運動ニューロン様NSC-34細胞内のリアルタイムでの核細胞質輸送を測定するアッセイ

要約

このプロトコルは、NLS-NES-GFPタンパク質の核内取り込みにおけるリアルタイム変化を定量化することにより、運動ニューロン様NSC-34細胞内の核細胞質輸送速度を敏感に測定する方法を記載する。

要約

核細胞質輸送は、細胞核からの大きな分子の輸入および輸出を指す。最近、多くの研究が、筋萎縮性側索硬化症（ALS）と核細胞質経路における障害との関連を示している。 ALSは、運動ニューロンに影響を及ぼし、麻痺をもたらし、最終的には死亡し、2〜5年以内に平均して起こる神経変性疾患である。 ALSのほとんどの症例は散発的であり、明らかな遺伝的連鎖を欠いているが、10％が優勢に遺伝する。最近、第9染色体のオープンリーディングフレーム72（C9orf72）遺伝子におけるヘキサヌクレオチド反復増幅（HRE）が、ALSおよび前頭側頭型痴呆（FTD）の遺伝的原因として同定された。重要なことに、異なるグループは最近、これらの突然変異体が核細胞質輸送に影響を及ぼすことを提案している。これらの研究は、核細胞質輸送に関するHREによって引き起こされる最終的な結果および徴候をほとんど示しているが、核内輸送機能障害を示さないリアルタイム。結果として、重度の核細胞質輸送の欠損のみが、主に高過剰発現または外因性タンパク質挿入のために決定され得る。

このプロトコルは、リアルタイムでnucleocytoplasmic輸送機能不全を評価し定量化するための新しい非常に敏感なアッセイを記述します。 NLS-NES-GFPタンパク質（シャトル-GFP）の輸入率は、蛍光顕微鏡を用いてリアルタイムで定量することができる。これは、exportinインヒビターを用いて行われ、シャトルGFPのみが核に入ることを可能にする。アッセイを有効にするために、以前に核細胞質輸送を破壊することが示されているC9orf72 HRE翻訳ジペプチドリピート、ポリ（GR）およびポリ（PR）を使用した。記載されたアッセイを用いて、対照と比較して核輸入率の50％の減少が観察された。このシステムを用いて、核細胞質輸送の微小な変化を調べることができ、異なる因子が核細胞質trを（部分的に）救済する能力欠陥を判定することができる。

概要

核細孔複合体（NPC）は、細胞核に出入りする大分子の輸出入を制御する。第¹規則なしで核に入ることができる小分子とは対照的に、より大きな分子の輸送はNPCによって強く制御される。タンパク質やRNAなどのこれらの大きな分子は、輸入や輸出を含む輸送要因と関連して核²から輸入され、輸出されます² 。輸入するためには、蛋白質には、一般に核局在化シグナル（NLS）と呼ばれる小さなペプチドモチーフが含まれていなければならない。これらのアミノ酸配列はタグとして作用し、組成物^{3,4 において}多様である。タンパク質は、それらのエクスポージャーとの関連性のために、核から細胞質に輸出することができる一般に核輸出シグナル（NES） ²と呼ばれるシグナル配列に結合する。輸入業者と輸出業者の両方は、小型Ras関連核タンパク質GTPアーゼ（Ran） ^2の調節のために貨物を輸送することができる。 Ranは、それがGTPまたはGDPに結合しているかどうかによって、異なる立体構造状態で存在することが示されている。 GTPに結合すると、Ranはimportinまたはexportinにバインドできます。 RanGTPに結合すると、インポートインはそれらの貨物を放出するが、輸出はRanGTPに結合して輸出貨物と複合体を形成しなければならない。 Ranの優勢なヌクレオチド結合状態は、核（RanGTP）または細胞質（RanGDP）におけるその位置に依存する。

最近、いくつかの研究が、核細胞質経路の障害と筋萎縮性側索硬化症（ALS）および前頭側頭型痴呆（FTD）の両方の間の関連を示している5,6 ^{、 7、8、9、10、11、12} 。 ALSは、上下運動ニューロン（MN） ¹³に影響を及ぼし、麻痺をもたらし、最終的には死亡し、平均で2〜5年以内に進行する致死的な神経変性疾患である。 ALSのほとんどの症例は散発性（SALS）と分類され、明らかな遺伝的連鎖はないが、10％が優性遺伝（家族性ALS; FALS）で遺伝する。最近、ALSおよびFTDの遺伝的原因として、第9染色体のオープンリーディングフレーム72（C9orf72）遺伝子におけるヘキサヌクレオチド反復増幅（HRE）が^14,15であることが同定された。これらの突然変異体は、FALS症例の30〜40％を占め、異なる研究が争われているそれらが核細胞質輸送5,6,7,8,9,10,11,12に影響を及ぼすことによって毒性を引き起こすことを示している。

これらの研究は、核細胞質輸送に関するHREの最終的な結果および発現をほとんど示しているが、リアルタイムで核細胞質崩壊を示さない。その結果、重度の核細胞質輸送の欠損のみが評価された11,17,18。

このプロトコルは、新しいとveリアルタイムで核細胞輸送機能不全を評価および定量するためのry感受性アッセイ。 NLS-NES-GFPタンパク質（シャトル-GFP）の輸入率は、蛍光顕微鏡を用いてリアルタイムで定量することができる。これは、以前に記載されているように、exportinインヒビターを用いて行われ、シャトル-GFPのみが核に入ることを可能にする。蛍光顕微鏡およびリアルタイムで蛍光変化を定量化することができるソフトウェアを使用して、核内に位置するシャトル-GFPの蛍光強度の段階的変化を定量化することが可能である。結果として、任意の所与の時間における核シャトル-GFPの量を表す、蛍光対時間軸のミカエリス - メンテン様の飽和曲線を作成することができる。曲線の初期線形速度を用いることにより、蛍光飽和前に核への進入速度を表す勾配を生成することが可能である。

アッセイを検証するために、翻訳以前に核細胞質輸送を破壊すると報告されているd C9orf72ジペプチドリピート、ポリ（GR）およびポリ（PR）を5,7,8,10,12で使用した。このアッセイを用いて、対照と比較して核の輸入率の50％の減少が観察された。このシステムを用いて、核細胞質輸送の微小な変化を調べることができる。さらに、核細胞質輸送欠陥を救済する異なる因子の能力を決定することができる。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

1.細胞株の調製

1. 液体窒素容器に保存されたマウス神経芽細胞腫脊髄細胞（NSC-34細胞）を約1,000,000個解凍。細胞が完全に解凍するまで、37°C​​の水インキュベーターを使用してください。
2. 新鮮な暖かい培地（10％ウシ胎仔血清（FBS）、1％L-グルタミン、および1％ペン - ストレプト系抗生物質を含むDMEM培地）を加える。
3. 解凍した細胞（SL16R）を500×gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを形成する。培地を捨て、細胞再懸濁のために新しい培地1 mLを加える。
4. 再懸濁した細胞を15mLフラスコに入れ、培地5mLを追加する。 37℃で5％CO ₂を含む無菌インキュベーターで細胞を一晩インキュベートする。
5. 平行して、60mmの培養皿に8枚の被覆されていないカバーガラス（カバーガラス：12mm、0.13-0.17mm厚）を置き、70％エタノールを用いて滅菌し、乾燥するまで30分間UV光に暴露する。各ディッシュに培地を加え、処分して残留エタノールを洗い流す。
6. 接着細胞が解離するのを可能にするために約90％コンフルエンス（約600万細胞/フラスコ）に到達した後、細胞にトリプシン緩衝液（2.5gのトリプシンおよび0.2gのEDTAを1Lのハンクス平衡塩溶液中に加える。
   注：NSC-34細胞は高感度であり、培地を使用して解離する前に、トリプシン緩衝液インキュベーション15秒およびトリプシンを含まないインキュベーション1分を必要とするのみである。
7. 1枚のプレートにつき約35万の培地3mLを含むカバースリップを既に含む60mm培養皿上に細胞をプレートする。インキュベーターに24時間放置し、カバースリップ上に細胞を付着させます。

2.細胞トランスフェクション

注：約24時間後、NSC-34細胞は40％コンフルエンシー（約800,000細胞）に達し、トランスフェクションの準備が整うでしょう。

1. 純粋なDMEM培地（各60mm培養皿のための300μLのDMEM培地）を滅菌微量遠心分離槽es。
2. 各DMEM含有マイクロ遠心チューブにトランスフェクションに必要な各プラスミド2μgを加えます。
   注：シャトル-GFPプラスミドは、すべての細胞トランスフェクションにおいて必須です。
3. 必要なプラスミドを含むすべてのマイクロ遠心チューブにトランスフェクション試薬を加えます。ここでは、市販のトランスフェクション試薬4μLを2μgのDNAごとに添加します。
4. DMEM、プラスミド、トランスフェクション試薬を含むマイクロ遠心チューブをボルテックスし、室温で25分間インキュベートする。
5. 各微量遠心チューブを培養皿に加え、皿を静かに攪拌して均質な溶液を形成させる。 48時間インキュベーターに皿を戻します。
   注：shuttle-GFPはすべての細胞で発現する必要があるため、シャトル-GFPトランスフェクション効率は、一晩のトランスフェクション後に部分的に検査し、蛍光顕微鏡を使用して事前試験することができます。非蛍光発現タンパク質の完全な検査は、イムノブロット分析です。

3.顕微鏡検査

1. トランスフェクションされたNSC-34細胞を含むカバースリップをカバースリップホルダーに取り付け、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で穏やかに洗って、剥がれた死細胞を除去する。
2. 倒立顕微鏡を備えた緑色蛍光フィルターを使用して、適切な細胞パッチを同定する。
   注：適切な細胞パッチは、多数の細胞（野外で20〜30個の細胞）を示し、細胞内で核が明確に定義されている顕微鏡視野と定義されています。細胞パッチ内の細胞核は、最初に目で同定され、イメージングソフトウェアによって手動でマークされる。
3. 顕微鏡下でカバーガラス上にバッファーを滴下することによってカバースリップにPBS中10ng / mL LMBを含む200μLのexportin-1阻害剤Leptomycin B（LMB）バッファーを加える。
   注：この時点は間隔ゼロとして設定されます。
4. 約400〜500秒間、3秒間隔でマークされた核の蛍光強度を定量する。
5. 個々の実験において、各トランスフェクショングループについて3〜5枚のカバースリップをテストする。

4.分析

注：異なる細胞は異なるレベルの蛍光シャトル-GFPを発現するので、各細胞の核蛍光強度をそれ自身の初期蛍光強度に正規化することが重要である。

1. 各核の3秒間の蛍光間隔をその核の最初の6回の間隔の平均で割ることによって、マークされた核の蛍光強度を標準化する。
2. 各核の正規化の後、各細胞パッチの時間の関数としての核の蛍光の変化を表す蛍光強度曲線を生成する。これを行うには、各細胞パッチ（各パッチで約20〜30個の細胞からなる）のすべての細胞の平均を計算する。
   注：核の蛍光強度曲線はミカエリス - メンテン飽和曲線に似ていますが、これは増加したti内でよりよく観察されます私の時代。これは、核輸送による経時的なシャトル-GFPの細胞質ゾル量の減少によるものである。この減少は、シャトル-GFPが核に輸送される確率を統計的に低下させ、したがって核蛍光の飽和に達する。曲線の線形初期速度から導出された勾配は、核へのV _max入射速度をもたらす。
3. グラフ作成ソフトウェアを使用して、3〜5回の独立した実験から得られた各細胞パッチのV _max勾配を分析して、各実験群を表す1つの勾配を生成する。一元配置ANOVA統計分析を使用して定量を行います。

5.タンパク質発現の確認

1. 氷上で各実験群からの残存細胞（上記の実験では使用されていない）を含む60mm培養皿を置く。
2. 培地を廃棄し、細胞をPBSで2回洗浄し、残りの培地を希釈して洗浄する。
3. 細胞を200〜400で処理するPBS、0.5％トリトン、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（PI）を含有する溶解緩衝液μL。セルスクレーパーを使用してスクレーピングする。
4. マイクロ遠心チューブ中で細胞を溶解緩衝液に集め、氷下で4,000rpmで1分間ホモジナイザーでホモジナイズする。
5. ホモジナイズした細胞を2,500 xgで10分間遠心分離する。上清を回収し、Bradfordアッセイを用いてタンパク質濃度を定量し、-20℃で使用するまで保存する。
6. 30〜70μgの全タンパク質（タンパク質に依存する）を収集し、SDS-PAGEゲルにロードして、イムノブロットアッセイを用いてタンパク質発現を試験する。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

ここに示した手順を用いて、運動ニューロン様NSC-34細胞を、NLS-NES-GFP（シャトル-GFP）タンパク質でトランスフェクトした。 NLSおよびNESシグナル配列を有するこのタンパク質（ 図1 ）は、核と細胞質との間を行き来することができる。一般的なGFPは、拡散によってのみ局在化シグナルタグが存在しない場合に核に出入りすることができ、従って、核と細胞?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

このプロトコールは、核細胞質輸送における微小変化を評価するための、高感度かつ定量的な新しいアッセイを実証している。このシステムを使用すると、蛋白質の分布に劇的な変化をもたらす大きな欠損だけでなく、リアルタイムで核細胞質輸送およびその機能不全を観察および測定することが可能である。このアッセイは、感度優位性を有するばかりでなく、調製もほとんど必要とせず?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)	tebu-bio	CLU140-A
DMEM 4.5 g/L L-glucose	Biological Industries	01-055-1A
FBS European Grade	Biological Industries	04-007-1A
SL 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004030
Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Scientific	3111
Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thick	Bar Naor LTD
TurboFect Transfection Reagent	Thermo Scientific	R0531
Axiovert 100 inverted microscope	Zeiss
Imaging Workbench 2	Axon Instruments
Leptomycin B	Sigma	L2913
PBS	Biological Industries	02-023-1A
Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clamp	Glas-Col	099C K5424CE
MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated	Thermo Scientific	75002455