JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, bir NLS-NES-GFP proteininin nükleer ithalatında gerçek zamanlı değişikliği niceleyerek motor nöron benzeri NSC-34 hücrelerindeki nükleositoplazmik taşınım oranını duyarlı bir şekilde ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır.

Özet

Nükleositoplazmik nakil, büyük moleküllerin hücre çekirdeğinden ithalatı ve ihracını ifade eder. Yakın geçmişte, bir dizi çalışma amyotrofik lateral skleroz (ALS) ile nükleositoplazmik yolakta bozulmalar arasında bir bağlantı olduğunu göstermiştir. ALS motor nöronları etkileyen nörodejeneratif bir hastalıktır ve sonuçta ortalama 2-5 yıl içinde felç ile sonuçlanır ve ölümle sonuçlanır. Çoğu ALS olgusu, herhangi bir görünür genetik bağlantıdan yoksun, dağınıktır, ancak% 10 hakim bir şekilde kalıtsaldır. Yakın zamanda, kromozom 9 açık okuma çerçevesi 72 (C9orf72) genindeki hekzanükleotid tekrar genişlemesi (HRE), ALS ve frontotemporal bunama (FTD) genetik bir nedeni olarak tanımlandı. Önemli olarak, farklı gruplar yakın zamanda, bu mutantların nükleositoplazmik taşınımı etkilediğini önermişlerdir. Bu çalışmalar çoğunlukla HRE'lerin nükleositoplazmik nakil üzerinde nihai sonucu ve tezahür göstermiştir ancak bunlar nükleer transport bozukluğunu göstermemektedirgerçek zaman. Sonuç olarak, çoğunlukla yüksek aşırı ekspresyon veya eksojen protein yerleştirilmesinden dolayı ciddi nükleositoplazmik ulaşım eksikliği saptanabilir.

Bu protokol, nükleositoplazmik transport bozukluğunun gerçek zamanlı olarak değerlendirilmesi ve nicelleştirilmesi için yeni ve çok hassas bir tahlil tarif etmektedir. Bir NLS-NES-GFP proteini (mekik-GFP) alma oranı, flüoresan mikroskobu kullanılarak gerçek zamanlı olarak nicelleştirilebilir. Bu bir exportin inhibitörü kullanılarak gerçekleştirilir, böylece GFP'nin mekik içine girmesine izin verilir. Tahlilin geçerliliği için, C9orf72 HRE, daha önce nükleositoplazmik taşınmayı bozduğu gösterilen, poli (GR) ve poli (PR) dipeptid tekrarlarını çevirmiştir. Tanımlanan tahlil kullanılarak, kontrole kıyasla nükleer ithalat oranında% 50'lik bir düşüş gözlendi. Bu sistemi kullanarak, nükleositoplazmik taşınımdaki küçük değişiklikler incelenebilir ve farklı faktörlerin bir nükleositoplazmik tr'ini (kısmen bile) kurtarma yeteneği incelenebilirAnsport defekti belirlenebilir.

Giriş

Nükleer gözenek kompleksi (NPC), büyük moleküllerin hücre çekirdeğine girip çıkmasını kontrol eder. Düzenleme 1 olmadan çekirdeğe girebilen küçük moleküllerin aksine, daha büyük moleküllerin taşınması NPC tarafından güçlü bir şekilde kontrol edilir. Proteinler ve RNA gibi bu büyük moleküller, çekirdekten ithal edilecek ve ihraç edilecek olan importinler ve exportinler de dahil olmak üzere ulaşım faktörleri ile ilişkilendirilmektedir. İthal edilmek için, proteinler, genellikle nükleer lokalizasyon sinyali (NLS) olarak adlandırılan ve importins 2 ile bağlanan küçük bir peptid motifi içermelidir. Bu amino asit dizileri bir etiket görevi görür ve 3 , 4 bileşiminde çeşitlilik gösterir. Proteinler, çekirdeğin, exportin ile ilişkisinden dolayı sitoplazmaya ihraç edilebilirS, genellikle bir nükleer ihraç sinyali (NES) 2 olarak adlandırılan bir sinyal sekansını bağlar. Hem importins hem de exportins, küçük Ras ile ilgili nükleer protein GTPase (Ran) 2'nin düzenlenmesi nedeniyle yüklerini taşıyabiliyorlar. Ran'ın, GTP'ye veya GSYİH'ye bağlı olup olmadığına bağlı olarak farklı konformasyonel hallerde bulunduğu gösterilmiştir. GTP'ye bağlandığında, Ran importins veya exportins'e bağlanabilir. Exportins, RanGTP'ye bağlandığında yüklerini serbest bırakırken, exportins'ler ihracat kargolarıyla bir kompleks oluşturmak için RanGTP'yi bağlamalıdır. Ran'ın hakim nükleotid bağlanma durumu, çekirdeğin (RanGTP) veya sitoplazmanın konumuna (RanGDP) bağlıdır.

Son zamanlarda, bir dizi çalışma, nükleositoplazmik yolakta ve hem amiyotrofik lateral sklerozda (ALS) hem de frontotemporal bunama (FTD) 5,6 arasındaki bozukluklar arasında bir bağlantı olduğunu göstermiştir , 7,8,9,10,11,12 . ALS, hem üst hem de alt motor nöronlarını (MN) etkileyen ve sonuçta ortalama 2-5 yıl içinde felç ile sonuçlanan ilerleyici ve ölümcül nörodejeneratif bir hastalıktır. Çoğu ALS vakası, herhangi bir görünür genetik bağlantı bulunmayan sporadik (SALS) olarak sınıflandırılır, ancak% 10 dominant bir şekilde miras kalır (ailesel ALS; FALS). Son zamanlarda, kromozom 9 açık okuma çerçevesi 72 (C9orf72) genindeki hekzanükleotid tekrar genişlemeleri (HRE), ALS ve FTD'nin genetik bir nedeni olarak 14 , 15 olarak tanımlandı. Bu mutantlar FALS vakalarının% 30-40'ını oluşturur ve farklı çalışmalar iddia edilmiştirNükleositoplazmik taşınımı etkileyerek toksikliğe neden olduklarını, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .

Bu çalışmalar çoğunlukla HRE'lerin nükleositoplazmik nakil üzerindeki nihai sonuçlarını ve tezahürlerini göstermiştir, ancak gerçek zamanlı olarak nükleositoplazmik bozulma göstermezler. Sonuç olarak, sadece ağır nükleositoplazmik transport yetersizliği 11 , 17 , 18 olarak değerlendirildi.

Bu protokol yeni ve veGerçek zamanlı olarak nükleositoplazmik transport bozukluğunu değerlendirmek ve ölçmek için hassas duyarlılık testi. Bir NLS-NES-GFP proteini (mekik-GFP) alma oranı, flüoresan mikroskobu kullanılarak gerçek zamanlı olarak nicelleştirilebilir. Bu daha önce tarif edildiği gibi bir exportin inhibitörü kullanılarak yapılır, böylece mekik-GFP'nin çekirdeğe girmesine izin verir. Floresan mikroskopi ve gerçek zamanlı olarak flöresan değişiklikleri nicelikli bir yazılım kullanarak çekirdekte bulunan mekik-GFP'nin flüoresans yoğunluğundaki kademeli değişikliklerin sayısal olarak tespit edilmesi mümkündür. Sonuç olarak, herhangi bir zamanda nükleer mekik-GFP miktarını temsil eden, flüoresan-zaman ekseninin bir Michaelis-Menten benzeri doyum eğrisi yapılabilir. Eğrilerin başlangıçtaki doğrusal oranını kullanarak, flüoresans doygunluğundan önce çekirdeğe girme oranını temsil eden bir eğim oluşturmak mümkündür.

Deneyi doğrulamak için, tercüme etmekDaha önce nükleositoplazmik taşınmayı kesintiye uğrattığı bildirilen poli (GR) ve poli (PR) C9orf72 dipeptide tekrarlar 5 , 7 , 8 , 10 , 12 kullanıldı. Bu tahlil kullanılarak, kontrole kıyasla nükleer ithalat oranında% 50'lik bir düşüş gözlendi. Bu sistemi kullanarak, nükleositoplazmik taşınımdaki dakika değişiklikleri incelenebilir. Dahası, farklı faktörlerin bir nükleositoplazmik nakil defekti kurtarma kabiliyeti belirlenebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Hücre Hattı Hazırlama

  1. Sıvı azotlu bir kapta saklanan yaklaşık 1.000.000 fare nöroblastoma spinal kord hücresini (NSC-34 hücreleri) çözdürün. Hücreler tamamen eriyene kadar 37 ° C su kuluçka makinesini kullanın.
  2. Taze, sıcak ortam (% 10 sığır fetüsü serumu (FBS),% 1 L-glutamin ve% 1 kalem strep antibiyotikleri içeren DMEM ortamı) ekleyin.
  3. Çözülmüş hücreleri (SL16R) 500 xg'de 5 dakika süreyle santrifüj ederek bir hücre pelletini oluşturun. Ortamı atın ve hücre yeniden süspansiyonu için 1 mL yeni ortam ekleyin.
  4. Yeniden süspanse edilen hücreleri 15 mL'lik bir şişeye yerleştirin ve ekstra 5 mL'lik bir ortam ekleyin. Hücreleri bir gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO 2 ile steril bir inkübatörde inkübe edin.
  5. Buna paralel olarak, 60 mm'lik bir kültür çanağına 8 kaplanmamış lamelleri (kapak camı: 12 mm, 0.13-0.17 mm kalınlığında) yerleştirin ve kuru olana kadar% 70 etanol ile 30 dakika UV ışığına maruz bırakarak sterilize edin. Her çanağa orta miktarda ilave edin ve artık etanolü yıkamak için atın.
  6. Yapışkan hücrelerin ayrışmasına izin vermek için yaklaşık% 90 konfluansa (kaba yaklaşık 6 milyon hücreye ulaştıktan sonra) tripsin tamponu (1 L Hanks 'Dengeli Tuz Çözeltisi içinde 2.5 g tripsin ve 0.2 g EDTA) ekleyin.
    NOT: NSC-34 hücreleri hassasdır ve ortamı kullanarak ayrılmadan önce 15 s tripsin tampon inkübasyonu ve tripsin içermeyen inkübasyondan 1 dakika daha gereklidir.
  7. Plaka zaten 3 ml orta, yaklaşık 350.000 tabak başına lamelleri içeren 60 mm kültür yemekleri üzerine hücreleri. Lamelleri üzerine hücre eklenti sağlamak için 24 saat inkübatör bırakın.

2. Hücre Transfeksiyon

NOT: Yaklaşık 24 saat sonra NSC-34 hücreleri% 40 birleşmeye (yaklaşık 800.000 hücre) ulaşır ve transfeksiyon için hazır olacaktır.

  1. Steril mikrosantrifüj tüpünde saf DMEM ortamı (her 60 mm kültür çanağı için 300 μL DMEM ortamı hazırlayın) hazırlayınes.
  2. Her DMEM içeren mikrosantrifüj tüpüne transfeksiyon için gereken 2 μg'lık her plazmid ilave edin.
    NOT: Mekik-GFP plazmiti, tüm hücre aktarımlarında zorunludur.
  3. Gerekli plasmidleri içeren tüm mikrosantrifüj tüplerine transfeksiyon reaktifi ekleyin. Burada, her 2 ug DNA için ticari transfeksiyon reaktifi 4 mcL ekleyin.
  4. DMEM, plazmid ve transfeksiyon reaktifi içeren mikrosantrifüj tüplerini vorteksleyin ve 25 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  5. Her mikrosantrifüj tüpünü bir kültür çanağına ekleyin ve homojen bir solüsyon oluşturmak için çanağı hafifçe karıştırın. Çanağı inkübatöre 48 saat geri koyun.
    NOT: Mekik-GFP'nin tüm hücrelerde eksprese edilmesi gerektiği için, mekik-GFP transfeksiyon etkinliği kısmen incelenebilir ve gecede transfeksiyon sonrasında floresanlı mikroskopi kullanılarak ön test edilebilir. Floresansız ifade edilen proteinlerin tam bir incelemesi, bir immünoblot analiziolduğunu.

3. Mikroskopi

  1. Bir lamel tutucuya transfekte NSC-34 hücreleri içeren lamelleri takın ve müttefiki ölen hücreleri kaldırmak için hafifçe fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
  2. Ters çevrilmiş mikroskoplu yeşil bir fluoresan filtre kullanarak uygun bir hücre yamasını belirleyin.
    NOT: Uygun bir hücre yaması, çok sayıda hücreyi (bir alandaki 20-30 hücre) gösteren ve çekirdeklerin hücrelerde açıkça tanımlandığı bir mikroskop alan olarak tanımlanır. Hücre yamasındaki hücre çekirdeği önce gözle tanımlanır ve görüntüleme yazılımı ile manuel olarak işaretlenir.
  3. Mikroskop altında lamelleri damlayan lamelleri PBS 10 ng / mL LMB içeren bir exportin-1 inhibitörü Leptomisin B (LMB) tampon 200 mcL ekleyin.
    NOT: Bu zaman noktası sıfır aralığı olarak ayarlanır.
  4. İşaretli çekirdeklerin floresan yoğunluğunu yaklaşık 400-500 s boyunca 3 s aralıklarla ölçün.
  5. Her bir deneyde her bir transfeksiyon grubu için 3 ila 5 kapak fişi testi yapın.

4. Analiz

NOT: Farklı hücreler, farklı düzeylerde floresan mekik-GFP ifade ettiğinden, her hücrenin nükleer flüoresan yoğunluğunu kendi başlangıç ​​flüoresan yoğunluğuna normalleştirmek önemlidir.

  1. İşaretlenen çekirdeğin flüoresan yoğunluğunu, her çekirdeğin 3-s floresan aralığını o çekirdeğin başlangıç ​​altı aralık ortalamasına bölerek normalize edin.
  2. Her çekirdeğin normalleştirilmesinden sonra, her bir hücre yamasının zamana bağlı olarak çekirdek flüoresansındaki değişikliği temsil eden bir floresan yoğunluk eğrisi oluşturun. Bunu yapmak için, her hücre yamasındaki tüm hücrelerin ortalamasını hesaplayın (her yamanın yaklaşık 20-30 hücresinden oluşur).
    NOT: Çekirdek floresan yoğunluğu eğrisi artan ti içinde daha iyi gözlemlenen bir Michaelis-Menten doygunluk eğrisine benzemektedirBen dönemler. Bunun nedeni, nükleer transporta bağlı olarak zamanla mekik-GFP sitozolik miktarlarında bir azalmadır. Bu azalma, bir mekik-GFP'nin çekirdeğe taşınma ihtimalini istatistiksel olarak düşürmekte ve dolayısıyla nükleer flüoresan satürasyonuna ulaşmaktadır. Eğrinin doğrusal başlangıç ​​hızından türeyen eğim, V max giriş hızını çekirdeğe verir.
  3. Her bir deney grubunu temsil eden bir eğim oluşturmak için grafik yazılımı kullanarak, üç ila beş bağımsız deneyden türetilen her bir hücre yamasının V maks eğimlerini analiz edin. Tek yönlü ANOVA istatistiksel analizini kullanarak niceleme yapın.

5. Protein İfade Doğrulaması

  1. Buz üzerindeki her bir deney grubundan kalıntı hücreleri (yukarıdaki deneyde kullanılmayan) içeren 60 mm'lik kültür yemekleri yerleştirin.
  2. Ortamı atın ve seyreltmek ve kalan ortamı yıkamak için hücreleri iki kez PBS ile yıkayın.
  3. Hücrelere 200-400 muamele edinPBS,% 0.5 Triton ve proteaz inhibitörü kokteyl tableti (PI) içeren lizis tamponu μL'si. Hücre kazıyıcı kullanarak kazıyın.
  4. Lizis tamponunda hücreleri bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın ve buz altında 1 dakika süreyle 4.000 rpm'de bir homojenleştirici ile homojenize edin.
  5. Homojenleştirilmiş hücreleri 2500 xg'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı toplayın, bir Bradford testi kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün ve -20 ° C'de kullanana kadar saklayın.
  6. 30 ve 70 μg toplam protein (protein bağlı olarak) arasında toplayın ve bir immunoblot tahlili kullanılarak protein ekspresyonu için test etmek için bir SDS-PAGE jel yükleyin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Burada sunulan prosedürü kullanarak, motor nöron benzeri NSC-34 hücreleri bir NLS-NES-GFP (mekik-GFP) proteini ile transfekte edildi. NLS ve NES sinyal sekanslarına sahip olan bu protein ( Şekil 1 ), çekirdek ve sitoplazma arasında dolaşım yapabilir. Jenerik GFP, difüzyon yoluyla herhangi bir lokalizasyon sinyal etiketinin yokluğunda çekirdeğe girebilir veya çekilebilir ve dolayısıyla çekirdek ile sitoplazma arasında eşit olarak dağıtılır (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokol, nükleositoplazmik taşınımdaki dakika değişikliklerini değerlendirmek için oldukça hassas ve niceliksel yeni bir testi gösterir. Bu sistemi kullanarak, protein dağılımında dramatik değişikliklerle sonuçlanan büyük kusurları değil, nükleositoplazmik taşınmayı ve onun işlev bozukluğunu gerçek zamanlı olarak gözlemlemek ve ölçmek mümkündür. Bu tahlil sadece duyarlılık avantajına sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda az miktarda hazırlık gerektirir, ucuzdur ve çok kolay ve ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar açıklayacak bir şeye sahip değiller.

Teşekkürler

AI laboratuvarının tüm üyelerine yararlı yorumları ve önerileri için teşekkür ederiz. Servis-GFP vektörünü bize sağladığı için Prof. Mark Hipp'e (Max Planck Biyokimya Enstitüsü) teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma, İsrail Bilim Vakfı (ISF # 124/14), Binational Science Foundation (BSF # 2013325), FP7 Marie Curie Kariyer Entegrasyonu Hibe (CIG # 333794) ve İsrail'de Psikobiyoloji için Ulusal Enstitü ( NIPI # b133-14 / 15).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)tebu-bioCLU140-A
DMEM 4.5 g/L L-glucoseBiological Industries01-055-1A
FBS European GradeBiological Industries04-007-1A
SL 16R CentrifugeThermo Scientific75004030
Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 IncubatorThermo Scientific3111
Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thickBar Naor LTD
TurboFect Transfection ReagentThermo ScientificR0531
Axiovert 100 inverted microscopeZeiss
Imaging Workbench 2Axon Instruments
Leptomycin BSigmaL2913
PBSBiological Industries02-023-1A
Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clampGlas-Col099C K5424CE
MicroCL 17R Centrifuge, RefrigeratedThermo Scientific75002455

Referanslar

  1. Alberts, B. Molecular biology of the cell. , 4th edn, Garland Science. (2002).
  2. Freitas, N., Cunha, C. Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins. Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).
  3. Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. A short amino acid sequence able to specify nuclear location. Cell. 39, 499-509 (1984).
  4. la Cour, T., et al. Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals. Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).
  5. Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Sci Rep. 6, 20877(2016).
  6. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 129-133 (2015).
  7. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).
  8. Kwon, I., et al. Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells. Science. 345, 1139-1145 (2014).
  9. Rossi, S., et al. Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS. J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).
  10. Shi, K. Y., et al. Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
  11. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 56-61 (2015).
  12. Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).
  13. Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).
  14. DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72, 245-256 (2011).
  15. Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72, 257-268 (2011).
  16. Boeve, B. F., et al. Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72. Brain. 135, 765-783 (2012).
  17. Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).
  18. Woerner, A. C., et al. Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA. Science. 351, 173-176 (2016).
  19. Tao, Z., et al. Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity. Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).
  20. Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84, 1213-1225 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 123n kleositoplazmik nakilmekik GFPNSC 34 h creleriC9orf72ALS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır