Grabaciones de parche de sujeción de células enteras de células epiteliales primarias aisladas del epidídimo

Resumen

Se presenta un protocolo que combina el aislamiento de células y de células enteras patch-clamp de registro para medir las propiedades eléctricas de la primaria células epiteliales disociadas de la cauda de la rata epididimidas. Este protocolo permite investigar las propiedades funcionales de las células epiteliales epididimales primarias para dilucidar adicionalmente el papel fisiológico del epidídimo.

Resumen

El epidídimo es un órgano esencial para la maduración de los espermatozoides y la salud reproductiva. El epitelio epidídimo consiste en tipos de células intrínsecamente conectados que son distintos no sólo en características moleculares y morfológicas sino también en propiedades fisiológicas. Estas diferencias reflejan sus diversas funciones, que en conjunto establecen el microambiente necesario para el desarrollo de espermatozoides post-testicular en el lumen epididimario. La comprensión de las propiedades biofísicas de las células epiteliales epididimales es crítica para revelar sus funciones en el esperma y la salud reproductiva, tanto en condiciones fisiológicas como fisiopatológicas. Mientras que sus propiedades funcionales aún no se han dilucidado completamente, las células epiteliales epididimales se pueden estudiar mediante la técnica de parche-clamp, una herramienta para medir los eventos celulares y las propiedades de membrana de células individuales. Aquí, describimos los métodos de aislamiento de células y de células enteras de pinza de sujeción de grabación a meaAsegúrese de las propiedades eléctricas de las células epiteliales disociadas primarias de la rata cauda epididimidos.

Introducción

El epidídimo en el tracto reproductor masculino es un órgano revestido con una capa de células epiteliales de mosaico. Al igual que en otros tejidos epiteliales, los diversos tipos celulares del epitelio epidídimo, incluyendo células principales, células claras, células basales y células de los sistemas inmunológico y linfático, trabajan de manera concertada para funcionar como la barrera en el frente del túbulo y como Células de apoyo para la maduración de los espermatozoides y la fisiología ^{1 , 2 , 3} . Por lo tanto, estas células epiteliales desempeñan un papel esencial en la salud reproductiva.

Las células epiteliales se consideran generalmente como células no excitables que son incapaces de generar potenciales de acción de todo o nada en respuesta a los estímulos despolarizantes, debido a la falta de canales de Na ⁺ o Ca ^{2 + con} voltaje controlado ^{4 , 5} . Sin embargo, las células epiteliales expresan uniQue conjuntos de canales de iones y los transportadores que regulan sus funciones fisiológicas especializadas, como la secreción y el transporte de nutrientes [ ^6] . Diferentes células epiteliales, por lo tanto, poseen características eléctricas características. Por ejemplo, las células principales expresan el CFTR para el transporte de fluidos y cloruros y expresan el TRPV6 para la reabsorción de calcio, mientras que las células claras expresan la bomba de protones V-ATPasa para la acidificación luminal ^{1 , 7 , 8 , 9} . Algunos transportadores y canales iónicos que regulan las características fisiológicas de las células epiteliales epididimales han sido reportados, pero las propiedades funcionales de las células epiteliales epididimales en gran parte aún no se conocen ^{10 , 11 , 12 , 13} .

WhOle-cell patch-clamp es una técnica bien establecida para examinar las propiedades intrínsecas de ambas células excitables y no excitables, y es particularmente útil para estudiar las funciones de células primariamente disociadas en muestras de células heterogéneas; La pinza de tensión se utiliza para medir las propiedades de la membrana pasiva y las corrientes iónicas de las células individuales ^{14 , 15} . Las propiedades de la membrana pasiva incluyen resistencia de entrada y capacitancia. El primer parámetro indica la conductancia intrínseca de la membrana, mientras que el segundo implica el área superficial de la membrana celular (una bicapa de fosfolípidos, donde están localizados los canales iónicos y los transportadores, que sirve como aislante fino que separa los medios extracelulares e intracelulares). La capacitancia de la membrana es directamente proporcional a la superficie de la membrana celular. Junto con la resistencia de la membrana que se refleja por la resistencia de entrada, la constante de tiempo de la membrana, wQue indica la rapidez con que el potencial de la membrana celular responde al flujo de las corrientes de los canales iónicos. A este respecto, al combinar las características de respuesta de corriente de una serie de etapas de tensión aplicadas a las células, se determinan las cinéticas biofísicas y las propiedades de las células ^{15 , 16 , 17 , 18} .

En el presente artículo se describen los procedimientos para aislar células epiteliales del epidídimo de cauda de rata y los pasos para medir las propiedades de membrana de diferentes tipos de células en la mezcla de células disociadas usando la abrazadera de parche de células enteras. Se muestra que las células epididimales principales exhiben propiedades electrofisiológicas de membrana distintas y que las conductancias pueden identificarse fácilmente a partir de otros tipos de células.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevan a cabo de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Shanghai, que cumplen con los requisitos locales e internacionales.

1. Animales Experimentales

1. Utilizar ratas Sprague-Dawley macho adultas (~ 300-450 g) entre 8-12 semanas de edad. A esta edad en las ratas, los espermatozoides han llegado a la cauda epididimida.

2. Aislamiento de las células epiteliales de los epididimidos de la cauda de la rata

NOTA: Los siguientes pasos se realizan bajo condiciones no asépticas, a menos que se indique lo contrario.

1. Preparación de instrumentos de disección y reactivos
   1. Desinfecte las herramientas de disección por inmersión en etanol al 70% y deje que se sequen al aire.
   2. Encienda el baño de calentamiento (32 ° C); Preparar y precalentar 500 ml de 1x medio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) suplementado con 1% (v / v) de antibióticoTics (100 U / mL de penicilina y 100 μg / mL de estreptomicina final), y marcado como "RPMI (+ P / S 1: 100)". Realice este paso en una estación de trabajo controlada por flujo de aire limpio.
   3. Preparar y precalentar 1x 500 ml de Medio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM) que contiene aminoácidos no esenciales (0,1 mM) y piruvato de sodio (1 mM), y suplementado con 5-α-dihidrotestosterona (1 nM), 10% de bovino fetal Suero, 1% (v / v) de antibióticos (100 U / mL de penicilina y 100 mu g / ml de estreptomicina final) y se marcó como "Full-IMDM". Crear alícuotas de 50 ml y sellar con parafilm; Almacenar a 4 ° C. Use condiciones asépticas.
   4. Preparar una solución de digestión de la enzima colagenasa disolviendo colagenasa Tipo I y colagenasa Tipo II en RPMI (+ P / S 1: 100) dando como resultado 1 mg / ml de cada colagenasa en la solución. Filtrar a través de una membrana de 0,22 μm y marcar como "Solución de colagenasa". Mantener a temperatura ambiente (RT) hasta su uso. Ajustar el volumen de la solución enzimáticaSobre el peso de la enzima; El volumen mínimo requerido para ambos epididimidos de cauda de una sola rata es de 2 ml.
   5. Llenar un plato de 35 mm con RPMI (+ P / S 1: 100).
2. Disección de los epidídimos de cauda de rata
   1. Sacrificar al animal utilizando pentobarbital sódico 85 mg / kg ip o utilizando una cámara de isoflurano hasta que el animal no responda a la estimulación de la pinza de la cola; Siga por dislocación cervical.
   2. Desinfecte el bajo vientre limpiándolo con etanol al 70%, empuje suavemente los dos testículos hasta el abdomen inferior y luego abra el abdomen inferior cerca del escroto.
   3. Recoger la grasa epididimal, diseccionar todos los órganos reproductivos (testículos, epididimidos y conductos deferentes) y sumergir en el plato con RPMI (+ P / S 1: 100).
   4. Transferir los órganos reproductores en el plato con RPMI (+ P / S 1: 100) a una estación de trabajo aséptica.
   5. Diseccionar los epididimidos de la cauda de los tejidos conectivos y grasos y el epiCápsula didymal. Coloque un epidídimo con ~ 0.2 ml de solución de colagenasa en un tubo de 1.5 ml. Realice este paso en una estación de trabajo controlada por flujo de aire limpio.
3. Disociación de células individuales de los epidídimos de cauda de rata
   1. Cortar los epididimidos en la solución de colagenasa con tijeras finas hasta que el tejido se convierte en un líquido de tipo pasta. Enjuague las tijeras suavemente con el resto de la solución de enzima (~ 0,8 ml) en el tubo de 1,5 ml.
   2. Colocar el tubo en un termomixer de metal durante 30 min a 37 ° C con una velocidad de agitación de 1.000 rpm.
   3. Centrifugar la mezcla de enzima-tejido a 30 xg a RT durante 3 min y decantar el sobrenadante pegajoso que contiene principalmente el esperma.
   4. Resuspender el gránulo en 1 mL de IMDM completo para apagar toda la actividad enzimática. Transferir la suspensión celular a un tubo de 50 ml que contiene 49 ml de RPMI (+ P / S 1: 100).
      NOTA: Opcionalmente, filtrar la suspensión celular a través de una membrana de malla de 100 μm con triturat constanteIon para evitar grandes agregados celulares. Sin embargo, no utilice un filtro de malla si la suspensión celular es necesaria para el crecimiento de monocapas de células.
   5. Centrifugar la mezcla celular a 30 xg a RT durante 10 min; Decantar el sobrenadante.
   6. Resuspender el sedimento en 1 mL de IMDM completo con trituración suave durante al menos 5 minutos para disociar las células individuales de las mezclas de tejidos epididimales tratados con enzimas.
4. Separación de células epiteliales de otras células bajo condiciones asépticas
   1. Cultivar la suspensión de células en una placa de Petri de 10 cm que contenga IMDM completo durante al menos 8 h o durante la noche, en una incubadora a 32ºC en CO _ { _{2} al} 5%.
   2. Prepare los cubreobjetos estériles por adelantado por inmersión en alcohol 100%. Secar al aire y sumergir en un pequeño volumen del medio de cultivo. Coloque los cubreobjetos en platos de cultivo de 6 cm o en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos.
   3. A la mañana siguiente, cosecha las células epiteliales disociadas recolectando suavemente la célula suspenDe la placa de Petri, que consiste principalmente de células epiteliales. Centrifugar la suspensión de células a 30 xg a RT durante 5 min, y luego decantar el sobrenadante.
   4. Resuspenda el sedimento celular en ~ 2 mL de IMDM completo.
   5. Siembre 0,2 ml de la suspensión de células cosechadas en el centro de cada cubreobjetos estériles.
   6. Deje que la suspensión de células se asiente en la gotita de líquido durante al menos 10 minutos para permitir que las células se adhieran flojamente a los cubreobjetos de vidrio. Añadir con cuidado 1 ml de IMDM completo al borde de un plato de 10 cm, o 0,3 ml de IMDM completo a cada pocillo de una placa de 24 pocillos; No molestar a las células.
   7. Mantenga las células individuales aisladas en cubreobjetos en la incubadora a 32 ° C en CO _{2 al} 5% hasta que experimente el parche-abrazadera.

3. Soluciones de grabación y Micropipetas

NOTA: Para los experimentos de parche-abrazadera, use los mejores productos químicos y soluciones.

1. Preparación de soluciones madre
   1. Autoclavear todas las botellas para almacenamiento de stock y filtrar todas las soluciones madre (excepto las soluciones corrosivas) y filtrar por membranas de 0,22 μm antes de usar.
   2. Preparar todas las soluciones madre antes de la RT y almacenar a 4 ^° C: NaCl 5 M; 1 M KCl; MgCl $ _₂ $ 100 mM; CaCl _ { ₂ } 100 mM; NaH $ _₂ $ PO $ _₄ $ 200 mM; 100 mM de EGTA (pH 7,0 con KOH). Manipular NaOH 5 M, HCl 1 M y 1 KOH de M como soluciones corrosivas.
2. Preparación de solución de sal fisiológica de grabación externa estándar (PSS)
   1. Calentar las soluciones de stock a RT en la mañana de la grabación de patch-clamp.
   2. Pipeta los ingredientes de cada culata de acuerdo con el volumen final deseado, excepto CaCl _2, por ejemplo, para preparar 500 mL de PSS: NaCl 140 mM = 14 ml de 5M; 5 mM KCl = 2,5 ml de 1 M; 1,2 mM de MgCl $ _₂ $ = 6 ml de 100 mM; NaH _ { _2} PO _ { ₄ } 1,2 mM = 3 ml de 200 mM.
   3. Añadir doble(DdH $ _₂ $ O) hasta el volumen final de 400 ml y se equilibra.
   4. Se pesan 0,9 g de glucosa y 1,19 g de HEPES y se disuelve completamente en la mezcla en solución.
   5. Añadir el caldo de CaCl $ _₂ $ (2,5 mM = 12,5 ml de 100 mM) con agitación.
   6. Añadir hasta el 99% del volumen final.
   7. Ajustar el pH a 7,4 utilizando NaOH o HCl.
   8. Compruebe la osmolaridad y ajuste con NaCl 5 M o glucosa, si es necesario.
   9. Añadir ddH $ _₂ $ O al volumen final de 500 ml en un cilindro.
3. Preparación de soluciones internas de micropipetas (soluciones basadas en K ^{+ a} base de EGTA)
   1. Pesar o pipetear el volumen correcto de los reactivos de cada culata de acuerdo con el volumen final deseado y de la concentración, por ejemplo, para la preparación de 50 ml bajo EGTA K ⁺ basado en la solución intracelular a un volumen de ~ 30 ml ddH ₂ O: 100 mM K-gluconato = 1,17 g; KCl 35 mM = 1,75 ml de 1 M; 2 mM de MgCl ₂ = 1 mlDe 100 mM; EGTA 0,1 mM = 0,05 ml de 100 mM; HEPES 10 mM = 0,072 g.
   2. Añadir suficiente agua para ~ 95% del volumen final y permitir que la solución para equilibrar a RT. Asegúrese de que la solución es clara.
   3. Mientras se agita constantemente la solución, se ajusta el pH a 7,2 usando KOH.
   4. Pesar y añadir 0,078 g de Mg-ATP a la solución hasta que se disuelve completamente.
   5. Colocar la solución sobre hielo y utilizar una pequeña alícuota para la medición de la osmolaridad; Típicamente, las soluciones miden ~ 290 mOsmol y no necesita ajuste. Si la osmolaridad difiere significativamente de 280-295 mOsmol, prepare una nueva solución.
   6. Añadir ddH ₂ O al volumen final.
   7. Se divide la solución en alícuotas de 500 μL, se filtra con un filtro de jeringa de 0,2 μm, se sella herméticamente y se almacena inmediatamente a ≤ -20 ° C.
   8. En la fecha del experimento de parche-abrazadera, descongelar una alícuota de solución intracelular sobre hielo y mantener enfriado durante el experimento de parche-abrazadera paraPrevenir la degradación.
4. Tire de las pipetas de parche de los capilares de vidrio (siguiendo el manual del usuario del extractor de pipeta) para obtener tamaños de micropipeta con una resistencia de 5-10 M cuando se llena con solución intracelular.

4. Configuración del experimento Patch-Clamp y establecimiento de la configuración de células enteras con celdas

1. Configuración del experimento de patch-clamp
   1. Encienda la instalación de la abrazadera de parche (computadora, amplificador controlado por ordenador, digitalizador, etc. )
   2. Abra el software de patch-clamp ( por ejemplo, AXON pCLAMP10 o HEKA PatchMaster) y configure los protocolos para las grabaciones electrofisiológicas. Ajuste el filtro para la señal a paso bajo a 1-3 kHz y el digitalizador a 10-20 kHz.
   3. Encienda la cámara, el micromanipulador y la fuente de luz.
   4. Cuando el amplificador controlado por computadora está encendido, conecte a tierra el cuerpo del experimentador tocando con las manos el aparejo de la abrazadera del remiendo que se ha puesto a tierra,Antes de tocar el headstage, para protegerlo de descargas eléctricas.
   5. Transferir las células epiteliales de cultivo en el cubreobjetos de vidrio a la cámara de registro llena de ~ 1 mL de PSS estándar a RT. Con cuidado, cambie el PSS de baño por lo menos dos veces usando una pipeta antes de cualquier experimento de parche.
      NOTA: Opcionalmente, rellene el sistema de perfusión con PSS estándar u otra solución externa de acuerdo con el experimento planificado. Perfure la cámara de grabación montada en microscopio (RC-26G o RC-26GLP) con PSS varias veces a una velocidad de ~ 2 mL / min antes del inicio de los experimentos de parche-abrazadera. Asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas a lo largo del sistema de perfusión.
   6. Ver y seleccionar las células bajo un microscopio invertido utilizando objetivos 10X y 40X equipados con un sistema óptico de contraste de interferencia diferencial. Busque grandes células aisladas aisladas para la grabación. Identificar las células epiteliales epididimales aisladas por su forma esférica con mIcrovilli en un extremo de las membranas y la distribución polarizada de los contenidos intracelulares ( Figura 1 ].
   7. Utilizando una jeringa de 1 ml (una aguja de microjeradura no metálica hecha en casa), llene una micropipeta con la solución interna (solución baja basada en EGTA K ⁺ , ver paso 3.3). Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la micropipeta, lo que puede aumentar la resistencia de la micropipeta. Use una solución suficiente para que la solución interna sumerja el electrodo de alambre de plata revestido con cloruro dentro del soporte de la micropipeta.
   8. Monte la micropipeta en el soporte del electrodo y aplique una presión positiva baja (volumen de la jeringa de ~ 0,2 ml). Mantenga la baja presión positiva continua hasta tocar la membrana celular en los pasos posteriores.
2. Establecimiento de la configuración de células enteras con celdas para grabaciones
   1. Sumerja la pipeta en la solución del baño a la velocidad más alta del micromanipulador. Encuentre la pipetaPunta en la pantalla conectada a la cámara digital; Reduzca la velocidad del micromanipulador al modo medio-alto.
   2. Compruebe rápidamente la resistencia de la micropipeta (5-10 MΩ) utilizando el comando de interfaz de adquisición de datos ( por ejemplo, "Membrane Test" en el sistema AXON) aplicando un paso de tensión ( por ejemplo, 5 mV durante 100 ms) generado por el amplificador controlado por ordenador. Cambie a una nueva micropipeta si la resistencia está significativamente fuera de este rango.
   3. Empezar a mover hacia abajo el objetivo montado en el microscopio; Guíe gradualmente la micropipeta hacia la celda seleccionada. Baje siempre el objetivo primero y luego baje la micropipeta hasta el plano de enfoque, hasta que la micropipeta esté por encima de la superficie central de la celda seleccionada.
   4. Cancelar el potencial de unión de líquidos entre la pipeta y las soluciones de baño a cero mediante el comando "offset de pipeta" en la interfaz del controlador del software.
   5. Configure el amplificador de controlY la prueba de membrana al modo "Baño".
   6. Foco fino para una visión más clara de la célula, luego baje gradualmente la micropipeta utilizando el micromanipulador a baja velocidad media.
   7. Cuando la micropipeta está cerca de la célula (demostrado por una disminución de la corriente cuando se dispara mediante el comando de prueba de membrana), retire inmediatamente la presión positiva baja y aplique una presión negativa débil (volumen de la jeringa de 0,1 ml) para formar la gigasa (> 1 GΩ) .
   8. Monitorear la resistencia con la prueba de membrana. Si la resistencia es> 500 MΩ pero <1 GΩ, aplique un potencial negativo (normalmente como el potencial de retención que se establece en -60 mV), lo que puede ayudar a formar el gigasal. Compensar la corriente transitoria capacitiva de la micropipeta.
   9. Si el sello es> 1 GΩ y estable (como se muestra en la interfaz del software), aplique una succión breve y fuerte para romper la membrana celular. No aplique una compensación por elY la capacitancia de la celda.
   10. Inmediatamente después de lograr una configuración de células enteras exitosa, aplique una etapa de hiperpolarización de 10 mV (5 trazas con intervalos de tiempo mínimos, duración de 20 ms, muestra de señal a 20 kHz) desde un potencial de retención de -60 mV.
   11. Cambie el modo de voltaje al modo de corriente cero y marque las lecturas de la interfaz de software o realice una grabación libre de huecos (10-60 s) para las lecturas de potencial de membrana de la celda.
   12. Cambiar rápidamente a y permanecer en el modo de voltaje y aplicar los protocolos de voltaje de acuerdo a los experimentos planificados y medir las respuestas actuales. La substracción no se aplica a la corriente de fuga intrínseca durante las grabaciones.
   13. Vigilar la estabilidad de las respuestas durante las grabaciones, o los diferentes parámetros de la célula. Por ejemplo, utilice la interfaz de comandos "Prueba de Membrana" para comprobar la resistencia de entrada (R _i ), la resistencia en serie (R _s ) y la celda(C _m ) en la prueba de membrana en el modo "Célula" durante el cambio de protocolos.
       NOTA: Las gotas repentinas en la resistencia de entrada son usualmente indicativas de un parche suelto, y un aumento dramático en la resistencia en serie puede ser indicativo de la obstrucción de la punta de la micropipeta por los organelos intracelulares o fragmentos de membrana. Durante la grabación, monitoree regularmente el lugar de la micropipeta para verificar si ocurre la deriva, lo que puede conducir a la pérdida del parche. Si la deriva es un problema, levante con cuidado la micropipeta y la celda de remiendo lejos del fondo de la cámara de registro. Este paso a veces puede conducir a la pérdida del parche, en cuyo caso, es necesario repetir el procedimiento de parche de sujeción de la célula completa.

5. Análisis de las propiedades electrofisiológicas pasivas de las células

1. Después de obtener los datos de los experimentos de parche-abrazadera, abra los datos libres de huecos en el software Clampfit y mida la mediaPara el potencial de membrana en reposo para cada célula. Alternativamente, utilice el valor marcado de la tensión de corriente cero en el modo actual. Corregir los valores con el potencial de unión líquido (12,4 mV en este estudio).
2. Abrir los datos procedentes de la etapa de hiperpolarización de 10 mV (? V) obtenido a partir de una célula, medir la diferencia de corriente antes de y durante la etapa (Δ I _STEP), y calcular la resistencia de entrada (R _i) utilizando la ecuación como:
   
3. Calcule la capacitancia de la celda (C _m , en la unidad de pF) (utilice los mismos datos actuales de la etapa de hiperpolarización de 10 mV integrando el área total bajo la corriente de condensador de membrana durante la corriente de decaimiento transitorio inicial elevada sobre el disparador de voltaje) Para obtener el valor de la carga acumulada total (Q, en la unidad de pA • ms) de la célula. Utilice la siguiente ecuación:
   
4. Calcule el valor de la resistencia en serie (R _s ) para cada celda ajustando la corriente transitoria inicial del paso negativo de 10 mV con un algoritmo exponencial estándar para obtener la corriente de decaimiento de constante de tiempo ( T , en unidad de ms) y utilice el valor Siguiente ecuación:
   

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Resultados

El procedimiento de digestión enzimática descrito para el aislamiento de células epiteliales del epidídimo de cauda de rata es un protocolo modificado de nuestros estudios anteriores ^{9 , 12} . Este método produce una mezcla de células individuales con más del 90% de viabilidad y sin ampollas superficiales o volumen de células hinchadas. La mezcla heterogénea de células se compone principalmente de células principales, c...

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Discusión

En este protocolo, la dispersión enzimática de los epididimidos de cauda de rata produjo consistentemente células epiteliales sanas. La calidad de las células epiteliales epididimales para los experimentos de parche-clamp depende de unos pocos pasos críticos en el protocolo. Por ejemplo, la centrifugación de la mezcla celular a una fuerza centrífuga baja (30 xg) es importante para eliminar los espermatozoides y el contenido luminal epidídimo; Las células epiteliales del epidídimo se vuelven insalubres en prese...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument of AXON system
Computer controlled amplifier	Molecular Devices - Axon	Multiclamp 700B patch-clamp amplifier
Digital Acquisition system	Molecular Devices - Axon	Digidata 1550 converter
Microscope	Olympus	BX-61WI
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Recording chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-324C
Instrument of HEKA system
Patch Clamp amplifier	Harvard Bioscience - HEKA	EPC-10 USB double
Microscope	Olympus	IX73
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Recording chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-324C
Other Instrument
Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-1000
Recording Chamber	Warner Instruments	RC-26G or homemade chamber
Borosilicate capillary glass with filament	Sutter Instrument / Harvard Apparatus	BF150-86-10
Vibration isolation table	TMC	63544
Digital Camare	HAMAMASTU	ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
Reagents for isolation
RPMI 1640 medium	Gibco	22400089
Penicillin/Streptomycin	Gibca	15140112
IMDM	ATCC	30-2005
IMDM	Gibco	C12440500BT
Collagenase I	Sigma	C0130
Collagenase II	Sigma	C6885
5-α-dihydrotestosterone	Medchemexpress	HY-A0120
Fetal bovine serum	capricorn	FBS-12A
Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM	Sigma/various	V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM	Sigma/various	M2393
EGTA, 0.1mM	Sigma/various	E4378
HEPES, 10mM	Sigma/various	V900477
K-gluconate, 100mM	Sigma/various	P-1847
Mg-ATP, 3mM	Sigma/Various	A9187
The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM	Sigma/various	V900058
KCl, 4.7mM	Sigma/various	V900068
CaCl2, 2.5mM	Sigma/various	V900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mM	Sigma/various	M2393
NaH2PO4, 1.2mM	Sigma/various	V900060
HEPES, 10mM	Sigma/various	V900477
Glucose, 10mM	Sigma/various	V900392
For pH adjustment
NaOH	Sigma/various	V900797	Purity >=97%
KOH	Sigma/various	60371	Purity >=99.99%