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Resumo

Aqui, apresentamos a preparação de uma decocção er-xian (EXD) em quatro etapas - imersão, decocção, filtração e concentração - e demonstram a administração de um soro contendo EXD preparado para ratos. Estes métodos são aplicáveis ​​ao estudo in vivo e in vitro de decocções à base de plantas, como medicamentos tradicionais chineses.

Resumo

A medicina tradicional à base de plantas, uma medicina alternativa no cenário clínico, recebeu atenção crescente nos últimos anos. Antes da entrega ao corpo, um procedimento de extração adicional é comumente requerido para liberar os constituintes ativos das ervas cruas. A decocção de água é um procedimento de extração clássico que ainda é amplamente utilizado nas configurações clínicas. Aqui, propomos um protocolo detalhado para a decocção er-xian (EXD), a fim de aplicar decocções à base de plantas para estudos experimentais. O cálculo de uma dose apropriada para animais é descrito, bem como os quatro passos principais de EXD: imersão, decocção de água, filtração e concentração. Além disso, o EXD contendo soro é introduzido em ratos como meio de validação in vitro . Aqui, os ratos foram administrados oralmente EXD por três dias. As amostras de sangue foram então recolhidas, inactivadas, centrifugadas e filtradas. O soro, diluído com o meio de cultura, pode ser utilizado para tratar células ou tecidos em vItro. Por exemplo, EXD foi aplicado tanto em estudos in vivo como in vitro e demonstrou que o EXD melhora a osteogênese. Este protocolo pode ser usado como referência para a preparação e aplicação de medicamentos à base de plantas.

Introdução

O interesse no estudo e na aplicação de ervas medicinais tradicionais está crescendo atualmente. Ao contrário das drogas modernas, nas quais os ingredientes químicos são definitivos, as fórmulas à base de plantas possuem alguns ingredientes desconhecidos e requerem processos de extração para permitir a entrega de seus compostos ativos. Embora muitos estudos tentam selecionar um composto pequeno com uma estrutura bem conhecida como representante da erva inteira ou fórmula herbal, nem as eficiências farmacológicas nem os mecanismos podem ser considerados equivalentes 1 , 2 . Embora as impressões digitais permitam a análise dos constituintes de fórmulas ervas complexas, alguns constituintes ainda não são claramente analisados, levando a um desafio ao combinar todos os extratos para o estudo 3 . As interações de vários constituintes / extratos medeiam os efeitos terapêuticos das ervas medicinais. Para manter essa vantagem, o extrato tradicional decoctaIon - ainda é amplamente utilizado na clínica. Uma vez que o procedimento de extração tem um grande impacto sobre a eficácia terapêutica, é necessário um protocolo padrão de decocção de água tradicional, especialmente para estudos in vivo 4 , 5 .

Por outro lado, ao explorar mecanismos farmacológicos, a administração de decocções de ervas durante estudos in vitro ou ex vivo também é um desafio. O conceito de soro contendo drogas foi proposto pela primeira vez por Tashino em 1988 6 . Desde então, um número crescente de pesquisadores aplicou-o à medicina herbal 7 , 8 , 9 . Embora o método do soro contendo fármaco tenha algumas limitações, como a influência de certos componentes do soro, ainda é considerado um método que imita de perto as condições fisiológicas.

A decocção er-xian foi desenvolvida no início dos anos 50 para aliviar os sintomas da menopausa 10 , 11 , 12 , 13 . Também foi aplicado ao tratamento de anemia aplástica 14 , osteoporose menopausa 15 , 16 , 17 , insuficiência ovariana prematura 18 , câncer de mama 19 , câncer de ovário 20 e puberdade retardada 21 . Aqui, apresentamos protocolos detalhados para a preparação da decocção er-xian (EXD) e do seu soro contendo fármaco. Além disso, descrevemos a aplicação de EXD e EXD contendo soro para modelos osteoporóticos da menopausa murina.

Um EXD é composto por 9 g de cada um de Curculigo Orchioides Gaertn , Herbaa Epimedii , Radix Morindae Officinalis e Radix Angelicae Sinensis e 6 g de Cortex Phellodendri e Rhizoma Anemarrhenae por paciente adulto por dia. A dose equivalente para um mouse é 0.1418 EXD / kg / dia com base na seguinte equação 22 : dB = dA * RB / RA * (WA / WB) 1/3 . DA e dB referem-se à dose por peso corporal (mg / kg) do ser humano e do mouse, respectivamente. A dose, em mg / kg, é substituída pelo número de EXD / kg. RA e RB representam o fator do corpo humano e o fator do corpo do mouse, respectivamente, que são proporcionais à (área de superfície do corpo (m 2 ) / peso corporal (kg)) 2/3 (ver Tabela 1 ). WA e WB indicam o peso corporal (kg) do humano e do mouse, respectivamente.

Protocolo

O protocolo segue as diretrizes de cuidados com os animais da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai e é aprovado pelo experimento animal Comitê de Ética Animal de Xangai.

1. Protocolo I: Preparação do EXD

  1. Cálculo
    1. Administrar o EXD a um grupo de tratamento de 10 camundongos de região de controle de Imprinting Control (ICR) de seis meses de idade (0,02 kg / mouse), 5 dias por semana durante 12 semanas.
      NOTA: Um total de 1,702 EXDs são necessários. Como os EXDs são medidos em incrementos discretos, na prática real, administre 2 EXDs.
    2. Calcule o volume de EXD aplicado por mouse ( ou seja, V = (0.1418 EXD / kg • dia) * (0.02 kg / mouse) * 50 mL / EXD = 0.14 mL / rato • dia).
  2. Embebendo
    1. Coloque todas as matérias-primas de dois EXDs ( ou seja, Curculigo orchioides Gaertn (18 g), Herbaa Epimedii (18 g), Radix Morindae Officinalis (18 g), RAdix Angelicae Sinensis (18 g), Cortex Phellodendri (12 g) e Rhizoma Anemarrhenae (12 g), 96 g no total) em um recipiente com uma tampa.
      NOTA: Recomenda-se um recipiente de cerâmica.
    2. Macerar as ervas em bruto com 500 mL de água destilada durante 1 h; A água deve cobrir as ervas em cerca de uma polegada. Deixe todas as ervas mergulharem completamente.
  3. Primeira decocção de água
    1. Aqueça as ervas usando um fogão a gás ou um fogão de indução com alta potência até que a água ferva (cerca de 5 a 10 min, o tempo depende da potência de aquecimento, do recipiente e da quantidade de ervas e água). Desligue o poder para um ferver baixo durante 2 h.
  4. Primeira filtração
    1. Cubra um copo de vidro de 500 ml com papel de filtro regular ou com gaze e algodão. Retire cuidadosamente a decocção no copo através do filtro. Deixe as ervas no recipiente.
    2. Retornar o restante resíduo de plantasN o papel de filtro para o recipiente.
  5. Segunda decocção de água
    1. Adicione água destilada ao recipiente com as ervas; Deixe cobrir as ervas por cerca de uma polegada.
    2. Repita o passo 1.3.
  6. Segunda filtração
    1. Repita as etapas 1.4.1 e 1.4.2.
    2. Despeje a segunda decocção no mesmo copo. Misture a primeira e a segunda decocções juntas.
  7. Concentração
    1. Coloque o copo em um fogão a gás com uma gaze de arame sem amianto entre eles, aqueça a decocção com um fogo baixo e misture lentamente e continuamente com uma barra de vidro.
    2. Quando a decocção se reduz a 200 mL, transfira-a para um copo de 500 mL.
    3. Repita o passo 1.7.1 até a decocção reduzir para 100 mL.
  8. Armazenamento e administração
    1. Transfira a decocção concentrada para uma garrafa de vidro estéril. Deixe esfriar no quarto temperatuRe (RT). Armazenar a 4 ° C se estiver usando dentro de uma semana ou a -70 ° C para armazenamento a longo prazo.
    2. Usando uma agulha de gavagem, administre 0,14 mL / rato da decocção a ratinhos ovariectomizados (OVX) uma vez por dia, 5 dias por semana durante 12 semanas.

2. Protocolo II: Preparação de soro contendo EXD

  1. Cálculo
    1. Calcule a dose de equivalente de rato (ROV) usando 0,15 kg como o peso corporal de cada rato (1 mês de idade): dB = (1/60) * (90/100) * (60 / 0.15) 1/3 = 0.111 EXD / Kg / dia.
      NOTA: Um total de 10 mL de soro contendo EXD é necessário para preparar 100 mL de meio de cultura (10% de soro contendo EXD). Espera-se que cada rato forneça 2 mL de soro. Assim, 6 ratos (uma perda de 20% é levada em consideração) são necessários para a administração EXD uma vez por dia durante 3 dias. O número de EXDs é: (0.111 EXD / kg • dia) * (0.15 kg / rato) * (6 ratos) * (3 dias) = ​​0.300 EXD. Novamente, porque os EXDs são medidos em incrementos discretos,Use 1 EXD.
    2. Calcule o volume de EXD aplicado por rato ( ou seja, V = (0.111 EXD / kg • dia) * (0.15 kg / rato) * (50 mL / EXD) = 0.83 mL / rato • dia).
  2. Embebendo
    1. Coloque as matérias-primas para 1 EXD em um recipiente com uma tampa. Macerar as ervas em bruto em água destilada durante 1 h; A água deve cobrir as ervas em cerca de uma polegada. Deixe todas as ervas mergulharem completamente.
  3. Primeira decocção de água
    1. Aqueça as ervas usando um fogão de indução com alta potência até que a água ferva (cerca de 5 a 10 min, o tempo depende da energia do calor, do recipiente e da quantidade de ervas e água). Desligue a alimentação para um fogo baixo durante 2 h.
  4. Primeira filtração
    1. Cubra um copo de vidro de 500 ml com papel de filtro regular ou com gaze e algodão. Retire cuidadosamente a decocção no copo através do filtro. Deixe as ervas no recipiente.
    2. Retornar o resíduo de ervas no papel de filtro para o recipiente.
  5. Segunda decocção de água
    1. Adicione água destilada ao recipiente com as ervas; Deixe cobrir as ervas por cerca de uma polegada.
    2. Repita a etapa 2.4.
  6. Segunda filtração
    1. Repita as etapas 2.5.1 e 2.5.2.
    2. Despeje a segunda decocção no mesmo copo como no passo 2.4.1 e misture a primeira e a segunda decocções juntas.
  7. Concentração
    1. Coloque o copo em um fogão a gás com uma gaze de arame isenta de amianto entre eles, aquecer a decocção usando um fogo baixo e agitar lenta e continuamente com uma barra de vidro.
    2. Quando a decocção se reduz a 100 mL, transfira-a para um copo de 100 mL.
    3. Repita o passo 2.7.1 até a decocção reduzir para 50 mL.
  8. Armazenamento e administração
    1. Transfira a decocção concentrada para um esterGarrafa de vidro. Deixe esfriar para RT. Armazenar a 4 ° C se estiver usando dentro de uma semana ou a -70 ° C para armazenamento a longo prazo.
    2. Administre intragástricamente 0,83 ml / rato uma vez por dia durante 3 dias.
  9. Preparação de soro contendo EXD
    1. Anestesiar os ratos por injeção intraperitoneal de 300 mL / 100 g de 80 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de xilazina às 1 h após a última administração de EXD. Confirme a anestesia apropriada por pressão do dedo do pé.
    2. Incentive a pele e o peritoneo do rato do abdômen até o fundo do tórax usando um bisturi (ou tesoura de ação direta). Crie uma incisão de comprimento e profundidade de cerca de 5 cm e 0,5 cm, respectivamente. Mova as vísceras abdominais para a esquerda usando papel de seda.
    3. Usando papel de seda, remova o tecido conjuntivo da aorta abdominal para expor claramente o vaso.
    4. Desenhe o sangue lentamente da aorta abdominal usando uma seringa de calibre 22 de 10 mL. Transfira paraUm tubo estéril de 15 mL após a remoção da agulha; Um rato pode produzir 8-10 mL de sangue.
      NOTA: O rato deve estar vivo ( ou seja, com a pulsação da aorta abdominal pulsante) ao iniciar o desenho do sangue e morto após o desenho completar.
    5. Coote o sangue em posição vertical durante 30 a 60 min na RT da sala. Centrifugar a 500-600 xg por 20 min. Coloque cuidadosamente todo o sobrenadante (soro) em um tubo estéril de 50 ml e misture todo o soro (de diferentes animais) juntos.
    6. Realize a inativação do calor incubando o soro em um banho de água a 56 ° C durante 30 min. Filtra o soro usando um filtro de seringa com uma membrana hidrófila de poliéter sulfona de tamanho de poro de 0,22 μm. Use o soro fresco ou guarde-o a -20 ° C.
  10. Controle a preparação de soro contendo fármaco (usada no grupo controle)
    1. Administrar cada rato com o mesmo volume de solução salina (0,83 mL) uma vez por dia durante 3 dias. Os outros passos são os mesmos que no passo 2.9.
  11. Aplicação
    1. Adicione 10 mL de soro contendo EXD ou soro contendo fármaco para cada 100 mL de meio, mais 1% de penicilina-estreptomicina (PS) 23 .

Resultados

O efeito de EXD sobre a densidade óssea de camundongos OVX

A coloração com hematoxilina e eosina (H & E) da vértebra lombar mostra aumento da trabécula óssea após o tratamento com EXD in vivo ( Figura 1A , painel direito) em comparação com os do grupo OVX ( Figura 1A , painel esquerdo). A Figura 1B mostra as imagens μCT representativas do 4º lom...

Discussão

Nos últimos anos, tem sido dada mais atenção às ervas medicinais, um tipo de medicina alternativa que foi aplicada no cenário clínico no mundo oriental há milhares de anos. Diferente do padrão de "banco para cama" da medicina moderna, a medicina herbal tradicional exige primeiro o padrão de "cama a bancada" para explicar seus mecanismos. Isso pode ser seguido de validação realizada no estágio do banco e processamento para o desenvolvimento de novos medicamentos otimizados. Até agora, exi...

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (81573992). Agradecemos a Emily K. Lo e Kathleen DiNapoli pela assistência de edição de idiomas.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Curculigo orchioides Gaertn (9 g), Herbaa Epimedii (9 g), Radix Morindae Officinalis (9 g), Radix Angelicae Sinensis (9 g), Cortex Phellodendri (6 g), and Rhizoma Anemarrhenae (6 g)Kang-qiao Chinese Medicine Yinpian Co. Ltd (Shanghai, CN)160922EXD components
Filter paperGElifesciences99-103-952Filter EXD decoction before concentration
Imprinting Control Region (ICR) miceShanghai Laboratory Animal CenterSCXK 2007-0005In vivo study
Sprague Dawley ratsShanghai Laboratory Animal CenterSCXK 2007-0005EXD-containing serum preparation
Syringe filterMilliporeSLGP033RB0.22 µm
gavage needles (10 ml)Shanghai BO Ge trade sales department59104274Adminstration of EXD
Ketamine (80 mg/kg) Fujian Gutian Pharma Co. LtdH35020148Anesthesia
Xylazine (10 mg/kg)Sunway Pharma Co. LtdCB07591Anesthesia
Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco (DMEM) culture mediumGibco12800-116DMEM with 2 mM L-glutamine and without ribonucleosides and ribonucleotides
StreptomycinSigma1277100 µg / ml
PenicillinSigma4687100 µg / ml

Referências

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