Assay zur Messung des nukleozytoplasmatischen Transports in Echtzeit in motorischen Neuronen-ähnlichen NSC-34-Zellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur sensitiven Messung der nukleozytoplasmatischen Transportrate in motorischen neuronähnlichen NSC-34-Zellen durch Quantifizierung der Echtzeitveränderung des nuklearen Importes eines NLS-NES-GFP-Proteins.

Zusammenfassung

Der nukleozytoplasmatische Transport bezieht sich auf den Import und Export von großen Molekülen aus dem Zellkern. In jüngster Zeit haben eine Reihe von Studien eine Verbindung zwischen der amyotrophischen Lateralsklerose (ALS) und den Beeinträchtigungen im nukleocytoplasmatischen Weg gezeigt. ALS ist eine neurodegenerative Erkrankung, die die motorischen Neuronen beeinflusst und zu einer Lähmung und letztlich im Tode führt, innerhalb von 2-5 Jahren im Durchschnitt. Die meisten Fälle von ALS sind sporadisch, ohne irgendeine offensichtliche genetische Verknüpfung, aber 10% werden in einer dominanten Weise vererbt. Kürzlich wurden Hexanucleotid-Repeat-Expansionen (HREs) im Chromosom 9 offenen Leserahmen 72 (C9orf72) Gen als genetische Ursache von ALS und frontotemporaler Demenz (FTD) identifiziert. Wichtig ist, dass verschiedene Gruppen vor kurzem vorgeschlagen haben, dass diese Mutanten den nucleozytoplasmatischen Transport beeinflussen. Diese Studien haben zumeist das endgültige Ergebnis und die Manifestationen, die durch HREs auf den nucleozytoplasmatischen Transport verursacht wurden, gezeigt, aber sie zeigen keine nukleare Transportdysfunktion inEchtzeit. Als Ergebnis kann nur ein schwerer nukleozytoplasmatischer Transportmangel bestimmt werden, was hauptsächlich auf eine hohe Überexpression oder exogene Proteineinfügung zurückzuführen ist.

Dieses Protokoll beschreibt einen neuen und sehr empfindlichen Assay zur Bewertung und Quantifizierung der nukleozytoplasmatischen Transportdysfunktion in Echtzeit. Die Importrate eines NLS-NES-GFP-Proteins (Shuttle-GFP) kann in Echtzeit mittels Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert werden. Dies wird durch die Verwendung eines Exportin-Inhibitors durchgeführt, so dass der Shuttle-GFP nur in den Kern eindringen kann. Zur Validierung des Assays wurden die C9orf72 HRE translatierten Dipeptidwiederholungen, Poly (GR) und Poly (PR), die bisher gezeigt wurden, um den nucleozytoplasmatischen Transport zu stören, verwendet. Unter Verwendung des beschriebenen Assays wurde im Vergleich zur Kontrolle eine 50% ige Abnahme der nuklearen Importrate beobachtet. Mit diesem System können winzige Veränderungen des nucleozytoplasmatischen Transports untersucht und die Fähigkeit verschiedener Faktoren zur Rettung (auch nur teilweise) einer nukleozytoplasmatischen trAnsport-Defekt kann bestimmt werden.

Einleitung

Der nukleare Porenkomplex (NPC) kontrolliert den Import und Export von großen Molekülen in und aus dem Zellkern. Im Gegensatz zu kleinen Molekülen, die ohne Regulation ¹ in den Kern eindringen können, wird der Transport größerer Moleküle stark vom NPC kontrolliert. Diese großen Moleküle, wie Proteine ​​und RNA, assoziieren mit Transportfaktoren, einschließlich Importins und Exportins, importiert und exportiert aus dem Kern ² . Um importiert zu werden, müssen Proteine ​​ein kleines Peptidmotiv enthalten, das im Allgemeinen als nukleares Lokalisierungssignal (NLS) bezeichnet wird, das durch Importine ² gebunden ist. Diese Sequenzen von Aminosäuren wirken als Tag und sind in der Zusammensetzung ^{3 , 4} verschieden. Proteine ​​können aus dem Kern in das Zytoplasma aufgrund ihrer Assoziation mit Exportin exportiert werdenS, die eine Signalsequenz binden, die allgemein als nukleares Exportsignal (NES) bezeichnet wird ² . Sowohl Importins als auch Exportins sind in der Lage, ihre Ladung aufgrund der Regulierung des kleinen Ras-verwandten Nuklearproteins GTPase (Ran) ² zu transportieren. Es wurde gezeigt, dass Ran in verschiedenen Konformationszuständen existiert, je nachdem, ob es an GTP oder BIP gebunden ist. Wenn an GTP gebunden, kann Ran an importins oder exportins binden. Nach der Bindung an RanGTP veröffentlichen die Importine ihre Fracht, während die Exportine RanGTP binden müssen, um einen Komplex mit ihrer Exportfracht zu bilden. Der dominante Nukleotidbindungszustand von Ran hängt von seinem Standort im Kern (RanGTP) oder dem Cytoplasma (RanGDP) ab.

In jüngster Zeit haben eine Reihe von Studien eine Verbindung zwischen Beeinträchtigungen im nukleozytoplasmatischen Weg und sowohl der amyotrophischen Lateralsklerose (ALS) als auch der frontotemporalen Demenz (FTD) ^{5 , 6 gezeigt , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12} . ALS ist eine fortschreitende und tödliche neurodegenerative Erkrankung, die sowohl die oberen als auch die unteren motorischen Neuronen (MNs) ¹³ beeinflusst und zu einer Lähmung und letztlich zum Tode führt, innerhalb von 2-5 Jahren im Durchschnitt. Die meisten Fälle von ALS werden als sporadische (SALS) eingestuft, ohne jede offensichtliche genetische Verknüpfung, aber 10% werden dominant vererbt (familiäres ALS, FALS). Kürzlich wurden Hexanukleotid-Wiederholungserweiterungen (HREs) im Chromosom 9 offenen Leserahmen 72 (C9orf72) Gen ^{14 , 15} als genetische Ursache von ALS und FTD identifiziert. Diese Mutanten machen 30-40% der FALS-Fälle aus, und verschiedene Studien haben behauptetDass sie eine Toxizität durch Beeinträchtigung des nucleozytoplasmatischen Transports verursachen ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12} .

Diese Studien haben zumeist die endgültigen Ergebnisse und Manifestationen von HREs auf den nucleozytoplasmatischen Transport gezeigt, aber sie zeigen keine nukleocytoplasmatische Störung in Echtzeit. Infolgedessen wurde nur ein schwerer nukleozytoplasmatischer Transportmangel ^{11 , 17 , 18} untersucht.

Dieses Protokoll beschreibt eine neue und veRy-sensitiven Assay zur Bewertung und Quantifizierung der nukleozytoplasmatischen Transportdysfunktion in Echtzeit. Die Importrate eines NLS-NES-GFP-Proteins (Shuttle-GFP) kann in Echtzeit mittels Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert werden. Dies geschieht unter Verwendung eines Exportin-Inhibitors, wie zuvor beschrieben, so daß der Shuttle-GFP nur in den Kern gelangen kann. Mit der Fluoreszenzmikroskopie und einer Software, die in der Lage ist, Fluoreszenzveränderungen in Echtzeit zu quantifizieren, ist es möglich, allmähliche Änderungen der Fluoreszenzintensität des im Zellkern befindlichen Shuttle-GFP zu quantifizieren. Als Ergebnis kann eine Michaelis-Menten-ähnliche Sättigungskurve der Fluoreszenz-zu-Zeit-Achse, die die Menge an nuklearem Shuttle-GFP zu irgendeiner gegebenen Zeit darstellt, hergestellt werden. Durch die Verwendung der anfänglichen linearen Geschwindigkeit der Kurven ist es möglich, eine Steigung zu erzeugen, die die Eintrittsrate in den Kern vor der Fluoreszenzsättigung darstellt.

Um den Test zu validieren, das übersetzenD C9orf72 Dipeptidwiederholungen, Poly (GR) und Poly (PR), die bisher berichtet wurden, um den nucleozytoplasmatischen Transport zu stören, wurden ^{5 , 7 , 8 , 10 , 12} verwendet. Unter Verwendung dieses Assays wurde eine 50% ige Abnahme der nuklearen Einfuhrrate im Vergleich zur Kontrolle beobachtet. Mit diesem System können winzige Veränderungen im nucleozytoplasmatischen Transport untersucht werden. Darüber hinaus kann die Fähigkeit verschiedener Faktoren, einen nukleozytoplasmatischen Transportdefekt zu retten, bestimmt werden.

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Protokoll

1. Zelllinienvorbereitung

1. Tauen Sie etwa 1.000.000 Maus-Neuroblastom-Rückenmarkszellen (NSC-34-Zellen), die in einem flüssigen Stickstoffbehälter aufbewahrt wurden. Verwenden Sie einen 37 ° C Wasserinkubator, bis die Zellen vollständig aufgetaut sind.
2. Füge frisches, warmes Medium hinzu (DMEM-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 1% L-Glutamin und 1% Pen-Strep-Antibiotika).
3. Zentrifugen aufgetaute Zellen (SL16R) bei 500 xg für 5 min zentrifugieren und ein Zellpellet bilden. Verwerfe das Medium und füge 1 ml neues Medium für die Zellresuspension hinzu.
4. Legen Sie die resuspendierten Zellen in einen 15-ml-Kolben und fügen Sie zusätzliche 5 ml Medium hinzu. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem sterilen Inkubator mit 5% CO ₂ bei 37 ° C.
5. Parallel dazu Platz 8 unbeschichtete Deckgläser (Deckglas: 12 mm, 0,13-0,17 mm dick) in einer 60-mm-Kulturschale und sterilisieren mit 70% Ethanol und ca. 30 min UV-Licht bis zum Trocknen. Fügen Sie Medium zu jeder Schale hinzu und entsorgen Sie, um das restliche Ethanol zu waschen.
6. Fügen Sie Trypsin-Puffer (2,5 g Trypsin und 0,2 g EDTA in 1 l Hanks 'Balanced Salt Solution) zu den Zellen hinzu, nachdem sie etwa 90% Konfluenz erreicht haben (etwa 6 Millionen Zellen pro Kolben), um adhärenten Zellen zu dissoziieren.
   HINWEIS: NSC-34-Zellen sind empfindlich und benötigen nur 15 s Trypsin-Puffer-Inkubation und 1 zusätzliche Min-Inkubation frei von Trypsin vor der Dissoziation mit dem Medium.
7. Die Zellen auf die 60 mm Kulturschalen legen, die bereits die Deckgläser mit 3 ml Medium enthalten, ca. 350.000 pro Schale. Lassen Sie sie in den Inkubator für 24 h, um die Zellbefestigung auf die Deckgläser zu ermöglichen.

2. Zelltransfektion

ANMERKUNG: Nach ca. 24 h erreichen die NSC-34-Zellen 40% Konfluenz (ca. 800.000 Zellen) und sind zur Transfektion bereit.

1. Bereiten Sie reines DMEM-Medium (300 & mgr; l DMEM-Medium für jede 60 mm Kulturschale) in einer sterilen Mikrozentrifugenwanne vorEs
2. Addieren Sie 2 μg jedes Plasmids, das für die Transfektion benötigt wird, zu jedem DMEM-haltigen Mikrozentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Das Shuttle-GFP-Plasmid ist bei allen Zelltransfektionen obligatorisch.
3. Fügen Sie Transfektionsreagenz zu allen Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, die ihre erforderlichen Plasmide enthalten. Hierbei werden 4 μl des handelsüblichen Transfektionsreagens für jeweils 2 μg DNA zugegeben.
4. Vortex die Mikrozentrifugenröhrchen, die DMEM, Plasmide und das Transfektionsreagenz enthalten und diese bei Raumtemperatur für 25 min inkubieren.
5. Fügen Sie jedes Mikrozentrifugenröhrchen zu einer Kulturschale hinzu und rühren Sie die Schale vorsichtig zu einer homogenen Lösung. Legen Sie das Gericht für 48 Stunden in den Inkubator.
   ANMERKUNG: Da Shuttle-GFP in allen Zellen exprimiert werden sollte, kann die Shuttle-GFP-Transfektionseffizienz partiell untersucht und mit einer Fluoreszenzmikroskopie nach der Transfektion über Nacht getestet werden. Eine vollständige Untersuchung von nicht-fluoreszierenden exprimierten Proteinen kann unter Verwendung eines Immunoblot-Analysen durchgeführt werdenIst.

3. Mikroskopie

1. Befestigen Sie die Deckblätter, die transfizierte NSC-34-Zellen enthalten, an einen Deckglashalter und waschen Sie vorsichtig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um die abgetrennten toten Zellen zu entfernen.
2. Identifizieren Sie einen geeigneten Zellflecken mit einem grünen Fluoreszenzfilter mit einem invertierten Mikroskop.
   HINWEIS: Ein geeigneter Zellfleck ist definiert als ein Mikroskop-Sichtfeld, das eine große Anzahl von Zellen (20-30 Zellen in einem Feld) zeigt und in der die Kerne in den Zellen klar definiert sind. Zellkerne innerhalb des Zellflecks werden zuerst mit dem Auge identifiziert und manuell durch die Imaging-Software markiert.
3. Füge 200 μl eines Exportin-1-Inhibitors Leptomycin B (LMB) -Puffer mit 10 ng / mL LMB in PBS zu den Deckgläsern hinzu, indem man den Puffer auf die Deckgläser unter dem Mikroskop tropft.
   HINWEIS: Dieser Zeitpunkt wird als Intervall Null gesetzt.
4. Quantifizierung der Fluoreszenzintensität der markierten Kerne in 3 s Intervallen für ca. 400-500 s.
5. Test zwischen 3 und 5 Deckblättern für jede Transfektionsgruppe in jedem einzelnen Experiment.

4. Analyse

HINWEIS: Da verschiedene Zellen unterschiedliche Ebenen von fluoreszierendem Shuttle-GFP exprimieren, ist es wichtig, die nukleare Fluoreszenzintensität jeder Zelle auf ihre eigene initiale Fluoreszenzintensität zu normalisieren.

1. Normalisieren Sie die Fluoreszenzintensität der markierten Kerne, indem Sie das 3-s-Fluoreszenzintervall jedes Kerns mit dem Durchschnitt der anfänglichen sechs Intervalle dieses Kerns teilen.
2. Nach der Normalisierung jedes Kerns ergibt sich eine Fluoreszenzintensitätskurve, die die Veränderung der Kernfluoreszenz als Funktion der Zeit für jeden Zellflecken darstellt. Um dies zu erreichen, berechnen Sie den Durchschnitt aller Zellen in jedem Zell-Patch (bestehend aus etwa 20-30 Zellen in jedem Patch).
   HINWEIS: Die Nuklei-Fluoreszenz-Intensitätskurve ähnelt einer Michaelis-Menten-Sättigungskurve, die bei erhöhten Ti besser beobachtet wirdIch Perioden. Dies ist auf eine Verringerung der zytosolischen Mengen an Shuttle-GFP mit der Zeit aufgrund des Atomtransports zurückzuführen. Diese Abnahme verringert statistisch die Wahrscheinlichkeit eines Shuttle-GFP, um in den Zellkern zu transportieren, wodurch die Sättigung in der Kernfluoreszenz erreicht wird. Die von der linearen Anfangsrate der Kurve abgeleitete Steigung ergibt die V _max Eintrittsrate in den Kern.
3. Analysieren Sie die V _max- Pisten jedes Zell-Patches, die von drei bis fünf unabhängigen Experimenten abgeleitet wurden, wobei die Grafik-Software verwendet wird, um eine Steilheit zu erzeugen, die jede experimentelle Gruppe repräsentiert. Führen Sie die Quantifizierung mit einer einseitigen ANOVA statistischen Analyse durch.

5. Protein Expression Validierung

1. Legen Sie 60 mm Kulturschalen mit den restlichen Zellen (nicht in der oben genannten Experiment) aus jeder experimentellen Gruppe auf Eis.
2. Das Medium entsorgen und die Zellen zweimal mit PBS waschen, um das verbleibende Medium zu verdünnen und zu waschen.
3. Behandle die Zellen mit 200-400ΜL Lysepuffer, enthaltend PBS, 0,5% Triton und Protease-Inhibitor-Cocktail-Tablette (PI). Kratzen mit einem Zellschaber.
4. Sammeln Sie die Zellen in Lysepuffer in einem Mikrozentrifugenröhrchen und homogenisieren Sie mit einem Homogenisator bei 4.000 U / min für 1 min unter Eis.
5. Zentrifugieren der homogenisierten Zellen bei 2500 xg für 10 min. Sammeln Sie den Überstand, quantifizieren Sie die Proteinkonzentration unter Verwendung eines Bradford-Assays und lagern bis zur Verwendung bei -20 ° C.
6. Sammle zwischen 30 und 70 μg Gesamtprotein (abhängig vom Protein) und lade es in ein SDS-PAGE-Gel, um die Proteinexpression unter Verwendung eines Immunoblot-Assays zu testen.

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Ergebnisse

Unter Verwendung des hier vorgestellten Verfahrens wurden motorneuronartige NSC-34-Zellen mit einem NLS-NES-GFP (Shuttle-GFP) -Protein transfiziert. Dieses Protein, das NLS- und NES-Signalsequenzen aufweist (Abbildung 1 ), kann zwischen dem Zellkern und dem Cytoplasma pendeln. Generisches GFP kann den Kern in Abwesenheit eines Lokalisierungssignal-Tags nur durch Diffusion eintreten oder verlassen und ist daher gleichmäßig zwischen dem Kern und dem Cytoplasma verteilt (...

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Diskussion

Dieses Protokoll zeigt einen hochempfindlichen und quantitativen neuen Assay, um winzige Veränderungen im nucleozytoplasmatischen Transport zu bewerten. Mit diesem System ist es möglich, den nucleozytoplasmatischen Transport und seine Dysfunktion in Echtzeit zu beobachten und zu messen, nicht nur große Defekte, die zu dramatischen Veränderungen der Proteinverteilung führen. Dieser Assay hat nicht nur einen Sensitivitätsvorteil, sondern erfordert auch wenig Vorbereitung, ist preiswert und ist ein sehr einfacher und...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)	tebu-bio	CLU140-A
DMEM 4.5 g/L L-glucose	Biological Industries	01-055-1A
FBS European Grade	Biological Industries	04-007-1A
SL 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004030
Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Scientific	3111
Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thick	Bar Naor LTD
TurboFect Transfection Reagent	Thermo Scientific	R0531
Axiovert 100 inverted microscope	Zeiss
Imaging Workbench 2	Axon Instruments
Leptomycin B	Sigma	L2913
PBS	Biological Industries	02-023-1A
Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clamp	Glas-Col	099C K5424CE
MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated	Thermo Scientific	75002455