 18 (1), 30-33 (2012).
  33. Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. [Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway]. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
  34. Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
  35. Li, Y. K. [Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology]. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
  36. Zhang, L., et al. [A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study]. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
  37. Zhang, D. [Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology]. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

123er xianIn vivoIn vitro

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены