Ensaio para Medir o Transporte Nucleocitoplasmático em Tempo Real dentro de Células NSC-34 do tipo Motor-Neuron

Resumo

Este protocolo descreve um método para medir sensivelmente a taxa de transporte nucleocitoplasmático dentro de células NSC-34 do tipo neurônio motor, quantificando a mudança em tempo real na importação nuclear de uma proteína NLS-NES-GFP.

Resumo

O transporte nucleocitoplasmático refere-se à importação e exportação de grandes moléculas do núcleo celular. Recentemente, vários estudos têm mostrado uma ligação entre a esclerose lateral amiotrófica (ELA) e deficiências na via nucleocitoplasmática. ALS é uma doença neurodegenerativa que afeta os neurônios motores e resultando em paralisia e, finalmente, na morte, em média 2-5 anos. A maioria dos casos de ELA são esporádicos, sem qualquer ligação genética aparente, mas 10% são herdados de forma dominante. Recentemente, as expans�s de repeti�o de hexanucle�idos (HREs) no gene 72 de leitura aberta do cromossoma 9 (C9orf72) foram identificadas como uma causa gen�ica de ALS e dem�cia frontotemporal (FTD). É importante notar que diferentes grupos propuseram recentemente que estes mutantes afectam o transporte nucleocitoplasmático. Esses estudos mostram principalmente o resultado final e manifestações causadas por HREs sobre o transporte nucleocitoplasmático, mas eles não demonstram disfunção de transporte nuclear emtempo real. Como resultado, apenas a deficiência grave de transporte nucleocitoplasmático pode ser determinada, principalmente devido à alta sobreexpressão ou inserção de proteína exógena.

Este protocolo descreve um ensaio novo e muito sensível para avaliar e quantificar a disfunção nucleocitoplasmática de transporte em tempo real. A taxa de importação de uma proteína NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) pode ser quantificada em tempo real utilizando microscopia de fluorescência. Isto é realizado utilizando um inibidor de exportação, permitindo assim que a GFP de transporte apenas entre no núcleo. Para validar o ensaio, utilizaram-se as repetições de dipeptídeos traduzidos por HRE de C9orf72, poli (GR) e poli (PR), que anteriormente foram mostrados como perturbadores do transporte nucleocitoplasmático. Utilizando o ensaio descrito, observou-se uma diminuição de 50% na taxa de importação nuclear em comparação com o controlo. Usando este sistema, podem ser examinadas pequenas alterações no transporte nucleocitoplasmático e a capacidade de diferentes fatores para resgatar (mesmo parcialmente) um trato nucleocitoplasmáticoPode ser determinado.

Introdução

O complexo de poros nucleares (NPC) controla a importação e exportação de grandes moléculas dentro e fora do núcleo da célula. Em contraste com pequenas moléculas, que podem entrar no núcleo sem a regulação ¹ , o transporte de moléculas maiores é fortemente controlado pelo NPC. Essas grandes moléculas, como proteínas e RNA, associam-se a fatores de transporte, incluindo importações e exportações, para serem importadas e exportadas do núcleo ² . Para serem importados, as proteínas devem conter um pequeno motivo peptídico, geralmente chamado de sinal de localização nuclear (NLS), que é limitado por importinas ² . Estas sequências de aminoácidos actuam como um marcador e são diversas na composição ^{3 , 4} . As proteínas podem ser exportadas do núcleo para o citoplasma devido à sua associação com aS, que ligam uma seqüência de sinal, geralmente chamada de sinal de exportação nuclear (NES) ² . Ambos importins e exportins são capazes de transportar sua carga devido à regulação da pequena proteína nuclear relacionada Ras GTPase (Ran) ² . Ran demonstrou-se que existem em diferentes estados conformacionais dependendo se está ligado a GTP ou GDP. Quando ligado a GTP, Ran pode vincular a importins ou exportins. Após a vinculação ao RanGTP, importins liberar sua carga, enquanto exportins deve vincular RanGTP para formar um complexo com sua carga de exportação. O estado de ligação de nucleótidos dominante de Ran depende da sua localização no núcleo (RanGTP) ou do citoplasma (RanGDP).

Recentemente, vários estudos têm demonstrado uma ligação entre deficiências na via nucleocitoplasmática e tanto a esclerose lateral amiotrófica (ELA) quanto a demência frontotemporal (FTD) ^{5 , 6} 7 ^{, 8 , 9 , 10 , 11 , 12} . A ELA é uma doença neurodegenerativa progressiva e fatal que afeta os neurônios motores superiores e inferiores (MNs) ¹³ e resulta em paralisia e, em última instância, na morte, em média de 2 a 5 anos. A maioria dos casos de ELA é classificada como esporádica (SALS), sem qualquer ligação genética aparente, mas 10% são herdados de forma dominante (ALS familiar, FALS). Recentemente, foram identificadas as expans�s de repeti�o de hexanucle�idos (HREs) no gene 72 de leitura aberta do cromossoma 9 (C9orf72) ^{14 , 15} como uma causa gen�ica de ALS e FTD. Esses mutantes respondem por 30-40% dos casos FALS ¹⁶ , e diferentes estudos alegaramQue causam toxicidade por afetar o transporte nucleocitoplasmático ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12} .

Estes estudos mostram principalmente os resultados finais e manifestações de HREs sobre o transporte nucleocytoplasmic, mas eles não demonstram disrupção nucleocytoplasmic em tempo real. Como resultado, apenas a deficiência grave de transporte nucleocitoplasmático foi avaliada ^{11 , 17 , 18} .

Este protocolo descreve um novo eSensível para avaliar e quantificar a disfunção nucleocitoplasmática de transporte em tempo real. A taxa de importação de uma proteína NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) pode ser quantificada em tempo real utilizando microscopia de fluorescência. Isto é feito utilizando um inibidor de exportação, tal como descrito anteriormente ¹⁸ , permitindo assim que a vaivém-GFP apenas entre no núcleo. Usando a microscopia fluorescente e um software capaz de quantificar alterações fluorescentes em tempo real, é possível quantificar mudanças graduais na intensidade de fluorescência da nave-GFP, localizada no núcleo. Como resultado, pode ser feita uma curva de saturação tipo Michaelis-Menten do eixo de fluorescência ao tempo, representando a quantidade de GFP nuclear de transporte em qualquer momento dado. Usando a taxa linear inicial das curvas, é possível gerar uma inclinação, que representa a taxa de entrada no núcleo antes da saturação de fluorescência.

Para validar o ensaio, oForam utilizadas repetições de dipeptídeos C9orf72, poli (GR) e poli (PR), que foram previamente relatados como perturbadores do transporte nucleocitoplasmático, ^{5 , 7 , 8 , 10 , 12} . Utilizando este ensaio, observou-se uma diminuição de 50% na taxa de importação nuclear em comparação com o controlo. Usando este sistema, podem ser examinadas pequenas alterações no transporte nucleocitoplasmático. Além disso, a capacidade de diferentes factores para resgatar um defeito de transporte nucleocitoplasmático pode ser determinada.

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Protocolo

1. Preparação da Linha Celular

1. Descongelar aproximadamente 1.000.000 células de medula espinhal de neuroblastoma de rato (células NSC-34) que foram armazenadas num recipiente de azoto líquido. Utilize uma incubadora de água a 37 ° C até as células serem completamente descongeladas.
2. Adicionar meio fresco e quente (meio DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de L-glutamina e 1% de antibióticos pen-strep).
3. Centrifugar as células descongeladas (SL16R) a 500 xg durante 5 min, formando uma pastilha celular. Descarte o meio e adicione 1 mL de novo meio para a ressuspensão celular.
4. Colocar as células ressuspensas num balão de 15 mL e adicionar 5 mL adicionais de meio. Incubar as células durante a noite numa incubadora estéril com 5% de CO2 a 37 ° C.
5. Em paralelo, colocar 8 lamínulas não revestidas (tampa de vidro: 12 mm, 0,13-0,17 mm de espessura) em um prato de cultura de 60 mm e esterilizar usando 70% etanol e exposição a 30 minutos de luz UV até que esteja seco. Adicionar meio a cada prato e descartar para lavar o etanol residual.
6. Adicionar tampão de tripsina (2,5 g de tripsina e 0,2 g de EDTA em 1 L de Solução de Sal Equilibrada de Hanks) às células depois de atingirem aproximadamente 90% de confluência (cerca de 6 milhões de células por frasco) para permitir que as células aderentes se dissociem.
   NOTA: As células NSC-34 são sensíveis e requerem apenas 15 s de incubação com tampão de tripsina e 1 minuto adicional de incubação sem tripsina antes da dissociação utilizando o meio.
7. Plantar as células nas placas de cultura de 60 mm que já contêm as lamelas com 3 mL de meio, aproximadamente 350.000 por placa. Deixá-los na incubadora por 24 h para permitir a fixação de células para as lamelas.

2. Transfecção celular

NOTA: Após aproximadamente 24 h, as células NSC-34 atingem 40% de confluência (aproximadamente 800.000 células) e estarão prontas para transfecção.

1. Preparar meio DMEM puro (300 μL de meio DMEM para cada recipiente de cultura de 60 mm) em uma cuba de microcentrífuga estérilEs.
2. Adicionar 2 μg de cada plasmídeo necessário para transfecção a cada tubo de microcentrífuga contendo DMEM.
   NOTA: O plasmídeo shuttle-GFP é obrigatório em todas as transfecções celulares.
3. Adicionar o reagente de transfecção a todos os tubos de microcentrífuga que contêm os seus plasmídeos necessários. Aqui, adicionar 4 μL do reagente de transfecção comercial para cada 2 μg de ADN.
4. Vortex os tubos de microcentrífuga contendo DMEM, plasmídeos e o reagente de transfecção e incuba-os à temperatura ambiente durante 25 min.
5. Adicionar cada tubo de microcentrífuga a um prato de cultura e agitar suavemente o prato para formar uma solução homogénea. Coloque o prato de volta na incubadora por 48 h.
   NOTA: Uma vez que a vaiv�-GFP deve ser expressa em todas as c�ulas, a efici�cia de transfec�o de shuttle-GFP pode ser parcialmente examinada e testada previamente utilizando microscopia de fluoresc�cia ap� transfec�o durante a noite. Um exame completo de proteínas expressas não fluorescentes pode ser conduzido utilizando uma análise de imunobloté.

3. Microscopia

1. Anexar as lamelas contendo células NSC-34 transfectadas para um suporte de lamela e lave suavemente com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover as células mortas destacadas.
2. Identificar um adesivo celular adequado utilizando um filtro fluorescente verde com um microscópio invertido.
   NOTA: Um adesivo de célula adequado é definido como um campo de visão de microscópio mostrando um grande número de células (20-30 células num campo) e em que os núcleos estão claramente definidos nas células. Os núcleos celulares dentro do remendo de células são primeiro identificados por olho e são marcados manualmente pelo software de imagem.
3. Adicionar 200 μL de um tampão de leptomicina B (LMB) inibidor da exportina-1 contendo 10 ng / mL de LMB em PBS aos lamínulas por gotejamento do tampão nos lamínulas sob o microscópio.
   NOTA: Este ponto no tempo é definido como intervalo zero.
4. Quantificar a intensidade fluorescente dos núcleos marcados em intervalos de 3 s por cerca de 400-500 s.
5. Teste entre 3 e 5 lamínulas para cada grupo de transfecção em cada experiência individual.

4. Análise

NOTA: Uma vez que diferentes células expressam diferentes níveis de transferência de GFP fluorescente, é importante normalizar a intensidade fluorescente nuclear de cada célula para a sua própria intensidade fluorescente inicial.

1. Normalize a intensidade fluorescente dos núcleos marcados dividindo o intervalo fluorescente de 3 de cada núcleo com a média dos seis intervalos iniciais desse núcleo.
2. Após a normalização de cada núcleo, produzir uma curva de intensidade fluorescente representando a mudança na fluorescência dos núcleos em função do tempo para cada remendo de célula. Para fazer isto, calcule a média de todas as pilhas em cada remendo da pilha (que consiste em aproximadamente 20-30 pilhas em cada remendo).
   NOTA: A curva de intensidade de fluorescência dos núcleos se assemelha a uma curva de saturação de Michaelis-Menten, que é melhor observadaMe períodos. Isto é devido a uma diminuição nas quantidades citosólicas de shuttle-GFP com o tempo devido ao transporte nuclear. Esta diminuição diminui estatisticamente a probabilidade de uma vaivém-GFP se transportar para o núcleo, atingindo assim a saturação na fluorescência nuclear. A inclinação derivada da taxa inicial linear da curva produz a taxa de entrada de _Vmax no núcleo.
3. Analise as inclinações de Vmax de cada remendo de célula, derivadas de três a cinco experimentos independentes, usando o software gráfico para produzir uma inclinação que representa cada grupo experimental. Realize a quantificação usando análise estatística ANOVA unidirecional.

5. Validação de Expressão de Proteína

1. Colocar recipientes de cultura de 60 mm contendo as células residuais (não utilizadas na experiência anterior) de cada grupo experimental em gelo.
2. Eliminar o meio e lavar as células duas vezes com PBS para diluir e lavar o meio restante.
3. Tratar as células com 200-400ML de tampão de lise contendo PBS, 0,5% de Triton e comprimido de cocktail de inibidor de protease (PI). Raspe usando um raspador de células.
4. Recolher as células em tampão de lise num tubo de microcentrífuga e homogeneizar com um homogeneizador a 4000 rpm durante 1 min sob gelo.
5. Centrifugar as células homogeneizadas a 2.500 xg durante 10 min. Recolher o sobrenadante, quantificar a concentração de proteína utilizando um ensaio de Bradford e armazenar até à utilização a -20 ° C.
6. Recolher entre 30 e 70 μg de proteína total (dependendo da proteína) e carregá-lo em um gel de SDS-PAGE para testar a expressão da proteína usando um ensaio de imunoblot.

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Resultados

Utilizando o procedimento aqui apresentado, as células NSC-34 do tipo neurónio motor foram transfectadas com uma proteína NLS-NES-GFP (shuttle-GFP). Esta proteína, que tem NLS e NES sinal seqüências ( Figura 1 ), pode shuttle entre o núcleo eo citoplasma. A GFP gen�ica pode entrar ou sair do n�leo na aus�cia de qualquer marca de sinal de localiza�o apenas por difus� e, por conseguinte, � distribu�a uniformemente entre o n�le...

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Discussão

Este protocolo demonstra um ensaio altamente sensível e quantitativo novo para avaliar mudanças minuciosas no transporte nucleocytoplasmic. Utilizando este sistema, é possível observar e medir o transporte nucleocitoplasmático e sua disfunção em tempo real, não só grandes defeitos que resultam em mudanças dramáticas na distribuição de proteínas. Este ensaio não só tem uma vantagem de sensibilidade, mas também requer pouca preparação, é barato e é um ensaio muito fácil e de baixo engajamento.

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)	tebu-bio	CLU140-A
DMEM 4.5 g/L L-glucose	Biological Industries	01-055-1A
FBS European Grade	Biological Industries	04-007-1A
SL 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004030
Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Scientific	3111
Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thick	Bar Naor LTD
TurboFect Transfection Reagent	Thermo Scientific	R0531
Axiovert 100 inverted microscope	Zeiss
Imaging Workbench 2	Axon Instruments
Leptomycin B	Sigma	L2913
PBS	Biological Industries	02-023-1A
Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clamp	Glas-Col	099C K5424CE
MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated	Thermo Scientific	75002455