漢方薬の準備：Er-Xian煎じ薬とEr-Xian含有血清<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;実験

要約

ここでは、浸漬、煎出、ろ過、および濃縮の4段階でerxian decoction（EXD）の準備を行い、準備したEXD含有血清のラットへの投与を実証する。これらの方法は、伝統的な漢方薬などの薬草煎じ薬のin vivoおよびin vitro研究に適用可能である。

要約

近年、臨床現場での代替薬である伝統的な漢方薬が注目されています。身体に送達する前に、生薬から活性成分を放出するためには、一般的に追加の抽出手順が必要である。水煎出は、臨床の場で広く使用されている古典的な抽出手順です。ここでは、薬草煎じ薬を実験研究に適用するために、エキソ煎じ薬（EXD）の詳細なプロトコルを提案する。 EXDの主要な4つのステップ（浸漬、水煎出、濾過、濃縮）と同様に、動物に適した投与量の計算が記載されています。さらに、血清含有EXDをインビトロでの検証の手段としてラットに導入する。ここでは、ラットにEXDを3日間経口投与した。次いで、血液サンプルを収集し、不活性化し、遠心分離し、濾過した。培養培地で希釈した血清を用いて、細胞または組織をvitro。例えば、EXDはインビボおよびインビトロ研究の両方に適用され、EXDが骨形成を増強することが実証された。このプロトコールは、漢方薬の調製および応用の参考として用いることができる。

概要

伝統的な漢方薬の研究と応用に関心が高まっています。化学成分が明確な現代薬とは対照的に、ハーブ処方には未知の成分があり、活性成分の送達を可能にするために抽出プロセスが必要です。多くの研究は、ハーブまたはハーブの処方全体の代表として、よく知られている構造を持つ1つの小さな化合物を選択しようとしていますが、薬理学的有効性やメカニズムは同等ではありません^1,2 。フィンガープリンティングは複雑な漢方式の構成成分の分析を可能にするが、一部の成分は依然として明確に分析されていないため、研究^3のすべての抽出物を組み合わせる際に問題が生じる。多数の成分/抽出物の相互作用は、漢方薬の治療効果を媒介する。この利点を保持するために、伝統的な抽出物の形態イオンは、依然として診療所で広く使用されています。抽出手順は治療効果に大きな影響を与えるため、特にインビボ研究では、伝統的な水煎出の標準プロトコールが必要である4,5。

他方、薬理学的機構を調べる場合、 インビトロまたはエクスビボの研究中の薬草煎じ薬の投与も課題である。薬物含有血清の概念は、1988年にTashinoによって最初に提案された⁶ 。それ以来、数多くの研究者が漢方薬に適用しています7,8,9。薬物含有血清の方法は、血清の特定の成分の影響などのいくつかの制限があるが、依然として生理学的条件を厳密に模倣する方法であると考えられている。

er-xian煎薬は、更年期症状10,11,12,13を緩和するために1950年代初期に開発されました。また、再生不良性貧血¹⁴ 、閉経骨粗鬆症15,16,17、早期卵巣不全¹⁸ 、乳癌¹⁹ 、卵巣癌²⁰ 、思春期遅発^21の治療にも適用されています。ここでは、エラシアン煎剤（EXD）とその薬物含有血清の両方の調製のための詳細なプロトコールを提示する。加えて、我々は、ネズミ更年期骨粗鬆症モデルに対するEXDおよびEXD含有血清の適用を記載する。

EXDは、 9gのCurculigo orchioides Gaertn 、 Herba Epimedii 、 Radix Morindae Officinalis 、 Radix Angelicae Sinensis 、 Cortex PhellodendriおよびRhizoma Anemarrhenaeそれぞれ6gを 1日当たりに投与する。マウスの等価線量は、以下の式²²に基づいて0.1418EXD / kg /日である。dB = dA * RB / RA *（WA / WB） ^1/3 。 dAおよびdBは、それぞれ、ヒトおよびマウスの体重当たりの用量（mg / kg）を示す。用量は、mg / kgで、EXD / kgの数で置き換えられる。 RAおよびRBは、（体表面積（m ² ）/体重（kg）） ^2/3 （ 表1参照）に比例するヒト身体因子およびマウス体係数をそれぞれ表す。 WAおよびWBは、それぞれヒトおよびマウスの体重（kg）を示す。

プロトコル

このプロトコルは上海漢方医学の動物飼育指針に従っており、動物実験上海動物倫理委員会の承認を受けています。

1.プロトコルI：EXDの調製

1. 計算
   1. 6ヵ月齢の女性刷本管理領域（ICR）マウス（0.02kg /マウス）10匹の治療群にEXDを投与し、1週間あたり5日間12週間投与する。
      注：合計1.702 EXDが必要です。 EXDは離散的な増分で測定されるため、実際には2つのEXDを管理します。
   2. マウス1匹につき適用されるEXDの量を計算する（ すなわち、 V =（0.1418 EXD / kg・日）*（0.02kg /マウス）* 50mL / EXD = 0.14mL /マウス・日）。
2. 浸漬
   1. 2つのEXDのすべての原材料（ すなわち、Curculigo orchioides Gaertn （18g）、 Herba Epimedii （18g）、 Radix Morindae Officinalis （18g）、 R（18g）、 Cortex Phellodendri （12g）、 Rhizoma Anemarrhenae （12g）、合計96g）を蓋付き容器に入れた。
      注：セラミック容器を推奨します。
   2. 生ハーブを500mLの蒸留水で1時間洗浄します。水はハーブを約1インチ覆うべきです。すべてのハーブを徹底的に浸しましょう。
3. 最初の水の煎じ薬
   1. 水が沸騰するまで（約5〜10分;加熱時間、容器、およびハーブと水の量に依存します）、ガス炊飯器または誘導加熱調理器を使用してハーブを高熱で加熱します。低煮沸の電源を2時間倒します。
4. 最初のろ過
   1. 定期的なろ紙またはガーゼと綿で500 mLガラスビーカーを覆う。フィルターを通して、煎じ薬を慎重にビーカーに注ぎます。容器にハーブを残す。
   2. 残った薬草残渣を返す容器にろ紙を移す。
5. 2回目の水煎じ
   1. ハーブで蒸留水を容器に加えます。ハーブを約1インチ覆うようにしましょう。
   2. 手順1.3を繰り返します。
6. 二次ろ過
   1. ステップ1.4.1と1.4.2を繰り返します。
   2. 2回目の煎じ薬を同じビーカーに注ぎます。 1回目と2回目の煎じ薬を混ぜる。
7. 濃度
   1. ビーカーをアスベストフリーのワイヤーガーゼを挟んでガス炊飯器の上に置き、低煮沸器で加熱し、ガラス棒でゆっくりと連続的に攪拌する。
   2. 煎剤が200 mLになったら、500 mLのビーカーに移す。
   3. 煎じ薬が100mLになるまでステップ1.7.1を繰り返します。
8. 保管と管理
   1. 濃縮した煎じ薬を滅菌ガラス瓶に移す。それは室温に冷やしてみましょう再（RT）。 1週間以内に使用する場合は4℃で、長期間保存する場合は-70℃で保管してください。
   2. 強制栄養針を用いて、1日1回、1週間に5日、12週間、卵巣摘出（OVX）マウスに煎じ薬0.14mL /マウスを投与する。

2.プロトコルII：EXD含有血清の調製

1. 計算
   1. 各ラット（1ヶ月齢）の体重として0.15kgを用いて、ラット相当用量（RED）を計算する：dB =（1/60）*（90/100）*（60 / 0.15） ^1/3 = 0.111 EXD / kg /日。
      注：100mLの培地（10％EXD含有血清）を調製するためには、合計10mLのEXD含有血清が必要です。各ラットは2mLの血清を提供すると予想される。したがって、EXD投与には1日1回3日間、6匹のラット（20％の損失を考慮する）が必要である。 EXDの数は、（0.111 EXD / kg・日）*（0.15kg /ラット）*（6匹のラット）*（3日）= 0.300 EXD。再び、EXDは離散的な増分で測定されるので、1 EXDを使用します。
   2. ラット（ すなわち、 V =（0.111 EXD / kg・日）*（0.15kg /ラット）*（50mL / EXD）= 0.83mL /ラット・日）に適用されるEXDの容量を計算する。
2. 浸漬
   1. 1 EXD用の原料を蓋付き容器に入れます。生ハーブを蒸留水に1時間浸します。水はハーブを約1インチ覆うべきです。すべてのハーブを徹底的に浸しましょう。
3. 最初の水の煎じ薬
   1. 水が沸騰するまで（約5〜10分;時間は熱出力、容器、およびハーブと水の量に依存します）、誘導加熱器を高出力で使用してハーブを加熱します。電源を2時間低煮沸にします。
4. 最初のろ過
   1. 定期的なろ紙またはガーゼと綿で500 mLガラスビーカーを覆う。フィルターを通して、煎じ薬を慎重にビーカーに注ぎます。容器にハーブを残す。
   2. ろ紙上のハーブ残渣を容器に戻します。
5. 2回目の水煎じ
   1. ハーブで蒸留水を容器に加えます。ハーブを約1インチ覆うようにしましょう。
   2. ステップ2.4を繰り返します。
6. 二次ろ過
   1. 手順2.5.1と2.5.2を繰り返します。
   2. ステップ2.4.1と同じビーカーに2回目の煎じ薬を注ぎ、1回目と2回目の煎じ薬を混ぜます。
7. 濃度
   1. ビーカーをアスベストフリーのワイヤーガーゼを挟んだガス炊飯器に入れ、低煮沸器で加熱し、ガラス棒でゆっくりと連続的に攪拌する。
   2. 煎じ薬が100mLになったら、100mLビーカーに移す。
   3. 煎じ薬が50mLになるまで2.7.1の手順を繰り返します。
8. 保管と管理
   1. 濃縮煎じ薬をステーに移すガラス瓶。それをRTに冷やす。 1週間以内に使用する場合は4℃で、長期間保存する場合は-70℃で保管してください。
   2. 1日1回、0.83mL /ラットを3日間胃内投与する。
9. EXD含有血清調製物
   1. 最後のEXD投与の1時間後に300mg / 100gの80mg / kgケタミンおよび10mg / kgキシラジンを腹腔内注射することによりラットを麻酔する。つま先で適切な麻酔を確認してください。
   2. メスを使用して腹部から胸郭の底にラットの皮膚と腹膜を切開する（またはまっすぐに操作するはさみ）。それぞれ約5cmと0.5cmの長さと深さの切開を作成します。ティッシュペーパーを使用して腹部内臓を左に動かします。
   3. ティシュペーパーを使用して、腹部大動脈の結合組織を除去して、血管をはっきりと露出させる。
   4. 10mL、22ゲージのシリンジを使用して、腹部大動脈からゆっくりと血液を採取する。それを転送する針を除去した後の15mLの滅菌チューブ; 1匹のラットは8〜10mLの血液を産生することができる。
      注：採血が始まるとラットは生きている（ すなわち、腹部大動脈が拍動する）。
   5. 室温RTで30〜60分間、直立姿勢で血液を凝固させる。 500-600×gで20分間遠心分離する。すべての上清（血清）を注意深く1つの50mLの滅菌チューブに入れ、すべての血清（異なる動物由来）を一緒に混合する。
   6. 血清を56℃の水浴中で30分間インキュベートすることにより熱不活性化を行う。 0.22μmの孔径の親水性ポリエーテルスルホン膜を有するシリンジフィルターを用いて血清を濾過する。新鮮な血清を使用するか、-20℃で保存してください。
10. 対照薬物含有血清調製物（対照群において使用される）
    1. 1日1回3日間同じ容量の生理食塩水（0.83mL）で各ラットを投与する。他のステップはステップ2.9と同じです。
11. 応用
    1. EXD含有血清または薬物含有血清10mLを各100mLの培地に加え、1％ペニシリン - ストレプトマイシン（PS） ^23に加える。

結果

OVXマウスの骨密度に対するEXDの効果

腰椎切片のヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色は、OVX群（ 図1A 、左パネル）と比較して、 インビボでの EXD処置後の骨梁の増加を示す（ 図1A 、右パネル）。 図1Bは、OVXマウス（ 図1B 、左パネル）および12週間のEXD処置を行...

ディスカッション

近年、東アジアの臨床現場で何千年も使用されてきた代替薬の一種であるハーブ薬が注目されています。伝統的な漢方薬は、現代医学の「ベンチ・ベッド」のパターンとは異なり、まずそのメカニズムを説明するために「ベッド・ツー・ベンチ」のパターンが必要です。これに続いて、ベンチ段階で行われた検証と、新たに最適化された薬物の開発のための処理が続く。これまで、数式また?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Curculigo orchioides Gaertn (9 g), Herbaa Epimedii (9 g), Radix Morindae Officinalis (9 g), Radix Angelicae Sinensis (9 g), Cortex Phellodendri (6 g), and Rhizoma Anemarrhenae (6 g)	Kang-qiao Chinese Medicine Yinpian Co. Ltd (Shanghai, CN)	160922	EXD components
Filter paper	GElifesciences	99-103-952	Filter EXD decoction before concentration
Imprinting Control Region (ICR) mice	Shanghai Laboratory Animal Center	SCXK 2007-0005	In vivo study
Sprague Dawley rats	Shanghai Laboratory Animal Center	SCXK 2007-0005	EXD-containing serum preparation
Syringe filter	Millipore	SLGP033RB	0.22 µm
gavage needles (10 ml)	Shanghai BO Ge trade sales department	59104274	Adminstration of EXD
Ketamine (80 mg/kg)	Fujian Gutian Pharma Co. Ltd	H35020148	Anesthesia
Xylazine (10 mg/kg)	Sunway Pharma Co. Ltd	CB07591	Anesthesia
Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco (DMEM) culture medium	Gibco	12800-116	DMEM with 2 mM L-glutamine and without ribonucleosides and ribonucleotides
Streptomycin	Sigma	1277	100 µg / ml
Penicillin	Sigma	4687	100 µg / ml