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요약

이 프로토콜은 NLS-NES-GFP 단백질의 핵 임포트에서 실시간 변화를 정량화함으로써 모터 뉴런과 유사한 NSC-34 세포 내에서 핵 세포질 수송 속도를 민감하게 측정하는 방법을 설명합니다.

초록

Nucleocytoplasmic 수송은 세포핵에서 큰 분자의 수입과 수출을 의미합니다. 최근 여러 연구에서 근 위축성 측삭 경화증 (ALS)과 핵 세포질 경로의 손상이 연관되어 있음이 밝혀졌습니다. ALS는 평균 2 ~ 5 년 내에 마비가되고 궁극적으로 사망에 이르는 운동 신경 세포에 영향을주는 신경 퇴행성 질환입니다. ALS의 대부분의 경우는 산발적이며 명백한 유전 적 연계가 없지만 10 %는 지배적 인 방식으로 유전됩니다. 최근, 염색체 9 ​​오픈 리딩 프레임 72 (C9orf72) 유전자의 헥사 뉴클레오타이드 반복 확장 (HREs)이 ALS 및 전두 측두엽 치매 (FTD)의 유전 적 원인으로 확인되었다. 중요한 것은, 다른 그룹은 최근 이러한 돌연변이가 nucleocytoplasmic 수송에 영향을 제안했습니다. 이 연구들은 핵 세포질 수송에 대한 HRE에 의해 야기되는 최종 결과와 증상을 대부분 보여 주었지만, 핵 수송 장애를 증명하지는 못했다.실시간. 결과적으로 심각한 핵 세포질 운반체 결핍이 결정될 수 있는데, 이는 대부분 높은 과발현 또는 외인성 단백질 삽입 때문이다.

이 프로토콜은 실시간으로 nucleocytoplasmic 수송 장애를 평가하고 정량화하는 새롭고 매우 민감한 분석을 설명합니다. NLS-NES-GFP 단백질 (shuttle-GFP)의 유입 속도는 형광 현미경을 사용하여 실시간으로 정량화 할 수 있습니다. 이것은 exportin 억제제를 사용하여 수행되므로 셔틀 GFP 만 핵에 들어갈 수 있습니다. 분석을 검증하기 위해, 이전에 핵 세포질 수송을 방해하는 것으로 밝혀진 C9orf72 HRE 번역 된 디 펩티드 반복체, 폴리 (GR) 및 폴리 (PR)이 사용되었다. 설명 된 분석법을 사용하여, 대조군과 비교하여 핵 수입율이 50 % 감소했다. 이 시스템을 사용하여 nucleocytoplasmic transport의 미세한 변화를 조사 할 수 있으며 nucleustoplasmic tr (심지어 부분적으로)을 구출하는 여러 요소의 능력진단 결함이 결정될 수 있습니다.

서문

NPC (nuclear pore complex)는 세포핵 내외로의 큰 분자의 반입 및 반출을 제어합니다. 제 1 규칙없이 핵에 들어갈 수있는 작은 분자와 달리, 더 큰 분자의 수송은 NPC에 의해 강력하게 제어된다. 단백질과 RNA와 같은 이러한 거대 분자는 임 핀틴 (importin)과 엑스 핀틴 (exportins)을 포함한 수송 요소와 연관되어 핵에서 수입되고 수출된다. 수입을 위해서, 단백질은 일반적으로 핵 위치 확인 신호 (NLS)라고 불리는 작은 펩타이드 모티프를 가져야하며, 이것은 임포트린 2 에 의해 결합됩니다. 이러한 아미노산의 배열은 tag로 작용하고 composition 3 , 4 에서 다양합니다. 단백질은 exportin과의 연관 때문에 핵에서 세포질로 내보낼 수 있습니다.일반적으로 핵 수출 신호 (nuclear export signal, NES) 2 라고 불리는 신호 서열에 결합한다. 수입업자와 수출업자 모두 작은 Ras 관련 핵 단백질 GTPase (Ran) 2 의 규제로 인해화물을 운송 할 수 있습니다. Ran은 그것이 GTP 또는 GDP에 결합되어 있는지 여부에 따라 다른 형태의 상태로 존재하는 것으로 나타났습니다. GTP에 바인딩되면 Ran은 importins 또는 exportins에 바인딩 할 수 있습니다. RanGTP에 바인딩되면 수입업자는화물을 방출하고 수출업자는 RanGTP를 묶어 수출화물과 복합체를 형성해야합니다. Ran의 지배적 인 뉴클레오타이드 결합 상태는 핵 (RanGTP) 또는 세포질 (RanGDP)에서의 그의 위치에 의존한다.

최근 많은 연구에서 핵 세포질 경로의 손상과 근 위축성 측삭 경화증 (ALS)과 전 측두엽 성 치매 (FTD) 사이의 연관성이 밝혀졌습니다 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . ALS는 상부 및 하부 운동 뉴런 (MN) 13 모두에 영향을 미치고 평균적으로 2 ~ 5 년 내에 마비와 궁극적으로 사망에 이르는 진행성 및 치명적인 신경 퇴행성 질환입니다. ALS의 대부분의 경우는 산발적 (SALS)으로 분류되며 명백한 유전 적 연계가 없지만 10 %는 우성 방식 (가족 성 ALS; FALS)으로 유전됩니다. 최근, ALS와 FTD의 유전 적 원인으로 염색체 9 ​​오픈 리딩 프레임 72 (C9orf72) 유전자의 헥사 뉴클레오타이드 반복 확장 (HREs)이 14 , 15 로 확인되었다. 이러한 돌연변이는 FALS 사례의 30-40 %를 차지하고 있으며, 여러 연구가 쟁점을 가지고있다핵 세포질 수송에 영향을줌으로써 독성을 유발한다는 것. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .

이 연구들은 핵 세포질 수송에 대한 HRE의 최종 결과와 발현을 대부분 보여 주었지만 실시간으로 핵 세포질 파괴를 입증하지 못했습니다. 그 결과 심한 핵 세포질 운반체 결핍이 11 , 17 , 18 에서만 평가되었다.

이 프로토콜은 새롭고실시간으로 nucleocytoplasmic transport dysfunction을 평가하고 정량화하는 민감 분석. NLS-NES-GFP 단백질 (shuttle-GFP)의 유입 속도는 형광 현미경을 사용하여 실시간으로 정량화 할 수 있습니다. 이것은 이전에 설명한 바와 같이 exportin 억제제를 사용하여 이루어 지므로 셔틀 -GFP 만 핵에 들어갈 수 있습니다. 형광 현미경 및 실시간으로 형광 변화를 정량화 할 수있는 소프트웨어를 사용하여 핵에 위치한 셔틀 -GFP의 형광 강도의 점진적 변화를 정량화 할 수 있습니다. 결과적으로, 임의의 주어진 시간에서 핵 셔틀 -GFP의 양을 나타내는 형광 - 시간 축의 미카엘리스 - 멘틴 (Michaelis-Menten) 형 포화 곡선이 만들어 질 수있다. 곡선의 초기 선형 속도를 사용하여 형광 포화 전에 핵에 들어가는 속도를 나타내는 기울기를 생성 할 수 있습니다.

분석을 확인하기 위해 번역이전에 핵 세포질 수송을 방해한다고보고 된 C9orf72 디 펩티드 반복체, 폴리 (GR) 및 폴리 (PR)은 5 , 7 , 8 , 10 , 12로 사용 되었다. 이 분석법을 사용하여, 대조군에 비해 핵 수입률이 50 % 감소했다. 이 시스템을 사용하여 nucleocytoplasmic 수송의 미세한 변화를 검사 할 수 있습니다. 또한, nucleocytoplasmic 전송 결함을 구출하는 다양한 요인의 능력을 확인할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 세포주 준비

  1. 액체 질소 용기에 저장되어있는 마우스 신경 모세포종 척수 세포 (NSC-34 cells) 약 1,000,000 개를 해동합니다. 세포가 완전히 해동 될 때까지 37 ° C의 물 배양기를 사용하십시오.
  2. 신선한, 따뜻한 매체 (10 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % L - 글루타민, 1 % 펜 strep 항생제를 포함하는 DMEM 매체)를 추가합니다.
  3. 5 분 동안 500xg에서 해동 된 세포 (SL16R)를 원심 분리하여 세포 펠렛을 형성한다. 배지를 버리고 세포 재현 탁의 새로운 배지 1 mL를 첨가한다.
  4. 15 ML 플라스크에 resuspended 세포를 놓고 여분의 5 ML 매체를 추가합니다. 37 ° C에서 5 % CO 2 와 멸균 배양기에서 하룻밤 사이에 세포를 품어.
  5. 병행하여, 60mm 배양 접시에 8 개의 코팅되지 않은 커버 슬립 (커버 유리 : 12mm, 0.13-0.17mm 두께)을 놓고 70 % 에탄올을 사용하여 멸균하고 건조 될 때까지 30 분간 자외선에 노출시킵니다. 각 접시에 매체를 넣고 처분하여 잔류 에탄올을 씻어냅니다.
  6. 그들이 약 90 % 합류 (플라스크 당 약 6 백만 세포)에 도달 후 접착 세포가 해리 수 있도록 트립신 버퍼 (2.5g의 트립신과 행크의 균형 소금 솔루션 1L에 EDTA 0.2g)를 추가합니다.
    주의 : NSC-34 세포는 민감하며, 배지를 사용하기 전에 트립신 완충 배양 15 초 및 트립신이없는 배양 1 분을 추가로 요구한다.
  7. 접시 당 약 35,000, 매체 3 ML과 coverslips 이미 포함 된 60mm 문화 요리에 세포를 판다. coverslips에 세포 부착을 허용하기 위해 24 시간 동안 인큐베이터에 그들을 남겨주세요.

2. 세포 형질 감염

참고 : 약 24 시간 후, NSC-34 세포는 40 % 컨 플루 언스 (약 800,000 세포)에 도달하고 형질 감염을위한 준비가 완료됩니다.

  1. 살균 microcentrifuge 욕조에 순수 DMEM 매체 (각 60mm 문화 접시에 대한 DMEM 매체 300 μL)를 준비es.
  2. 각 DMEM 포함 microcentrifuge 튜브에 transfection에 필요한 각 플라스미드 2 μg을 추가합니다.
    참고 : 셔틀 -GFP 플라스미드는 모든 세포 형질 감염에서 필수적입니다.
  3. 필요한 플라스미드가 들어있는 모든 미세 원심 분리 튜브에 트랜스 팩션 시약을 넣으십시오. 여기에 2 μg의 DNA마다 상업용 형질 전환 시약 4 μL를 넣으십시오.
  4. DMEM, 플라스미드 및 형질 감염 시약이 들어있는 미세 원심 분리 튜브를 와동시키고 실내 온도에서 25 분 동안 배양하십시오.
  5. 배양 접시에 각 미세 원심 분리 관을 추가하고 부드럽게 균질 한 용액을 형성하도록 접시를 저어주십시오. 48 시간 동안 인큐베이터에서 접시를 다시 놓습니다.
    참고 : shuttle-GFP는 모든 세포에서 발현되어야하므로 shuttle-GFP transfection 효율을 부분적으로 검사하고 밤새 형질 감염 후 형광 현미경을 사용하여 사전 테스트 할 수 있습니다. 면역 형광법 분석기를 사용하여 비 형광으로 발현 된 단백질의 전체 검사를 수행 할 수 있습니다.입니다.

3. 현미경 검사

  1. 분리 된 죽은 세포를 제거하기 위해 coverslip 홀더에 transfected NSC-34 세포를 포함 coverslips를 첨부하고 인산염 완충 식염수 (PBS)로 부드럽게 씻으십시오.
  2. 거꾸로 된 현미경으로 녹색 형광 필터를 사용하여 적합한 세포 패치를 식별.
    참고 : 적합한 세포 패치는 많은 수의 세포 (한 분야에서 20-30 개의 세포)와 핵이 세포에서 명확하게 정의되어있는 현미경 시야로 정의됩니다. 세포 패치 내의 세포 핵은 먼저 눈으로 확인되고 이미징 소프트웨어에 의해 수동으로 표시됩니다.
  3. 현미경으로 coverslips에 버퍼를 물방울에 coverslips에 PBS에 10 NG / ML LMB를 포함 exportin - 1 억제제 Leptomycin B (LMB) 버퍼의 200 μL를 추가합니다.
    참고 :이 시점은 간격 0으로 설정됩니다.
  4. 약 400-500 초 동안 3 초 간격으로 표시된 핵의 형광 강도를 정량화하십시오.
  5. 각 실험에서 각 transfection 그룹에 대해 3 ~ 5 커버 슬립을 테스트하십시오.

4. 분석

참고 : 다른 세포가 형광성 셔틀 GFP의 다른 수준을 표현하기 때문에 각 세포의 핵 형광 강도를 자체 초기 형광 강도로 정상화하는 것이 중요합니다.

  1. 각 핵의 3 초 형광 간격을 핵의 초기 6 개 간격의 평균으로 나누어 표시 핵의 형광 강도를 표준화합니다.
  2. 각 핵의 정상화 후, 각 세포 패치에 대한 시간의 함수로서 핵 형광의 변화를 나타내는 형광 강도 곡선을 생성하십시오. 이렇게하려면 각 세포 - 패치 (각 패치에서 대략 20-30 개의 세포로 이루어짐)의 모든 세포의 평균을 계산하십시오.
    참고 : 핵 형광 강도 곡선은 마이클리스 - 멘텐 포화 곡선과 유사하며, 증가 된 ti 내에서 더 잘 관찰됩니다나 마침표. 이것은 핵 수송으로 인한 시간에 따른 셔틀 -GFP의 세포질 양의 감소 때문이다. 이 감소는 셔틀 -GFP가 핵으로 운반 될 확률을 통계적으로 낮추어 핵 형광에서 포화 상태에 이른다. 곡선의 선형 초기 속도로부터 유도 된 기울기는 핵으로의 Vmax 진입 속도를 산출한다.
  3. 그래프 소프트웨어를 사용하여 3-5 개의 독립적 인 실험에서 파생 된 각 셀 패치의 V 최대 기울기를 분석하여 각 실험 그룹을 나타내는 하나의 기울기를 생성합니다. 일원 분산 분석 (ANOVA) 통계 분석을 사용하여 정량화를 수행하십시오.

5. 단백질 발현 검증

  1. 얼음에 각 실험 그룹에서 잔여 세포 (위의 실험에 사용되지 않음)를 포함 60mm 문화 요리를 놓으십시오.
  2. 배지를 버리고 PBS로 세포를 두 번 씻어서 희석하고 나머지 배지를 씻으십시오.
  3. 200-400으로 세포를 치료하십시오.PBS, 0.5 % 트리톤 및 프로테아제 억제제 칵테일 타블렛 (PI)을 함유하는 용해 완충액 1 μL. 셀 스크레이퍼를 사용하여 긁으십시오.
  4. microcentrifuge 튜브에 용해 버퍼에 세포를 수집하고 얼음 아래 1 분 4,000 rpm으로 homogenizer로 균질.
  5. 10 분 2,500 XG에서 균질 세포를 원심 분리기. 상등액을 수집하고, Bradford 분석법을 사용하여 단백질 농도를 정량화하고 -20 ℃에서 사용할 때까지 보관하십시오.
  6. 총 단백질 30 ~ 70 μg (단백질에 따라 다름)을 모으고 SDS-PAGE 젤에 넣고 면역 블 롯 분석을 사용하여 단백질 발현을 시험합니다.

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결과

여기에 제시된 절차를 사용하여, 모터 뉴런과 같은 NSC-34 세포를 NLS-NES-GFP (셔틀 -GFP) 단백질로 형질 감염시켰다. 이 단백질은 NLS와 NES 신호 서열 ( 그림 1 )을 가지고 있으며, 핵과 세포질 사이를 왕래 할 수 있습니다. 일반 GFP는 확산에 의해서만 현지화 신호 태그가 없기 때문에 핵에 들어 오거나 나가기 때문에 핵과 세포질 사이에 고르게 분포됩니다 ( 그?...

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토론

이 프로토콜은 nucleocytoplasmic 교통의 미세 변화를 평가하는 매우 민감하고 정량적 인 새로운 분석을 보여줍니다. 이 시스템을 사용하면 단백질 분포에서 극적인 변화를 가져 오는 큰 결함뿐만 아니라 실시간으로 핵 세포질 수송과 그 기능 장애를 관찰하고 측정하는 것이 가능합니다. 이 분석법은 감도 우위를 가질뿐만 아니라 준비가 거의 필요없고 저렴하며 매우 쉽고 낮은 결합 분석법입니다.

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공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

우리는 AI 실험실의 모든 구성원에게 도움이되는 의견과 제안을 해주신 것에 대해 감사드립니다. 셔틀 -GFP 벡터를 제공 한 Mark Hipp 교수 (Max Planck 생화학 연구소)에 감사드립니다. 이 연구는 이스라엘 과학 재단 (ISF # 124 / 14), Binational Science Foundation (BSF # 2013325), FP7 Marie Curie Career Integration Grant (CIG # 333794), Israel National Psychobiology Institute NIPI # b133-14 / 15).

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)tebu-bioCLU140-A
DMEM 4.5 g/L L-glucoseBiological Industries01-055-1A
FBS European GradeBiological Industries04-007-1A
SL 16R CentrifugeThermo Scientific75004030
Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 IncubatorThermo Scientific3111
Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thickBar Naor LTD
TurboFect Transfection ReagentThermo ScientificR0531
Axiovert 100 inverted microscopeZeiss
Imaging Workbench 2Axon Instruments
Leptomycin BSigmaL2913
PBSBiological Industries02-023-1A
Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clampGlas-Col099C K5424CE
MicroCL 17R Centrifuge, RefrigeratedThermo Scientific75002455

참고문헌

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