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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole décrit un procédé pour mesurer de façon sensible le taux de transport nucléocytoplasmique dans les cellules NSC-34 de type neurone moteur en quantifiant le changement en temps réel de l'importation nucléaire d'une protéine NLS-NES-GFP.

Résumé

Le transport des nucléocytoplasmes fait référence à l'importation et à l'exportation de grandes molécules à partir du noyau cellulaire. Récemment, un certain nombre d'études ont montré un lien entre la sclérose latérale amyotrophique (ALS) et les troubles de la voie nucléocytoplasmique. L'ALS est une maladie neurodégénérative affectant les neurones moteurs et entraînant une paralysie et, en fin de compte, la mort, en moyenne de 2 à 5 ans. La plupart des cas de SLA sont sporadiques, sans lien génétique apparent, mais 10% sont héréditaires de manière dominante. Récemment, les extensions de répétition d'hexanucléotide (HRE) dans le gène de lecture ouvert 72 du chromosome (C9orf72) ont été identifiées comme une cause génétique de la SLA et de la démence frontotemporelle (FTD). Il est important de noter que différents groupes ont récemment proposé que ces mutants affectent le transport nucléocytoplasmique. Ces études ont surtout montré le résultat final et les manifestations causées par les HRE sur le transport nucléocytoplasmique, mais ils ne démontrent pas le dysfonctionnement du transport nucléaire danstemps réél. En conséquence, seule une carence sévère en transport nucléocytoplasmique peut être déterminée, principalement en raison d'une surexpression élevée ou d'une insertion de protéines exogènes.

Ce protocole décrit un test nouveau et très sensible pour évaluer et quantifier le dysfonctionnement du transport nucléocytoplasmique en temps réel. Le taux d'importation d'une protéine NLS-NES-GFP (navette-GFP) peut être quantifié en temps réel en utilisant une microscopie fluorescente. Ceci est effectué en utilisant un inhibiteur d'exportation, ce qui permet à la navette GFP d'entrer dans le noyau. Pour valider l'analyse, on a utilisé le C9orf72 HRE traduit des répétitions de dipeptides, des poly (GR) et des poly (PR), qui ont été précédemment révélés pour perturber le transport nucléocytoplasmique. En utilisant le dosage décrit, une diminution de 50% du taux d'importation nucléaire a été observée par rapport au témoin. En utilisant ce système, des changements mineurs dans le transport nucléocytoplasmique peuvent être examinés et la capacité de différents facteurs à sauver (même partiellement) un nucléocytoplasmiqueLe défaut de l'anxiété peut être déterminé.

Introduction

Le complexe de pores nucléaires (NPC) contrôle l'importation et l'exportation de grandes molécules dans et hors du noyau de la cellule. Contrairement aux petites molécules, qui peuvent entrer dans le noyau sans la régulation 1 , le transport de molécules plus grandes est fortement contrôlé par le PNJ. Ces grandes molécules, telles que les protéines et l'ARN, associent aux facteurs de transport, y compris les importations et les exportations, pour être importées et exportées du noyau 2 . Pour être importés, les protéines doivent contenir un petit motif peptidique, généralement appelé signal de localisation nucléaire (NLS), qui est lié par importins 2 . Ces séquences d'acides aminés agissent comme une étiquette et sont diverses dans la composition 3 , 4 . Les protéines peuvent être exportées du noyau vers le cytoplasme en raison de leur association avec les exportationsS, qui lient une séquence signal, généralement appelée signal d'exportation nucléaire (NES) 2 . Les importations et les exportines sont capables de transporter leur cargaison en raison de la régulation de la petite protéine nucléaire GTPase (Ran) 2 de Ras. Ran a été démontré qu'il existe dans différents états conformationnels selon qu'il est lié à GTP ou PIB. Lorsqu'il est lié à GTP, Ran peut se lier à importins ou exportins. Lors de la liaison avec RanGTP, les importations libèrent leur cargaison, tandis que les exportateurs doivent lier RanGTP pour former un complexe avec leur cargaison d'exportation. L'état de liaison nucléotidique dominant de Ran dépend de son emplacement dans le noyau (RanGTP) ou le cytoplasme (RanGDP).

Récemment, un certain nombre d'études ont montré un lien entre les déficiences de la voie nucléocytoplasmique et la sclérose latérale amyotrophique (ALS) et la démence frontotemporelle (FTD) 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . La SLA est une maladie neurodégénérative progressive et mortelle qui affecte les neurones moteurs supérieur et inférieur (MN) 13 et entraîne une paralysie et, en fin de compte, la mort, en moyenne de 2 à 5 ans. La plupart des cas d'ALS sont classés comme sporadiques (SALS), sans lien génétique apparent, mais 10% sont héréditaires de manière dominante (SLA familiale, FALS). Récemment, les extensions de répétition de l'hexanucléotide (HRE) dans le chromosome 9 ouvrir le cadre de la vue 72 (C9orf72) ont été identifiées 14 , 15 comme une cause génétique de la SLA et de la FTD. Ces mutants représentent 30 à 40% des cas FALS 16 , et différentes études ont soutenuQu'ils provoquent une toxicité en affectant le transport nucléocitoplasmique 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .

Ces études ont surtout montré les résultats finaux et les manifestations des HRE sur le transport nucléocytoplasmique, mais ils ne démontrent pas de perturbation nucléocytoplasmique en temps réel. En conséquence, seule une carence sévère en transport nucléocytoplasmique a été évaluée 11 , 17 , 18 .

Ce protocole décrit un nouveau et unPour évaluer et quantifier le dysfonctionnement du transport nucléocytoplasmique en temps réel. Le taux d'importation d'une protéine NLS-NES-GFP (navette-GFP) peut être quantifié en temps réel en utilisant une microscopie fluorescente. Cela se fait en utilisant un inhibiteur de l'exportation, comme décrit précédemment 18 , permettant ainsi à la navette-GFP d'entrer dans le noyau. En utilisant une microscopie fluorescente et un logiciel capable de quantifier les changements fluorescents en temps réel, il est possible de quantifier les changements progressifs dans l'intensité de fluorescence de la navette-GFP, située dans le noyau. En conséquence, une courbe de saturation de Michaelis-Menten de l'axe de fluorescence à temps, représentant la quantité de navette-GFP nucléaire à tout moment donné, peut être réalisée. En utilisant le taux linéaire initial des courbes, il est possible de générer une pente, ce qui représente la vitesse d'entrée dans le noyau avant la saturation en fluorescence.

Pour valider l'analyse, la traductionD C9orf72 répétitions dipeptidiques, poly (GR) et poly (PR), qui ont été précédemment signalés pour perturber le transport nucléocytoplasmique, ont été utilisés 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . En utilisant ce dosage, une diminution de 50% du taux d'importation nucléaire a été observée par rapport au contrôle. En utilisant ce système, des changements minima dans le transport nucléocytoplasmique peuvent être examinés. En outre, la capacité de différents facteurs pour sauver un défaut de transport nucléocytoplasmique peut être déterminée.

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Protocole

1. Préparation de la ligne cellulaire

  1. Décongeler environ 1 000 000 de cellules de la moelle épinière de neuroblastome de souris (cellules NSC-34) qui ont été stockées dans un récipient d'azote liquide. Utilisez un incubateur d'eau à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules soient complètement décongelées.
  2. Ajouter un milieu frais et chaud (milieu DMEM contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 1% de L-glutamine et 1% d'antibiotiques stylo-streptococèses).
  3. Centrifuger les cellules décongelées (SL16R) à 500 xg pendant 5 min, former une pastille cellulaire. Jeter le milieu et ajouter 1 ml de nouveau support pour la remise en suspension cellulaire.
  4. Placez les cellules remises en suspension dans un ballon de 15 ml et ajoutez 5 ml supplémentaires de milieu. Incuber les cellules dans une nuit dans un incubateur stérile avec 5% de CO 2 à 37 ° C.
  5. En parallèle, placez 8 lamelles non revêtues (verre de couverture: 12 mm, 0,13-0,17 mm d'épaisseur) dans un plat de culture de 60 mm et stérilisez avec une éthanol à 70% et une exposition à 30 min de lumière UV jusqu'à ce qu'il soit sec. Ajouter un milieu dans chaque plat et jeter pour éliminer l'éthanol résiduel.
  6. Ajouter un tampon de trypsine (2,5 g de trypsine et 0,2 g d'EDTA dans 1 L de solution équilibrée de sel de Hanks) aux cellules après avoir atteint environ 90% de confluence (environ 6 millions de cellules par flacon) pour permettre aux cellules adhérentes de se dissocier.
    NOTE: Les cellules NSC-34 sont sensibles et ne nécessitent que 15 s d'incubation par tampon de trypsine et 1 min supplémentaire d'incubation sans trypsine avant dissociation en utilisant le milieu.
  7. Placer les cellules sur les boîtes de culture de 60 mm contenant déjà les lamelles avec 3 ml de milieu, environ 350 000 par plat. Laissez-les dans l'incubateur pendant 24 h pour permettre la fixation des cellules sur les lamelles.

2. Transfection cellulaire

REMARQUE: Après environ 24 h, les cellules NSC-34 atteindront 40% de confluence (environ 800 000 cellules) et seront prêtes à être transfectées.

  1. Préparer un milieu DMEM pur (300 μL de milieu DMEM pour chaque plat de culture de 60 mm) dans un micro-centrifuge stérileEs.
  2. Ajouter 2 μg de chaque plasmide nécessaire pour la transfection à chaque tube de microcentrifugeuse contenant du DMEM.
    REMARQUE: Le plasmide Shuttle-GFP est obligatoire dans toutes les transfections cellulaires.
  3. Ajouter un réactif de transfection à tous les tubes de microcentrifugeuse qui contiennent leurs plasmides requis. Ici, ajouter 4 μl du réactif de transfection commercial pour chaque 2 μg d'ADN.
  4. Vortex les tubes de microcentrifugeuse contenant du DMEM, des plasmides et le réactif de transfection et les incuber à température ambiante pendant 25 min.
  5. Ajouter chaque tube de microcentrifugeuse dans un plat de culture et agiter doucement le plat pour former une solution homogène. Placez le plat dans l'incubateur pendant 48 h.
    NOTE: Étant donné que la navette-GFP doit être exprimée dans toutes les cellules, l'efficacité de transfection de la navette-GFP peut être partiellement examinée et pré-testée à l'aide d'une microscopie fluorescente après une transfection d'une nuit. Un examen complet des protéines non fluorescentes exprimées peut être effectué en utilisant un analyse immunoblotest.

3. Microscopie

  1. Fixez les lamelles contenant des cellules NSC-34 transfectées à un porte-lamelles et lavez doucement avec de la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer les cellules mortes détachées.
  2. Identifiez un patch cellulaire approprié en utilisant un filtre fluorescent vert avec un microscope inversé.
    NOTE: Un patch cellulaire approprié est défini comme un champ de vision du microscope montrant un grand nombre de cellules (20-30 cellules dans un champ) et dans lequel les noyaux sont clairement définis dans les cellules. Les noyaux cellulaires dans le patch cellulaire sont d'abord identifiés par l'œil et sont marqués manuellement par le logiciel d'imagerie.
  3. Ajouter 200 μL d'un inhibiteur d'exportation-1 Leptomycine B (LMB) contenant 10 ng / mL de LMB dans PBS sur les lamelles en gouttant le tampon sur les lamelles au microscope.
    REMARQUE: Ce point dans le temps est défini comme un intervalle zéro.
  4. Quantifier l'intensité fluorescente des noyaux marqués dans des intervalles de 3 s pendant environ 400-500 s.
  5. Testez entre 3 et 5 feuillets de couverture pour chaque groupe de transfection dans chaque expérience individuelle.

4. Analyse

NOTE: Étant donné que différentes cellules expriment différents niveaux de navette fluorescente-GFP, il est important de normaliser l'intensité fluorescente nucléaire de chaque cellule à sa propre intensité fluorescente initiale.

  1. Normaliser l'intensité fluorescente des noyaux marqués en divisant l'intervalle fluorescent 3-s de chaque noyau avec la moyenne des six premiers intervalles de ce noyau.
  2. Après la normalisation de chaque noyau, produire une courbe d'intensité fluorescente représentant la variation de la fluorescence des noyaux en fonction du temps pour chaque patch cellulaire. Pour ce faire, calculez la moyenne de toutes les cellules dans chaque patch cellulaire (composé d'environ 20-30 cellules dans chaque patch).
    NOTE: La courbe d'intensité fluorescente des noyaux ressemble à une courbe de saturation de Michaelis-Menten, qui est mieux observée au sein d'une tiMoi périodes. Ceci est dû à une diminution des quantités cytosoliques de navette-GFP avec le temps en raison du transport nucléaire. Cette diminution diminue statistiquement la probabilité qu'une navette-GFP se transporte dans le noyau, atteignant ainsi la saturation en fluorescence nucléaire. La pente dérivée du taux linéaire initial de la courbe donne le taux d'entrée V max dans le noyau.
  3. Analyser les pentes V max de chaque patch cellulaire, dérivées de trois à cinq expériences indépendantes, en utilisant le logiciel graphique pour produire une pente représentant chaque groupe expérimental. Effectuer la quantification en utilisant une analyse statistique ANOVA à sens unique.

5. Validation de l'expression des protéines

  1. Placez des boîtes de culture de 60 mm contenant les cellules résiduelles (non utilisées dans l'expérience ci-dessus) de chaque groupe expérimental sur glace.
  2. Éliminer le milieu et laver les cellules deux fois avec du PBS pour diluer et laver le reste du milieu.
  3. Traiter les cellules avec 200-400ΜL de tampon de lyse contenant du PBS, 0,5% de Triton et une tablette de cocktail inhibiteur de protéase (PI). Scrape à l'aide d'un grattoir cellulaire.
  4. Recueillir les cellules dans le tampon de lyse dans un tube de microcentrifugeuse et homogénéiser avec un homogénéisateur à 4 000 tr / min pendant 1 min sous la glace.
  5. Centrifuger les cellules homogénéisées à 2 500 xg pendant 10 min. Recueillir le surnageant, quantifier la concentration de protéines en utilisant un dosage de Bradford, et conserver jusqu'à l'utilisation à -20 ° C.
  6. Recueillir entre 30 et 70 μg de protéine totale (selon la protéine) et le charger dans un gel SDS-PAGE pour tester l'expression de la protéine en utilisant un dosage immunoblot.

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Résultats

En utilisant la procédure présentée ici, les cellules NSC-34 de type neurone moteur ont été transfectées avec une protéine NLS-NES-GFP (navette-GFP). Cette protéine, qui a des séquences de signal NLS et NES ( Figure 1 ), peut transiter entre le noyau et le cytoplasme. La GFP générique peut entrer ou quitter le noyau en l'absence de toute étiquette de signal de localisation uniquement par diffusion et est donc répartie uniformément entre le noyau et le c...

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Discussion

Ce protocole démontre un nouveau dosage hautement sensible et quantitatif pour évaluer les changements minima dans le transport des nucléocytoplasmes. En utilisant ce système, il est possible d'observer et de mesurer le transport nucléocytoplasmique et son dysfonctionnement en temps réel, non seulement de grands défauts qui entraînent des changements spectaculaires dans la distribution des protéines. Ce test a non seulement un avantage de sensibilité, mais il nécessite également peu de préparation, est ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions tous les membres du laboratoire d'AI pour leurs commentaires et suggestions utiles. Nous tenons à remercier le Professeur Mark Hipp (Institut Max Planck pour la biochimie) pour nous avoir fourni le vecteur Shuttle-GFP. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation scientifique israélienne (ISF n ° 124/14), de la Fondation binationale des sciences (BSF # 2013325), de la subvention d'insertion professionnelle Marie Curie du 7e PC (CIG n ° 333794) et de l'Institut national de psychobiologie en Israël ( NIPI # b133-14 / 15).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)tebu-bioCLU140-A
DMEM 4.5 g/L L-glucoseBiological Industries01-055-1A
FBS European GradeBiological Industries04-007-1A
SL 16R CentrifugeThermo Scientific75004030
Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 IncubatorThermo Scientific3111
Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thickBar Naor LTD
TurboFect Transfection ReagentThermo ScientificR0531
Axiovert 100 inverted microscopeZeiss
Imaging Workbench 2Axon Instruments
Leptomycin BSigmaL2913
PBSBiological Industries02-023-1A
Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clampGlas-Col099C K5424CE
MicroCL 17R Centrifuge, RefrigeratedThermo Scientific75002455

Références

  1. Alberts, B. Molecular biology of the cell. , 4th edn, Garland Science. (2002).
  2. Freitas, N., Cunha, C. Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins. Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).
  3. Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. A short amino acid sequence able to specify nuclear location. Cell. 39, 499-509 (1984).
  4. la Cour, T., et al. Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals. Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).
  5. Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Sci Rep. 6, 20877(2016).
  6. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 129-133 (2015).
  7. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).
  8. Kwon, I., et al. Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells. Science. 345, 1139-1145 (2014).
  9. Rossi, S., et al. Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS. J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).
  10. Shi, K. Y., et al. Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
  11. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 56-61 (2015).
  12. Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).
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  20. Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84, 1213-1225 (2014).

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