JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة لقياس بحساسية معدل النقل نوكلوسيتوبلاسميك داخل الخلايا العصبية الحركية مثل نسك-34 الخلايا عن طريق قياس التغير في الوقت الحقيقي في استيراد النووي للبروتين نلس-نيس-غفب.

Abstract

النقل نوكليوسيتوبلازميك يشير إلى استيراد وتصدير جزيئات كبيرة من نواة الخلية. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت عددا من الدراسات وجود صلة بين التصلب الجانبي الضموري (ألس) والإعاقات في مسار نوكلوسيتوبلاسميك. ألس هو مرض تنكس عصبي يؤثر على الخلايا العصبية الحركية مما يؤدي إلى الشلل، وفي نهاية المطاف في الموت، في غضون 2-5 سنوات في المتوسط. معظم حالات ألس متقطعة، تفتقر إلى أي ارتباط وراثي ظاهر، ولكن 10٪ موروثة بطريقة مهيمنة. في الآونة الأخيرة، تم تحديد التوسعات تكرار هيكسانوكليوتيد (هريس) في كروموسوم 9 إطار القراءة المفتوحة 72 (C9orf72) الجينات كسبب وراثي ألس والخرف الصدغي الصدغي (فتد). الأهم من ذلك، وقد اقترحت مجموعات مختلفة مؤخرا أن هذه المسوخ تؤثر على النقل نوكلوسيتوبلاسميك. وقد أظهرت هذه الدراسات في الغالب النتيجة النهائية والمظاهر التي تسببها هرس على النقل نوكلوسيتوبلاسميك، لكنها لا تظهر اختلال النقل النووي فيفي الوقت الحالى. ونتيجة لذلك، يمكن تحديد فقط نقص نقل نوكلوسيتوبلاسميك شديد، ويرجع ذلك أساسا إلى أوفيركسريسيون عالية أو الإدراج البروتين خارجي.

يصف هذا البروتوكول مقايسة جديدة وحساسة جدا لتقييم وتحديد الاختلال النقل نوكلوسيتوبلاسميك في الوقت الحقيقي. معدل استيراد البروتين نلس-نيس-غفب (المكوك غفب) يمكن أن يكون كميا في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر الفلورسنت. ويتم ذلك باستخدام مثبط إكسبورتين، مما يسمح للمكوك غفب فقط لدخول النواة. للتحقق من الفحص، و C9orf72 ترجمة حقوق الإنسان ترجمة يتردد الببتيد، بولي (غر) وبولي (بيأر)، والتي تم عرضها سابقا لتعطيل النقل نوكلوسيتوبلاسميك، استخدمت. باستخدام الفحص الموصوف، لوحظ انخفاض بنسبة 50٪ في معدل الواردات النووية مقارنة مع السيطرة. وباستخدام هذا النظام، يمكن فحص التغيرات الدقيقة في النقل النوكلوسيتوبلازمي وقدرة العوامل المختلفة على إنقاذ (ولو جزئيا) تر نوكليوسيتوبلازمييمكن تحديد عيب أنسبورت.

Introduction

مجمع المسام النووي (مجلس الشعب) يسيطر على استيراد وتصدير جزيئات كبيرة داخل وخارج نواة الخلية. وعلى النقيض من الجزيئات الصغيرة، التي يمكن أن تدخل النواة دون تنظيم 1 ، يتم التحكم في نقل الجزيئات الكبيرة بقوة من قبل المجلس الوطني. هذه الجزيئات الكبيرة، مثل البروتينات و الحمض النووي الريبي، المرتبطة بعوامل النقل، بما في ذلك الاستيراد والتصدير، ليتم استيرادها وتصديرها من النواة 2 . من أجل استيرادها، يجب أن تحتوي البروتينات على عزر الببتيد الصغير، وتسمى عموما إشارة توطين النووية (نلس)، التي ترتبط باستيراد 2 . هذه تسلسل من الأحماض الأمينية بمثابة علامة ومتنوعة في تكوين 3 ، 4 . يمكن تصدير البروتينات من النواة إلى السيتوبلازم بسبب ارتباطها مع إكسبورتينs، التي تربط تتابع إشارة، تسمى عموما إشارة تصدير نووية (نيس) 2 . كل من المستوردين والتصدير قادرون على نقل حمولتهم بسبب تنظيم راس الصغيرة ذات الصلة البروتين النووي غتباز (ران) 2 . وقد تبين أن ران موجودة في حالات مطابقة مختلفة اعتمادا على ما إذا كانت ملزمة إلى غتب أو الناتج المحلي الإجمالي. عندما تكون ملزمة إلى غتب، يمكن ران ربط المستوردات أو إكسبورتينس. عند ربط رانغب، إيمبورتينز الإفراج عن حمولتها، في حين أن إكسبورتينز يجب ربط رانغتب لتشكيل مجمع مع البضائع التصدير الخاصة بهم. تعتمد الدولة الملزمة النوكليوتيدات ران على موقعها في نواة (رانغب) أو السيتوبلازم (رانغبد).

في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت عددا من الدراسات وجود صلة بين الانهيارات في مسار نوكلوسيتوبلاسميك وكل من التصلب الجانبي الضموري (ألس) والخرف الجبهي الصدغي (فتد) 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 . ألس هو المرض العصبي التقدمي والقاتل التي تؤثر على كل من الخلايا العصبية الحركية العلوية والسفلية (منس) 13 مما أدى إلى الشلل، وفي نهاية المطاف في الموت، في غضون 2-5 سنوات في المتوسط. وتصنف معظم حالات ألس على أنها متفرقة (سالس)، تفتقر إلى أي ارتباط وراثي ظاهر، ولكن 10٪ موروثة بطريقة مهيمنة (ألس العائلي؛ فالس). في الآونة الأخيرة، تم تحديد التوسعات تكرار هيكسانوكليوتيد (هريس) في الكروموسوم 9 إطار القراءة المفتوحة 72 (C9orf72) الجينات 14 ، 15 كسبب وراثي ألس و فتد. هذه المسوخ تمثل 30-40٪ من الحالات فالس 16 ، ودعت دراسات مختلفةأنها تسبب السمية عن طريق التأثير على نقل نوكلوسيتوبلاسميك 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 .

وقد أظهرت هذه الدراسات في الغالب النتائج والمظاهر النهائية لتعليم حقوق الإنسان على النقل نوكلوسيتوبلاسميك، لكنها لا تظهر اضطراب نوكلوسيتوبلاسميك في الوقت الحقيقي. ونتيجة لذلك، تم تقييم فقط نقص نقل نوكلوسيتوبلاسميك شديد 11 ، 17 ، 18 .

يصف هذا البروتوكول الجديد وري فحص حساسة لتقييم وتحديد العجز النقل نوكليوسيتوبلاسميك في الوقت الحقيقي. معدل استيراد البروتين نلس-نيس-غفب (المكوك غفب) يمكن أن يكون كميا في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر الفلورسنت. ويتم ذلك باستخدام مثبط إكسبورتين، كما هو موضح سابقا 18 ، مما يسمح للمكوك غفب فقط لدخول النواة. باستخدام المجهري الفلورسنت والبرمجيات قادرة على قياس التغيرات الفلورية في الوقت الحقيقي، فمن الممكن لقياس التغيرات التدريجية في كثافة مضان المكوك غفب، وتقع في النواة. ونتيجة لذلك، يمكن إجراء منحنى التشبع مثل ميكايليس-منتن مثل محور مضان لوقت، وهو ما يمثل كمية من المكوك النووي غفب في أي وقت من الأوقات. باستخدام المعدل الخطي الأولي للمنحنيات، فمن الممكن لتوليد المنحدر، الذي يمثل معدل الدخول إلى النواة قبل التشبع مضان.

للتحقق من صحة الفحص، ترجمةد C9orf72 يكرر ثنائي الببتيد، بولي (غر) وبولي (بيأر)، والتي تم الإبلاغ عنها سابقا لتعطيل النقل نوكلوسيتوبلاسميك، استخدمت 5 ، 7 ، 8 ، 10 ، 12 . باستخدام هذا الفحص، لوحظ انخفاض بنسبة 50٪ في معدل الواردات النووية مقارنة مع السيطرة. باستخدام هذا النظام، يمكن فحص التغييرات الدقيقة في النقل نوكلوسيتوبلاسميك. وعلاوة على ذلك، يمكن تحديد قدرة عوامل مختلفة لإنقاذ عيب النقل نوكلوسيتوبلاسميك.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد خط الخلية

  1. ذوبان الجليد حوالي 1،000،000 الماوس نيوروبلاستوما خلايا الحبل الشوكي (نسك-34 الخلايا) التي تم تخزينها في حاوية النيتروجين السائل. استخدام حاضنة المياه 37 درجة مئوية حتى يتم إذابة الخلايا تماما.
  2. إضافة المتوسطة الطازجة، الدافئة (دمم المتوسطة التي تحتوي على 10٪ مصل بقري الجنين (فبس)، 1٪ L- الجلوتامين، و 1٪ من المضادات الحيوية من ركلة جزاء القلم).
  3. أجهزة الطرد المركزي إذابة الخلايا (SL16R) في 500 x ج لمدة 5 دقائق، وتشكيل خلية بيليه. تجاهل الوسط وإضافة 1 مل من الوسط الجديد لإعادة تعليق الخلية.
  4. وضع الخلايا معلق في قارورة 15 مل وإضافة 5 مل إضافية من المتوسطة. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة معقمة مع 5٪ كو 2 عند 37 درجة مئوية.
  5. في موازاة ذلك، وضع 8 كوفرسليبس غير المصقول (غطاء الزجاج: 12 ملم، 0.13-0.17 مم) في طبق ثقافة 60 ملم وتعقيم باستخدام 70٪ من الإيثانول والتعرض إلى 30 دقيقة من ضوء الأشعة فوق البنفسجية حتى يجف. إضافة المتوسطة إلى كل طبق والتخلص من غسل الإيثانول المتبقية.
  6. إضافة العازلة التربسين (2.5 غرام من التربسين و 0.2 غرام من إدتا في 1 لتر من محلول الملح المتوازن هانكس) إلى الخلايا بعد أن تصل إلى ما يقرب من 90٪ التقاء (ما يقرب من 6 ملايين خلية في قارورة) للسماح للخلايا الملتصقة للفصل.
    ملاحظة: خلايا نسك-34 حساسة وتتطلب فقط 15 ثانية من التربسين العازلة الحضانة و 1 دقيقة إضافية من الحضانة خالية من التربسين قبل التفكك باستخدام المتوسطة.
  7. لوحة الخلايا على أطباق ثقافة 60 ملم تحتوي بالفعل على كوفرسليبس مع 3 مل من المتوسطة، ما يقرب من 350،000 لكل طبق. تركها في الحاضنة لمدة 24 ساعة للسماح مرفق الخلية على كوفرسليبس.

2. خلية ترنسفكأيشن

ملاحظة: بعد حوالي 24 ساعة، فإن الخلايا نسك-34 تصل إلى 40٪ التقاء (ما يقرب من 800،000 الخلايا)، وسوف تكون على استعداد لترنسفكأيشن.

  1. إعداد النقي دمم المتوسطة (300 ميكرولتر من دمم المتوسطة لكل 60 ملم طبق الثقافة) في حوض ميكروسنتريفوج العقيمةوفاق.
  2. إضافة 2 ميكروغرام من كل البلازميد المطلوبة ل ترنسفكأيشن لكل دمم التي تحتوي على أنبوب ميكروسنتريفوج.
    ملاحظة: المكوك غفب البلازميد إلزامي في جميع ترانزفكتيونس الخلية.
  3. إضافة كاشف ترنسفكأيشن لجميع أنابيب ميكروسنتريفوج التي تحتوي على البلازميدات المطلوبة. هنا، إضافة 4 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن التجارية لكل 2 ميكروغرام من الحمض النووي.
  4. دوامة أنابيب ميكروسنتريفوج التي تحتوي على دمم، البلازميدات، وكاشف ترنسفكأيشن واحتضان لهم في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة.
  5. إضافة كل أنبوب ميكروسنتريفوج إلى طبق الثقافة ويقلب الطبق بلطف لتشكيل حل متجانس. وضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة لمدة 48 ساعة.
    ملاحظة: منذ المكوك غفب ينبغي التعبير عنها في جميع الخلايا، وكفاءة ترنسفكأيشن المكوك غفب يمكن فحصها جزئيا واختبارها مسبقا باستخدام المجهر الفلورسنت بعد ترنسفكأيشن بين عشية وضحاها. ويمكن إجراء فحص كامل للبروتينات غير الفلورسنت أعرب باستخدام أناليس إمونوبلوتهو.

3. المجهري

  1. إرفاق كوفرسليبس التي تحتوي على خلايا نسك-34 ترانزفكتد إلى حامل ساترة ويغسل بلطف مع الفوسفات مخزنة المالحة (بس) لإزالة الخلايا الميتة منفصلة.
  2. تحديد التصحيح خلية مناسبة باستخدام فلتر الفلورسنت الأخضر مع المجهر مقلوب.
    ملاحظة: وتعرف خلية مناسبة التصحيح على أنها مجال المجهر من عرض يظهر عدد كبير من الخلايا (20-30 خلايا في حقل) والتي يتم تعريف النوى بوضوح في الخلايا. يتم تحديد نوى الخلية داخل التصحيح خلية أولا عن طريق العين ويتم وضع علامة يدويا من قبل برنامج التصوير.
  3. إضافة 200 ميكرولتر من إكسبورتين-1 المانع العازلة ليبتوميسين B (لمب) تحتوي على 10 نانوغرام / مل لمب في برنامج تلفزيوني ل كوفرسليبس من قبل يقطر المخزن المؤقت على كوفرسليبس تحت المجهر.
    ملاحظة: يتم تعيين هذه النقطة في الوقت كما الفاصلة صفر.
  4. تحديد كثافة الفلورسنت من نوى ملحوظ في 3 فترات s لحوالي 400-500 ق.
  5. اختبار بين 3 و 5 زلات تغطية لكل مجموعة ترنسفكأيشن في كل تجربة فردية.

4 - التحليل

ملاحظة: منذ خلايا مختلفة تعبر مستويات مختلفة من المكوك الفلورسنت غفب، فمن المهم لتطبيع كثافة الفلورسنت النووية من كل خلية إلى كثافة الفلورسنت الأولية الخاصة بها.

  1. تطبيع كثافة الفلورسنت من نوى ملحوظ من خلال تقسيم 3-s الفاصل الزمني الفلورسنت من كل نواة مع متوسط ​​الفترات الستة الأولى من تلك النواة.
  2. بعد تطبيع كل نواة، وإنتاج منحنى كثافة الفلورسنت يمثل التغيير في مضان نوى كدالة من الوقت لكل خلية التصحيح. للقيام بذلك، حساب متوسط ​​جميع الخلايا في كل خلية التصحيح (التي تتكون من حوالي 20-30 خلايا في كل التصحيح).
    ملاحظة: منحنى شدة الفلورسنت نواة يشبه منحنى ميشاليس-منتن التشبع، وهو أفضل لوحظ في زيادة تيلي فترات. ويرجع ذلك إلى انخفاض في كميات عصاري خلوي من المكوك غفب مع الوقت بسبب النقل النووي. هذا الانخفاض إحصائيا يقلل من احتمال المكوك غفب لنقلها إلى النواة، وبالتالي الوصول إلى التشبع في مضان النووية. المنحدر المستمد من المعدل الأولي الخطي للمنحنى يعطي معدل دخول V ماكس في النواة.
  3. تحليل المنحدرات V ماكس من كل خلية التصحيح، المستمدة من ثلاث إلى خمس تجارب مستقلة، وذلك باستخدام برنامج الرسوم البيانية لإنتاج منحدر واحد يمثل كل مجموعة التجريبية. أداء الكمي باستخدام طريقة واحدة تحليل أنوفا الإحصائية.

5. البروتين التحقق من صحة التعبير

  1. وضع أطباق ثقافة 60 ملم تحتوي على الخلايا المتبقية (لم تستخدم في التجربة أعلاه) من كل مجموعة تجريبية على الجليد.
  2. التخلص من المتوسطة وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني لتخفيف وغسل المتوسطة المتبقية.
  3. علاج الخلايا مع 200-400ميكرولتر من العازلة تحلل تحتوي على برنامج تلفزيوني، 0.5٪ تريتون، والبروتياز مثبط قرص كوكتيل (بي). كشط باستخدام مكشطة الخلية.
  4. جمع الخلايا في العازلة تحلل في أنبوب ميكروسنتريفوج والتجانس مع الخالط في 4000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة تحت الجليد.
  5. أجهزة الطرد المركزي الخلايا المتجانسة في 2500 x ج لمدة 10 دقيقة. جمع طاف، وتحديد تركيز البروتين باستخدام مقايسة برادفورد، وتخزينها حتى استخدام في -20 درجة مئوية.
  6. جمع بين 30 و 70 ميكروغرام من البروتين الكلي (اعتمادا على البروتين) وتحميله في هلام سدز-بادج لاختبار التعبير البروتين باستخدام مقايسة مناعية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

باستخدام الإجراء المعروض هنا، ترانزفكتد الخلايا العصبية مثل الخلايا نسك-34 الخلايا العصبية مع نلس-نيس-غفب (المكوك غفب) البروتين. هذا البروتين، الذي يحتوي على نلس وتسلسل إشارة نيس ( الشكل 1 )، ويمكن نقل مكوكية بين النواة والسيتوبلازم. عام غفب ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هذا البروتوكول يدل على مقايسة جديدة حساسة وكمية للغاية لتقييم التغيرات الدقيقة في النقل نوكلوسيتوبلاسميك. باستخدام هذا النظام، فمن الممكن لمراقبة وقياس النقل نوكلوسيتوبلاسميك واختلال وظيفي في الوقت الحقيقي، وليس فقط العيوب الكبيرة التي تؤدي إلى تغييرات جذرية في ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

المؤلفين ليس لديهم ما يكشف عنه.

Acknowledgements

ونشكر جميع أعضاء مختبر الذكاء الاصطناعي على تعليقاتهم واقتراحاتهم المفيدة. نود أن نشكر الأستاذ مارك هيب (ماكس معهد بلانك للكيمياء الحيوية) لتزويدنا ناقلات المكوك غفب. وقد تم دعم هذا العمل بمنح مقدمة من مؤسسة العلوم اإلسرائيلية) إيسف رقم 124/14 (، ومؤسسة العلوم الوطنية) بسف # 2013325 (، ومنحة ماري كوري للتكامل الوظيفي) سيغ # 333794 (، والمعهد الوطني لعلم النفس النفسي في إسرائيل) نيبي # b133-14 / 15).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)tebu-bioCLU140-A
DMEM 4.5 g/L L-glucoseBiological Industries01-055-1A
FBS European GradeBiological Industries04-007-1A
SL 16R CentrifugeThermo Scientific75004030
Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 IncubatorThermo Scientific3111
Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thickBar Naor LTD
TurboFect Transfection ReagentThermo ScientificR0531
Axiovert 100 inverted microscopeZeiss
Imaging Workbench 2Axon Instruments
Leptomycin BSigmaL2913
PBSBiological Industries02-023-1A
Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clampGlas-Col099C K5424CE
MicroCL 17R Centrifuge, RefrigeratedThermo Scientific75002455

References

  1. Alberts, B. Molecular biology of the cell. , 4th edn, Garland Science. (2002).
  2. Freitas, N., Cunha, C. Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins. Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).
  3. Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. A short amino acid sequence able to specify nuclear location. Cell. 39, 499-509 (1984).
  4. la Cour, T., et al. Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals. Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).
  5. Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Sci Rep. 6, 20877(2016).
  6. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 129-133 (2015).
  7. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).
  8. Kwon, I., et al. Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells. Science. 345, 1139-1145 (2014).
  9. Rossi, S., et al. Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS. J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).
  10. Shi, K. Y., et al. Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
  11. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 56-61 (2015).
  12. Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).
  13. Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).
  14. DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72, 245-256 (2011).
  15. Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72, 257-268 (2011).
  16. Boeve, B. F., et al. Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72. Brain. 135, 765-783 (2012).
  17. Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).
  18. Woerner, A. C., et al. Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA. Science. 351, 173-176 (2016).
  19. Tao, Z., et al. Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity. Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).
  20. Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84, 1213-1225 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

123 34 C9orf72

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved