خلية كاملة التصحيح المشبك تسجيلات من الخلايا الظهارية الأولية المعزولة من البربخ

Summary

نقدم بروتوكول يجمع بين العزلة الخلية وكل خلية التصحيح المشبك تسجيل لقياس الخصائص الكهربائية للخلايا الظهارية فصلها الابتدائي من البربخ الذيل الفئران. هذا البروتوكول يسمح للتحقيق في الخصائص الوظيفية للخلايا الظهارية البربخ الابتدائي لمواصلة توضيح الدور الفسيولوجي للبربخ.

Abstract

البربخ هو جهاز أساسي لنضج الحيوانات المنوية والصحة الإنجابية. يتكون ظهارة البربخ من أنواع الخلايا المرتبطة بشكل متشابك التي تتميز ليس فقط في الخصائص الجزيئية والمورفولوجية ولكن أيضا في الخصائص الفسيولوجية. هذه الاختلافات تعكس وظائفها المتنوعة، والتي معا إنشاء المكروية اللازمة لتطوير الحيوانات المنوية ما بعد الخصية في التجويف البربخ. فهم الخصائص الفيزيائية الحيوية للخلايا الظهارية البربخية أمر بالغ الأهمية للكشف عن وظائفها في الحيوانات المنوية والصحة الإنجابية، في ظل كل من الفسيولوجية والظروف المرضية المرضية. في حين أن خصائصها الوظيفية لم يتم توضيحها بشكل كامل، يمكن دراسة الخلايا الظهارية البربخية باستخدام تقنية التصحيح المشبك، وهي أداة لقياس الأحداث الخلوية وخصائص الغشاء للخلايا المفردة. هنا، نحن تصف أساليب عزل الخلية و خلية كاملة التصحيح المشبك تسجيل إلى مييتأكد من الخصائص الكهربائية للخلايا الظهارية فصلها الابتدائي من البربخ ذيل الفئران.

Introduction

البربخ في الجهاز التناسلي للذكور هو جهاز اصطف مع طبقة من الخلايا الظهارية الفسيفساء. كما هو الحال في الأنسجة الظهارية الأخرى، وأنواع الخلايا المختلفة من ظهارة البربخ، بما في ذلك الخلايا الرئيسية والخلايا واضحة والخلايا القاعدية والخلايا من النظم المناعية واللمفاوية، والعمل بطريقة منسقة لتكون بمثابة الحاجز في خط أنابيب نبيب، وكما الخلايا الداعمة للنضج الحيوانات المنوية وعلم وظائف الأعضاء ^{1 ، 2 ، 3} . وهكذا، فإن هذه الخلايا الظهارية تلعب دورا أساسيا في الصحة الإنجابية.

وتعتبر الخلايا الظهارية عموما خلايا غير قابلة للإنجاب التي هي غير قادرة على توليد كل أو لا شيء إمكانات العمل في استجابة لاستقطاب المحفزات، وذلك بسبب عدم وجود الجهد بوابات نا ⁺ أو كا ^{2 +} قنوات ^{4 ، 5} . ومع ذلك، الخلايا الظهارية تعبر يونيكيو مجموعات من القنوات الأيونية والنقل التي تنظم أدوارهم الفسيولوجية المتخصصة، مثل إفراز والنقل المغذيات ⁶ . وبالتالي فإن الخلايا الظهارية المختلفة تمتلك خصائص كهربائية مميزة. على سبيل المثال، الخلايا الرئيسية تعبر عن كفتر لنقل السوائل والكلوريد والتعبير عن TRPV6 لاستيعاب الكالسيوم، في حين أن الخلايا واضحة تعبر عن مضخة بروتون V-أتباس للحموضة اللمعية ^{1 ، 7 ، 8 ، 9} . وقد تم الإبلاغ عن بعض شركات النقل وقنوات أيون التي تنظم السمات الفسيولوجية للخلايا الظهارية البربخ، ولكن الخصائص الوظيفية للخلايا الظهارية البربخية لم تفهم إلى حد كبير بعد ^{10 ، 11 ، 12 ، 13} .

ملحقأولي خلية التصحيح المشبك تسجيل هو تقنية راسخة لفحص الخصائص الجوهرية لكل من الخلايا المنفعلة وغير قابلة للانفجار، ومفيدة بشكل خاص لدراسة وظائف الخلايا في المقام الأول فصل في عينات الخلايا غير المتجانسة. يتم استخدام الجهد المشبك لقياس خصائص الغشاء السلبي والتيارات الأيونية من خلايا واحدة ^{14 ، 15} . وتشمل خصائص الغشاء السلبي مقاومة المدخلات والسعة. المعلمة السابقة تشير إلى سلوك الغشاء الداخلي، في حين أن الأخير يشير إلى مساحة سطح غشاء الخلية (طبقة ثنائية فوسفورية، حيث توجد القنوات الأيونية والنقل، التي تعمل كعازل رقيق يفصل بين الخلايا خارج الخلية وداخل الخلايا). السعة الغشائية تتناسب طرديا مع مساحة سطح الغشاء الخلوي. جنبا إلى جنب مع المقاومة الغشاء الذي ينعكس من قبل المقاومة المدخلات، ثابت الوقت الغشاء، ثويشير كيف مدى سرعة الغشاء الخلية تستجيب لتدفق التيارات قناة الأيونات، ويمكن تحديد. في هذا الصدد، من خلال الجمع بين خصائص الاستجابة الحالية من سلسلة من الخطوات الجهد تطبيقها على الخلايا، يتم تحديد حركية الفيزيائية الحيوية وخصائص الخلايا ^{15 ، 16 ، 17 ، 18} .

في هذه الورقة، ونحن تصف إجراءات لعزل الخلايا الظهارية من البربخ ذيل الفئران والخطوات لقياس خصائص الغشاء من أنواع الخلايا المختلفة في خليط الخلية فصل باستخدام خلية كاملة التصحيح المشبك. وتبين لنا أن الخلايا الرئيسية البربخ تظهر خصائص الكهربية الغشاء مميزة وأن المواسير يمكن التعرف عليها بسهولة من أنواع الخلايا الأخرى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

يتم إجراء جميع التجارب على الحيوانات بها وفقا للمبادئ التوجيهية من جامعة شانغهايتيش المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة، التي تلبي المتطلبات المحلية والدولية.

1. الحيوانات التجريبية

1. استخدام البالغين الذكور سبراغ داولي الفئران (~ 300-450 ز) بين 8-12 أسابيع من العمر. في هذا العصر في الفئران، وصلت الحيوانات المنوية في البربخ الذيل.

2. عزل الخلايا الظهارية من الجرذ كاودا إبيديديميدس

ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية تحت ظروف غير معقمة ما لم ينص على خلاف ذلك.

1. إعداد أدوات تشريح والكواشف
   1. تطهير أدوات تشريح عن طريق الغمر في الايثانول 70٪ والسماح لهم الهواء الجاف.
   2. بدوره على حمام الاحترار (32 درجة مئوية). إعداد ودافئة قبل 500 مل من 1X معهد روزويل بارك التذكاري 1640 متوسطة (رمي) تستكمل مع 1٪ (ت / ت) أنتيبيو(100 / مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين النهائي)، وصفت بأنها "رمي (+ P / S 1: 100)". قم بتنفيذ هذه الخطوة في محطة عمل تعمل بنظام التحكم في تدفق الهواء النظيف.
   3. إعداد و قبل الحارة 1x 500 مل إيسكوف في تعديل دولبيكو المتوسطة (إدمم) التي تحتوي على الأحماض الأمينية غير الضرورية (0.1 ملم) والبيروفات الصوديوم (1 ملم)، وتستكمل مع 5 α- ديهيدروتستوستيرون (1 نانومتر)، 10٪ البقري الجنين المصل، 1٪ (ت / ت) المضادات الحيوية (100 U / مل البنسلين و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين النهائي)، وصفت بأنها "كامل إدم". إنشاء 50 مل أليكوتس وختم مع بارافيلم. مخزن في 4 درجات مئوية. استخدام شروط العقيم.
   4. إعداد حل كولاجيناز انزيم الهضم عن طريق إذابة كولاجيناز النوع الأول وكولاجيناز النوع الثاني في رمي (+ P / S 1: 100) مما أدى إلى 1 ملغ / مل من كل كولاجيناز في الحل. تصفية من خلال غشاء 0.22 ميكرون وعلامة باسم "كولاجيناز الحل". إبقاء في درجة حرارة الغرفة (رت) حتى الاستخدام. ضبط حجم محلول الإنزيم القائمعلى وزن الانزيم. والحد الأدنى من حجم المطلوبة لكل من البربخ ذرة من الفئران واحد هو 2 مل.
   5. ملء طبق 35 ملم مع رمي (+ P / S 1: 100).
2. تشريح الفئران ذيل الفلفل
   1. التضحية الحيوان إما عن طريق استخدام بينتوباربيتال الصوديوم 85 ملغ / كغ الملكية الفكرية أو باستخدام غرفة إيسوفلوران حتى الحيوان لا يستجيب لتحفيز ذيل معسر، متابعة عن طريق خلع عنق الرحم.
   2. تطهير أسفل البطن عن طريق مسح مع الايثانول 70٪، ودفع بلطف الخصيتين اثنين وصولا الى أسفل البطن، ومن ثم فتح أسفل البطن بالقرب من كيس الصفن.
   3. التقاط الدهون البربخ، تشريح الجهاز التناسلي كله (الخصيتين، البربخ، والأسهر) وتزج في الطبق مع رمي (+ P / S 1: 100).
   4. نقل الأعضاء التناسلية في الطبق مع رمي (+ P / S 1: 100) إلى محطة عمل العقيم.
   5. تشريح من البربخ ذرة من الأنسجة الضامة والدهنية و إيبيديديمال، كبسولة. وضع البربخ واحد مع ~ 0.2 مل من كولاجيناز الحل في أنبوب 1.5 مل.تحقيق هذه الخطوة في محطة تدفق الهواء نظيفة تسيطر عليها.
3. التفكك من خلايا واحدة من الفئران ذيل البربخ
   1. قطع البربخ في الحل كولاجيناز باستخدام مقص غرامة حتى يصبح الأنسجة عجينة مثل السوائل. شطف مقص بلطف مع بقية (~ 0.8 مل) محلول انزيم في أنبوب 1.5 مل.
   2. وضع أنبوب على ثيرموميكسر المعدنية لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع سرعة تهز 1000 دورة في الدقيقة.
   3. الطرد المركزي خليط انزيم الأنسجة في 30 x ج في رت لمدة 3 دقائق وصب طاف لزجة التي تحتوي في الغالب على الحيوانات المنوية.
   4. ريسوسبيند بيليه في 1 مل كامل إدم لإرواء كل النشاط الأنزيمي. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 50 مل تحتوي على 49 مل رمي (+ P / S 1: 100).
      ملاحظة: اختياريا، وتصفية تعليق الخلية من خلال غشاء شبكة 100 ميكرون مع تريتورات ثابتةأيون لتجنب كبيرة، خلايا المجاميع. ومع ذلك، لا تستخدم فلتر شبكة إذا كان هناك حاجة إلى تعليق الخلية لزراعة الطبقات الوحيدة الخلية.
   5. الطرد المركزي الخليط الخلوي في 30 x ج في رت لمدة 10 دقيقة. صب طاف.
   6. ريسوسبيند الكرية في 1 مل كامل إدم مع تريتوراتيون لطيف لمدة 5 دقائق على الأقل لفصل خلايا واحدة من الأنزيمية مخاليط الأنسجة البربخية المعالجة.
4. فصل الخلايا الظهارية من الخلايا الأخرى تحت ظروف معقمة
   1. ثقافة تعليق الخلية على طبق بتري 10 سم تحتوي على كامل إدم لمدة 8 ساعات على الأقل أو بين عشية وضحاها، في حاضنة عند 32 درجة مئوية في 5٪ كو ₂ .
   2. إعداد كوفرسليبس العقيمة مقدما عن طريق الغمر في الكحول 100٪. الهواء الجاف وتراجع في حجم صغير من وسط الثقافة. وضع كوفرسليبس في 6 سم أطباق الثقافة أو في آبار واحدة من لوحة 24 جيدا.
   3. في صباح اليوم التالي، وحصاد الخلايا الظهارية فصلها عن طريق جمع بلطف تعليق الخليةسيون من طبق بتري، والذي يتكون في معظمه من الخلايا الظهارية. الطرد المركزي تعليق الخلية في 30 x ج في رت لمدة 5 دقائق، ثم صب طاف.
   4. ريسوسبيند بيليه الخلية في ~ 2 مل كامل إدم.
   5. البذور 0.2 مل من تعليق خلية تحصد على مركز كل ساترة العقيمة.
   6. السماح تعليق خلية تسوية في قطرة السائل لمدة 10 دقيقة على الأقل للسماح للخلايا لالتزام فضفاضة كوفرسليبس الزجاج. إضافة بعناية 1 مل كامل إدمم على حافة طبق 10 سم، أو 0.3 مل كامل إدم إلى كل بئر من لوحة 24 جيدا. لا تخل الخلايا.
   7. الحفاظ على خلايا واحدة معزولة على كوفرسليبس في الحاضنة في 32 درجة مئوية في 5٪ كو ₂ حتى التجارب التصحيح المشبك.

3. تسجيل الحلول و ميكروبيبيتس

ملاحظة: للتجارب التصحيح المشبك، واستخدام أفضل المواد الكيميائية ذات الجودة والحلول.

1. إعداد حلول الأسهم
   1. الأوتوكلاف جميع زجاجات لتخزين الأسهم وتصفية جميع حلول الأسهم (ما عدا الحلول المسببة للتآكل) وتصفية من خلال الأغشية 0.22 ميكرون قبل الاستخدام.
   2. إعداد جميع حلول الأسهم مقدما في رت، وتخزينها في 4 ^س C: 5 M كلوريد الصوديوم. 1 M بوكل؛ 100 ملي مغكل ₂ ؛ 100 ملي كاكل ₂ ؛ 200 ملي ناه ₂ بو ₄ ؛ 100 ملي إغتا (درجة الحموضة 7.0 مع كوه). التعامل مع 5 M هيدروكسيد الصوديوم، 1 M حمض الهيدروكلوريك و 1 M كوه الأسهم كما حلول تآكل.
2. إعداد معيار تسجيل الخارجي حل الملح الفسيولوجية (بس)
   1. دافئ حلول الأسهم ل رت في صباح التسجيل التصحيح المشبك.
   2. ماصة المكونات من كل الأسهم وفقا لحجم النهائي المطلوب، باستثناء كاكل ₂ ، على سبيل المثال لإعداد 500 مل من بس: 140 ملي كلوريد الصوديوم = 14 مل من 5M. 5 ملي بوكل = 2.5 مل من 1M؛ 1.2 ملي مغكل ₂ = 6 مل من 100 ملم؛ 1.2 ملي ناه ₂ بو ₄ = 3 مل من 200 ملم.
   3. إضافة مزدوجةالمياه المقطر (د ₂ O) إلى الحجم النهائي من 400 مل وتوازن.
   4. تزن 0.9 غرام من الجلوكوز و 1.19 غرام هيبيس وتذوب تماما في خليط الحل.
   5. إضافة كاكل ₂ الأسهم (2.5 ملم = 12.5 مل من 100 ملم) مع التحريك.
   6. أضف ما يصل إلى 99٪ من الحجم النهائي.
   7. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك.
   8. تحقق الأسمولية وضبط باستخدام 5 M كلوريد الصوديوم أو الجلوكوز، إذا لزم الأمر.
   9. إضافة د ₂ O إلى الحجم النهائي من 500 مل في اسطوانة.
3. إعداد الحلول الداخلية ميكروبيبيت (منخفضة إغتا K ⁺ القائم على الحلول)
   1. وزن أو ماصة الحجم الصحيح من الكواشف من كل سهم وفقا لحجم النهائي المطلوب والتركيز، على سبيل المثال لإعداد 50 مل منخفضة إغتا K ⁺ المستندة إلى حل الخلايا إلى حجم من ~ 30 مل د ₂ O: 100 ملي K- غلوكونات = 1.17 غرام؛ 35 ملي بوكل = 1.75 مل من 1 M؛ 2 ملي مغكل ₂ = 1 ملمن 100 ملي. 0.1 ملي إغتا = 0.05 مل من 100 ملي. 10 ملي هيبيس = 0.072 ز.
   2. إضافة ما يكفي من المياه ل ~ 95٪ من الحجم النهائي والسماح للحل للتوازن في رت. تأكد من أن الحل واضح.
   3. في حين التحريك باستمرار الحل، وضبط درجة الحموضة إلى 7.2 باستخدام كوه.
   4. تزن وإضافة 0.078 غرام مغ-أتب إلى الحل حتى يتم حله تماما.
   5. وضع الحل على الجليد واستخدام قسامة صغيرة لقياس الأسمولية. عادة، وتدابير الحلول ~ 290 مسمول ولا تحتاج إلى تعديل. إذا كان الأسمولية يختلف بشكل كبير من 280-295 مسمول، وإعداد حل جديد.
   6. أضف د ₂ O إلى الحجم النهائي.
   7. تقسيم الحل إلى 500 قسامة ميكرولتر، مرشح مع مرشح حقنة 0.2 ميكرون، ختم بإحكام ومخزن على الفور في ≤ -20 درجة مئوية.
   8. في تاريخ التجربة التصحيح المشبك، ذوبان الجليد قسامة واحدة من الحل داخل الخلايا على الجليد والحفاظ على المبردة خلال تجربة التصحيح المشبك لمنع التدهور.
4. سحب ماصات التصحيح من الشعيرات الدموية الزجاج (التالية ماصة مجتذب دليل المستخدم) للحصول على أحجام ميكروبيبيت مع مقاومة 5-10 M عندما مليئة حل داخل الخلايا.

4. إعداد تجربة التصحيح المشبك وإنشاء خلية كاملة التكوين مع الخلايا

1. إعداد تجربة التصحيح المشبك
   1. تشغيل مجموعة التصحيح المشبك (الكمبيوتر، مضخم الكمبيوتر التي تسيطر عليها، التحويل الرقمي، وما إلى ذلك )
   2. فتح برنامج التصحيح المشبك (على سبيل المثال أكسون pCLAMP10 أو هيكا باتشماستر) وإعداد بروتوكولات للتسجيلات الكهربية. تعيين مرشح للإشارة إلى تمريرة منخفضة في 1-3 كيلو هرتز و ديجيتيزر في 10-20 كيلوهرتز.
   3. بدوره على الكاميرا، ميكرومانيبولاتور ومصدر الضوء.
   4. عندما يكون مكبر للصوت التي تسيطر عليها الكمبيوتر على، الأرض الجسم من المجرب عن طريق لمس مع اليدين التصحيح المشبك تلاعب التي تم ترتكز،قبل لمس الرأس، من أجل حمايتها من الصدمات الكهربائية.
   5. نقل الخلايا الظهارية زراعة على ساترة الزجاج إلى غرفة تسجيل مليئة ~ 1 مل من بس القياسية في رت. تغيير بعناية بس الاستحمام مرتين على الأقل باستخدام ماصة قبل أي التجارب التصحيح المشبك.
      ملاحظة: اختياريا، وملء نظام نضح مع بس القياسية أو حل خارجي آخر وفقا لتجربة المخطط لها. إرضاء المجهر محمولة على غرفة تسجيل (أرسي-26G أو أرسي-26GLP) مع بس عدة مرات بسرعة ~ 2 مل / دقيقة قبل بدء التجارب التصحيح المشبك. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء المحاصرين على طول نظام نضح.
   6. عرض وحدد الخلايا تحت المجهر مقلوب باستخدام أهداف 10X و 40X مجهزة تفاضلية تدخل نظام بصري النقيض. ابحث عن خلايا معزولة واحدة كبيرة للتسجيل. تحديد الخلايا الظهارية البربخ معزولة عن طريق شكل كروية مع م الخامإيكروفيلي على طرف واحد من الأغشية والاستقطاب توزيع محتويات الخلايا ( الشكل 1 ).
   7. باستخدام حقنة 1 مل (إبرة ميكروسيرينج محلية الصنع غير المعدنية)، وملء ميكروبيبيت مع الحل الداخلي (منخفض إغتا K ⁺ القائم على حل، راجع الخطوة 3.3). تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في ميكروبيبيت، والتي يمكن أن تزيد من مقاومة ميكروبيبيت. استخدام ما يكفي من الحل بحيث الحل الداخلي يغمر الكلوريد المغلفة الكهربائي سلك الفضة داخل حامل ميكروبيبيت.
   8. جبل ميكروبيبيت في حامل القطب، وتطبيق ضغط إيجابي منخفض (~ 0.2 مل حجم حقنة). الحفاظ على انخفاض الضغط الإيجابي المستمر حتى لمس غشاء الخلية في الخطوات اللاحقة.
2. إنشاء خلية كاملة التكوين مع خلايا للتسجيلات
   1. تزج ماصة في حل حمام في أعلى سرعة ميكرومانيبولاتور. العثور على ماصةتلميح في الشاشة المتصلة الكاميرا الرقمية. إبطاء سرعة ميكرومانيبولاتور إلى وضع المتوسطة عالية.
   2. تحقق بسرعة المقاومة ميكروبيبيت (5-10 MΩ) باستخدام الأمر واجهة الحصول على البيانات (على سبيل المثال "اختبار الغشاء" في نظام أكسون) من خلال تطبيق خطوة الجهد (على سبيل المثال 5 مف ل 100 مس) ولدت من مكبر للصوت الكمبيوتر التي تسيطر عليها. تغيير إلى ميكروبيبيت جديدة إذا كانت المقاومة بشكل كبير من هذا النطاق.
   3. البدء في التحرك إلى أسفل الهدف شنت على المجهر. توجه تدريجيا ميكروبيبيت نحو الخلية المحددة. دائما خفض الهدف أولا، ومن ثم خفض ميكروبيبيت إلى الطائرة من التركيز، حتى ميكروبيبيت هو فوق وسط سطح الخلية المحددة.
   4. إلغاء إمكانات تقاطع السائل بين ماصة والحلول حمام إلى الصفر باستخدام "ماصة تعويض" الأمر في واجهة قائد البرنامج.
   5. تعيين مكبر للصوت الكمبيوتر التي تسيطر عليها كومأندر إلى الجهد المشبك واختبار الغشاء إلى وضع "حمام".
   6. التركيز بشكل جيد لعرض أكثر وضوحا من الخلية، ثم خفض تدريجيا ميكروبيبيت باستخدام ميكرومانيبولاتور في سرعة منخفضة والمتوسطة.
   7. عندما ميكروبيبيت على مقربة من الخلية (يتضح من انخفاض التيار عندما أثارها أمر اختبار الغشاء)، وإزالة الضغط الإيجابي المنخفض على الفور وتطبيق ضغط سلبي ضعيف (0.1 مل حجم حقنة) لتشكيل جيغاسيال (> 1 GΩ) .
   8. مراقبة المقاومة مع اختبار الغشاء. إذا كانت المقاومة أكثر من 500 ميجاواط، ولكن أقل من 1 جيجاواط، استخدم إمكانات سلبية (عادة ما تكون قابلية الإمساك التي تم تعيينها إلى -60 مف)، والتي يمكن أن تساعد في تشكيل الجيجاسي. تعويض التيار بالسعة عابرة من ميكروبيبيت.
   9. إذا كان الختم> 1 GΩ ومستقرة (كما هو مبين في واجهة البرنامج)، وتطبيق شفط وجيزة وقوية من أجل كسر غشاء الخلية. لا تنطبق التعويض عن سيمقاومة الشفاء و سعة الخلية.
   10. مباشرة بعد تحقيق تكوين خلية كاملة ناجحة، وتطبيق خطوة 10 هيبيربولاريزينغ مف (5 آثار مع الحد الأدنى من فترات زمنية، مدة 20 مللي ثانية، وعينة إشارة في 20 كيلو هرتز) من إمكانية عقد من -60 مف.
   11. تبديل وضع الجهد إلى وضع صفر الحالي ووضع علامة أسفل قراءات من واجهة البرنامج أو إجراء تسجيل خالية من الفجوة (10-60 ق) لقراءات الغشاء المحتملة للخلية.
   12. التبديل بسرعة إلى والبقاء في وضع الجهد وتطبيق بروتوكولات الجهد وفقا للتجارب المخطط لها وقياس الردود الحالية. لا يتم تطبيق الطرح على تيار التسرب الداخلي أثناء التسجيلات.
   13. مراقبة استقرار الردود خلال التسجيلات، أو المعلمات المختلفة للخلية. على سبيل المثال، استخدم واجهة اختبار "غشاء اختبار" للتحقق من مقاومة الإدخال (R _ط )، ومقاومة سلسلة (R _ق ) والخلية(C _م ) في اختبار الغشاء في وضع "الخلية" أثناء تبديل البروتوكولات.
       ملاحظة: قطرات مفاجئة في مقاومة المدخلات عادة ما يدل على التصحيح فضفاضة، وزيادة دراماتيكية في المقاومة سلسلة قد يكون مؤشرا على طرف ميكروبيبيت انسداد من العضيات داخل الخلايا أو شظايا غشاء. أثناء التسجيل، ورصد بانتظام موقع ميكروبيبيت للتحقق مما إذا كان يحدث الانجراف، والتي قد تؤدي إلى فقدان التصحيح. إذا الانجراف هو مشكلة، ورفع بعناية معا ميكروبيبيت وخلايا الترقيع بعيدا عن الجزء السفلي من غرفة التسجيل. قد تؤدي هذه الخطوة في بعض الأحيان إلى فقدان التصحيح، وفي هذه الحالة، فمن الضروري لتكرار كامل خلية التصحيح المشبك الإجراء.

5. تحليل الخصائص الكهربية الكهربية السلبية للخلايا

1. بعد الحصول على البيانات من التجارب التصحيح المشبك، افتح البيانات خالية من الفجوة في البرنامج كلامبيت وقياس متوسطقيمة لإمكانية غشاء يستريح لكل خلية. بدلا من ذلك، استخدم القيمة كما هو ملحوظ من الجهد صفر التيار في الوضع الحالي. تصحيح القيم مع إمكانات تقاطع السائل (12.4 مف في هذه الدراسة).
2. فتح البيانات من الخطوة 10-مف هيبيربولاريزينغ (ΔV) التي تم الحصول عليها من خلية، وقياس الفرق الحالي قبل وأثناء الخطوة (Δ I _خطوة )، وحساب مقاومة الإدخال (R _i ) باستخدام المعادلة على النحو التالي:
   
3. حساب السعة الخلية (C _م ، في وحدة من يف) (استخدام نفس البيانات الحالية من 10-مف خطوة هيبيربولاريزينغ من خلال دمج المساحة الإجمالية تحت تيار مكثف الغشاء خلال الأولي الحالي تسوس عابرة رفعت على الزناد خطوة الجهد)، للحصول على قيمة إجمالي الشحن المتراكم (Q، في وحدة با • مللي ثانية) للخلية. استخدم المعادلة التالية:
   
4. حساب قيمة المقاومة سلسلة (R _s ) لكل خلية عن طريق تركيب الحالي عابر الأولي من الخطوة السلبية 10-مف مع خوارزمية أسي القياسية للحصول على الوقت الحالي تسوس الحالي ( T ، في وحدة مس) واستخدام بعد المعادلة:
   

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

الإجراء الهضم الأنزيمي وصفها لعزل الخلايا الظهارية من البربخ ذيل الفئران هو بروتوكول معدلة من دراساتنا السابقة ^{9 ، 12} . هذه الطريقة تنتج خليطا من الخلايا المفردة مع أكثر من 90٪ بقاء ودون بثور سطحية أو تورم حجم الخلية. يت...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذا البروتوكول، فإن تشتت الأنزيمية من الفئران ذيل البربخ يولد باستمرار الخلايا الظهارية صحية. نوعية الخلايا الظهارية البربخية للتجارب التصحيح المشبك يعتمد على بضع خطوات حاسمة في البروتوكول. على سبيل المثال، الطرد المركزي من خليط الخلية في قوة الطرد المركزي منخف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument of AXON system
Computer controlled amplifier	Molecular Devices - Axon	Multiclamp 700B patch-clamp amplifier
Digital Acquisition system	Molecular Devices - Axon	Digidata 1550 converter
Microscope	Olympus	BX-61WI
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Recording chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-324C
Instrument of HEKA system
Patch Clamp amplifier	Harvard Bioscience - HEKA	EPC-10 USB double
Microscope	Olympus	IX73
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Recording chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-324C
Other Instrument
Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-1000
Recording Chamber	Warner Instruments	RC-26G or homemade chamber
Borosilicate capillary glass with filament	Sutter Instrument / Harvard Apparatus	BF150-86-10
Vibration isolation table	TMC	63544
Digital Camare	HAMAMASTU	ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
Reagents for isolation
RPMI 1640 medium	Gibco	22400089
Penicillin/Streptomycin	Gibca	15140112
IMDM	ATCC	30-2005
IMDM	Gibco	C12440500BT
Collagenase I	Sigma	C0130
Collagenase II	Sigma	C6885
5-α-dihydrotestosterone	Medchemexpress	HY-A0120
Fetal bovine serum	capricorn	FBS-12A
Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM	Sigma/various	V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM	Sigma/various	M2393
EGTA, 0.1mM	Sigma/various	E4378
HEPES, 10mM	Sigma/various	V900477
K-gluconate, 100mM	Sigma/various	P-1847
Mg-ATP, 3mM	Sigma/Various	A9187
The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM	Sigma/various	V900058
KCl, 4.7mM	Sigma/various	V900068
CaCl2, 2.5mM	Sigma/various	V900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mM	Sigma/various	M2393
NaH2PO4, 1.2mM	Sigma/various	V900060
HEPES, 10mM	Sigma/various	V900477
Glucose, 10mM	Sigma/various	V900392
For pH adjustment
NaOH	Sigma/various	V900797	Purity >=97%
KOH	Sigma/various	60371	Purity >=99.99%