Ganzzellige Patch-Clamp Aufnahmen von isolierten primären Epithelzellen aus dem Epididymis

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll, das Zellisolation und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung kombiniert, um die elektrischen Eigenschaften der primär dissoziierten Epithelzellen aus den Ratten-Cauda-Epididymiden zu messen. Dieses Protokoll erlaubt die Untersuchung der funktionellen Eigenschaften von primären epididymalen Epithelzellen, um die physiologische Rolle des Nebenhodens weiter zu erforschen.

Zusammenfassung

Das Nebenhoden ist ein wesentliches Organ für die Spermienreifung und die reproduktive Gesundheit. Das epididymale Epithel besteht aus aufwendig verbundenen Zelltypen, die sich nicht nur in molekularen und morphologischen Merkmalen, sondern auch in physiologischen Eigenschaften unterscheiden. Diese Unterschiede spiegeln ihre vielfältigen Funktionen wider, die zusammen die notwendige Mikroumgebung für die post-testikuläre Spermienentwicklung im epididymalen Lumen bilden. Das Verständnis der biophysikalischen Eigenschaften der epididymalen Epithelzellen ist entscheidend für die Aufdeckung ihrer Funktionen in der Spermien- und Reproduktionsgesundheit, sowohl unter physiologischen als auch pathophysiologischen Zuständen. Während ihre funktionellen Eigenschaften noch nicht vollständig aufgeklärt sind, können die epididymalen Epithelzellen unter Verwendung der Patch-Clamp-Technik, einem Werkzeug zur Messung der zellulären Ereignisse und der Membraneigenschaften einzelner Zellen, untersucht werden. Hier beschreiben wir die Methoden der Zellisolation und der Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung auf meaSicher die elektrischen Eigenschaften der primär dissoziierten Epithelzellen aus der Ratte cauda epididymide.

Einleitung

Die Nebenhoden im männlichen Fortpflanzungstrakt sind ein Organ, das mit einer Schicht von Mosaik-Epithelzellen ausgekleidet ist. Wie in anderen Epithelgeweben arbeiten die verschiedenen Zelltypen des epididymalen Epithels, einschließlich der Hauptzellen, klaren Zellen, Basalzellen und Zellen aus den immunologischen und lymphatischen Systemen, in einer konzertierten Weise als Barriere an der Tubulusfront und als die Stützzellen für die Spermienreifung und Physiologie ^{1 , 2 , 3} . So spielen diese Epithelzellen eine wesentliche Rolle in der reproduktiven Gesundheit.

Epithelzellen werden im Allgemeinen als nicht-erregbare Zellen angesehen, die aufgrund von fehlenden spannungsgesteuerten Na ^{+ -} oder Ca ²⁺ -Kanälen ^{4 , 5} nicht in der Lage sind, All-or-none-Aktionspotentiale als Reaktion auf depolarisierende Stimuli zu erzeugen. Epithelzellen exprimieren jedoch uniQue Sätze von Ionenkanälen und Transportern, die ihre spezialisierten physiologischen Rollen regeln, wie Sekretion und Nährstofftransport ⁶ . Verschiedene Epithelzellen besitzen daher charakteristische elektrische Eigenschaften. Beispielsweise exprimieren die Hauptzellen die CFTR für den Fluid- und Chloridtransport und exprimieren den TRPV6 für die Calciumreabsorption, während die klaren Zellen die Protonenpumpe V-ATPase zur Luminesäurebildung ^{1 , 7 , 8 , 9} exprimieren. Manche Transporter und Ionenkanäle, die die physiologischen Merkmale der epididymalen Epithelzellen regulieren, wurden berichtet, aber die funktionellen Eigenschaften von epididymalen Epithelzellen sind weitgehend noch nicht verstanden ^{10 , 11 , 12 , 13} .

WhOle-Zell-Patch-Clamp-Aufzeichnung ist eine etablierte Technik zur Untersuchung der intrinsischen Eigenschaften sowohl erregbarer als auch nicht erregbarer Zellen und ist besonders hilfreich für die Untersuchung der Funktionen von primär dissoziierten Zellen in heterogenen Zellproben; Die Spannungsklemme dient zur Messung der passiven Membraneigenschaften und der Ionenströme einzelner Zellen ^{14 , 15} . Die passiven Membraneigenschaften umfassen Eingangswiderstand und Kapazität. Der frühere Parameter gibt die intrinsische Membranleitfähigkeit an, während letzteres die Oberfläche der Zellmembran impliziert (eine Phospholipiddoppelschicht, bei der sich Ionenkanäle und Transporter befinden, die als dünner Isolator dienen, der extrazelluläre und intrazelluläre Medien trennt). Die Membrankapazität ist direkt proportional zur Oberfläche der Zellmembran. Zusammen mit dem Membranwiderstand, der durch den Eingangswiderstand reflektiert wird, ist die Membranzeitkonstante, wWas zeigt, wie schnell das Zellmembranpotential auf den Fluss von Ionenkanalströmen reagiert, kann bestimmt werden. In dieser Hinsicht werden durch die Kombination der Stromansprechcharakteristiken aus einer Reihe von an die Zellen angelegten Spannungsschritten die biophysikalischen Kinetiken und Eigenschaften der Zellen bestimmt ^{15 , 16 , 17 , 18} .

In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir die Verfahren zur Isolierung von Epithelzellen aus dem Ratten-Cauda-Nebenhoden und die Schritte zur Messung der Membraneigenschaften verschiedener Zelltypen in der dissoziierten Zellmischung unter Verwendung der Ganzzell-Patch-Clamp. Wir zeigen, dass die epididymalen Hauptzellen unterschiedliche elektrophysiologische Membranen aufweisen und dass die Leitwerte leicht aus anderen Zelltypen identifiziert werden können.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

Alle Tierversuche werden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des ShanghaiTech University Institutional Animal Care and Use Committee durchgeführt, die die lokalen und internationalen Anforderungen erfüllen.

1. Experimentelle Tiere

1. Verwenden Sie erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten (~ 300-450 g) zwischen 8-12 Wochen alt. In diesem Alter bei den Ratten ist das Sperma in den Cauda-Nebenhoden angekommen.

2. Isolierung von Epithelzellen aus Ratten Cauda Epididymiden

HINWEIS: Die folgenden Schritte werden unter nicht-aseptischen Bedingungen durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.

1. Vorbereitung von Dissektionsinstrumenten und Reagenzien
   1. Desinfizieren Sie die Dissektion Werkzeuge durch Eintauchen in 70% Ethanol und lassen Sie sie lufttrocknen.
   2. Das Warmbad (32 ° C) einschalten; Vorbereiten und Vorwärmen von 500 ml 1x Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI), ergänzt mit 1% (V / V) AntibiotikumTics (100 U / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin-Finale) und als "RPMI (+ P / S 1: 100)" markiert. Führen Sie diesen Schritt in einer sauberen, luftstromgesteuerten Arbeitsstation durch.
   3. Vorbereiten und Vorwärmen von 1x 500 ml Iscoves modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) mit nicht essentiellen Aminosäuren (0,1 mM) und Natriumpyruvat (1 mM) und ergänzt mit 5-α-Dihydrotestosteron (1 nM), 10% fötalem Rind Serum, 1% (v / v) Antibiotika (100 U / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin-Finale) und als "Full-IMDM" markiert. 50 ml Aliquots erstellen und mit Parafilm versiegeln; Bei 4 ° C aufbewahren. Verwenden Sie aseptische Bedingungen.
   4. Vorbereitung einer Kollagenase-Enzym-Verdauungslösung durch Auflösen von Kollagenase Typ I und Kollagenase Typ II in RPMI (+ P / S 1: 100), was zu 1 mg / ml jeder Kollagenase in der Lösung führt. Durch eine 0,22 μm Membran filtrieren und als "Collagenase Solution" markieren. Bei Raumtemperatur (RT) bis zum Gebrauch aufbewahren. Passen Sie das Volumen der Enzymlösung anAuf das Gewicht des Enzyms; Das minimale Volumen, das für beide Cauda-Epididymide von einer einzigen Ratte benötigt wird, beträgt 2 ml.
   5. Füllen Sie eine 35 mm Schale mit RPMI (+ P / S 1: 100).
2. Dissektion von Ratten-Cauda-Nebenhoden
   1. Opfere das Tier entweder mit Natriumpentobarbital 85 mg / kg ip oder mit einer Isoflurankammer, bis das Tier nicht auf eine Schwanzstichreaktion reagiert; Folge durch zervikale Versetzung.
   2. Desinfizieren Sie den Unterleib durch Abwischen mit 70% Ethanol, schieben Sie die beiden Hoden vorsichtig bis zum Unterbauch und öffnen Sie dann den Unterbauch in der Nähe des Skrotums.
   3. Nehmen Sie das epididymale Fett auf, zerlegen Sie die ganzen Fortpflanzungsorgane (Hoden, Nebenhoden und Vas deferens) und tauchen Sie mit RPMI in die Schale ein (+ P / S 1: 100).
   4. Übertragen Sie die Fortpflanzungsorgane in die Schale mit RPMI (+ P / S 1: 100) zu einer aseptischen Arbeitsstation.
   5. Die Cauda-Nebenhoden aus dem Binde- und Fettgewebe und dem Epi herausziehenDidymalkapsel Legen Sie ein Nebenhoden mit ~ 0,2 ml Collagenase-Lösung in ein 1,5-ml-Röhrchen. Entwickeln Sie diesen Schritt in einer sauberen, luftstromgesteuerten Arbeitsstation.
3. Dissoziation einzelner Zellen aus Ratten-Cauda-Epididymiden
   1. Die Epididymide in der Collagenase-Lösung mit feiner Schere schneiden, bis das Gewebe zu einer pastösen Flüssigkeit wird. Spülen Sie die Schere vorsichtig mit dem Rest der (~ 0,8 ml) Enzymlösung im 1,5 mL Röhrchen ab.
   2. Legen Sie den Schlauch auf einen Metall-Thermomixer für 30 min bei 37 ° C mit einer Schüttelgeschwindigkeit von 1000 U / min.
   3. Die Enzym-Gewegemischung bei 30 xg bei RT für 3 min zentrifugieren und den klebrigen Überstand dekantieren, der hauptsächlich das Sperma enthält.
   4. Das Pellet in 1 ml Voll-IMDM resuspendieren, um alle enzymatischen Aktivitäten zu löschen. Übertragen Sie die Zellsuspension auf ein 50 mL Röhrchen mit 49 mL RPMI (+ P / S 1: 100).
      HINWEIS: Optional kann die Zellsuspension durch eine 100 μm Maschenmembran mit konstantem Triturat filtriert werdenIonen, um große Zelle Aggregate zu vermeiden. Verwenden Sie jedoch keinen Netzfilter, wenn die Zellsuspension zum Anbau von Zellmonoschichten benötigt wird.
   5. Zentrifugieren der zellulären Mischung bei 30 xg bei RT für 10 min; Dekantieren den Überstand.
   6. Das Pellet in 1 ml Voll-IMDM mit sanfter Verreibung für mindestens 5 min resuspendieren, um einzelne Zellen aus den enzymatisch behandelten epididymalen Gewebemischungen zu dissoziieren.
4. Trennung von Epithelzellen aus anderen Zellen unter aseptischen Bedingungen
   1. Kultur die Zellsuspension auf einer 10 cm Petrischale mit Voll-IMDM für mindestens 8 h oder über Nacht, in einem Inkubator bei 32 ° C in 5% CO ₂ .
   2. Bereiten Sie sterile Deckgläser vorab durch Eintauchen in 100% Alkohol vor. Luft trocknen und in einem kleinen Volumen des Kulturmediums eintauchen. Legen Sie die Deckgläser in 6 cm Kulturschalen oder in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte.
   3. Am nächsten Morgen ernten Sie die dissoziierten Epithelzellen, indem Sie die Zellsuspension sanft sammelnAus der Petrischale, die meist aus Epithelzellen besteht. Die Zellsuspension bei 30 xg bei RT für 5 min zentrifugieren und dann den Überstand dekantieren.
   4. Das Zellpellet in ~ 2 mL Voll-IMDM resuspendieren.
   5. Samen 0,2 ml der geernteten Zellsuspension auf die Mitte jedes sterilen Deckglases.
   6. Lassen Sie die Zellsuspension mindestens 10 min im Flüssigkeitströpfchen absetzen, damit die Zellen lose an den Glasdeckgläsern haften können. Sorgfältig 1 ml Voll-IMDM am Rand von 10 cm Schale oder 0,3 ml Voll-IMDM zu jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte hinzufügen; Zellen nicht stören
   7. Halten Sie die isolierten Einzelzellen auf Deckgläschen im Inkubator bei 32 ° C in 5% CO ₂ bis zum Patch-Clamp-Experiment.

3. Aufzeichnung von Lösungen und Mikropipetten

HINWEIS: Für die Patch-Clamp-Experimente verwenden Sie die hochwertigsten Chemikalien und Lösungen.

1. Vorbereitung der Lagerlösungen
   1. Autoklavieren Sie alle Flaschen für die Lagerung und filtern Sie alle Lagerlösungen (außer den korrosiven Lösungen) und filtern Sie vor dem Gebrauch durch 0,22 μm Membranen.
   2. Bereiten Sie alle Stammlösungen vorab bei RT vor und lagern bei 4 ^° C: 5 M NaCl; 1 M KCl; 100 mM MgCl _2; 100 mM CaCl _2; 200 mM NaH ₂ PO ₄ ; 100 mM EGTA (pH 7,0 mit KOH). Griff 5 M NaOH, 1 M HCl und 1 M KOH-Bestände als korrosive Lösungen.
2. Vorbereitung der standardmäßigen externen Aufzeichnungsphysiologischen Salzlösung (PSS)
   1. Warm die Lagerlösungen auf RT am Morgen der Patch-Clamp-Aufnahme.
   2. Pipettieren Sie die Zutaten aus jedem Bestand nach dem gewünschten Endvolumen, außer CaCl ₂ , zB zur Herstellung von 500 ml PSS: 140 mM NaCl = 14 ml 5M; 5 mM KCl = 2,5 ml 1M; 1,2 mM MgCl ₂ = 6 ml 100 mM; 1,2 mM NaH ₂ PO ₄ = 3 ml von 200 mM.
   3. Doppel hinzufügen-destilliertes Wasser (ddH ₂ O) bis zum Endvolumen von 400 ml und equilibrieren.
   4. 0,9 g Glucose und 1,19 g HEPES wiegen und in der Lösungsmischung vollständig auflösen.
   5. Füge den CaCl ₂ -Stand (2,5 mM = 12,5 ml 100 mM) unter Rühren zu.
   6. Fügen Sie bis zu 99% des Endvolumens hinzu.
   7. Den pH-Wert mit NaOH oder HCl auf 7,4 einstellen.
   8. Überprüfen Sie die Osmolarität und passen Sie mit 5 M NaCl oder Glukose, wenn nötig.
   9. Füge ddH ₂ O zum Endvolumen von 500 mL in einem Zylinder hinzu.
3. Vorbereitung von internen Micropipettenlösungen (niedrige EGTA K ⁺ -basierte Lösungen)
   1. Das richtige Volumen der Reagenzien aus jedem Vorrat entsprechend dem gewünschten Endvolumen und der Konzentration wiegen, z. B. zur Herstellung von 50 mL niedriger EGTA K ⁺ -basierter intrazellulärer Lösung auf ein Volumen von ~ 30 ml ddH ₂ O: 100 mM K-Gluconat = 1,17 g; 35 mM KCl = 1,75 ml von 1 M; 2 mM MgCl & _sub2 ; = 1 mlVon 100 mM; 0,1 mM EGTA = 0,05 ml von 100 mM; 10 mM HEPES = 0,072 g
   2. Füge genug Wasser für ~ 95% des Endvolumens hinzu und lasse die Lösung bei RT ausgleichen. Stellen Sie sicher, dass die Lösung klar ist.
   3. Bei gleichzeitiger Rührung der Lösung den pH-Wert mit KOH auf 7,2 einstellen.
   4. Wiegen und addieren 0,078 g Mg-ATP zur Lösung, bis es vollständig aufgelöst ist.
   5. Legen Sie die Lösung auf Eis und verwenden Sie ein kleines Aliquot für die Messung der Osmolarität; In der Regel misst die Lösung ~ 290 mOsmol und braucht keine Anpassung. Wenn sich die Osmolarität signifikant von 280-295 mOsmol unterscheidet, bereite eine neue Lösung vor.
   6. Füge ddH ₂ O zum Endvolumen hinzu.
   7. Die Lösung in 500 μl Aliquots aufteilen, mit einem 0,2 μm Spritzenfilter filtrieren, dicht abdichten und sofort bei ≤ -20 ° C lagern.
   8. Am Tag des Patch-Clamp-Experiments wird ein Aliquot der intrazellulären Lösung auf Eis aufgetaut und während des Patch-Clamp-Experiments gekühlt gehaltenAbbau verhindern
4. Ziehen Sie die Patchpipetten aus den Glaskapillaren (nach dem Pipetten-Puller-Benutzerhandbuch), um Mikropipettengrößen mit einem Widerstand von 5-10 M zu erhalten, wenn sie mit intrazellulärer Lösung gefüllt sind.

4. Einrichten des Patch-Clamp-Experiments und Festlegen der Ganzzell-Konfiguration mit Zellen

1. Einrichten des Patch-Clamp-Experiments
   1. Schalte die Patch-Clamp ein (Computer, computergesteuerter Verstärker, Digitalisierer usw. )
   2. Öffnen Sie die Patch-Clamp-Software ( zB AXON pCLAMP10 oder HEKA PatchMaster) und richten Sie die Protokolle für elektrophysiologische Aufnahmen ein. Setzen Sie den Filter für das Signal auf Tiefpass bei 1-3 kHz und den Digitalisierer bei 10-20 kHz.
   3. Schalten Sie die Kamera, den Mikromanipulator und die Lichtquelle ein.
   4. Wenn der computergesteuerte Verstärker eingeschaltet ist, erden Sie den Körper des Experimentierers, indem er die mitgelieferten Patch-Clamp-Rigs,Bevor man die Kopfstütze berührt, um sie vor elektrischen Schocks zu schützen.
   5. Übertragen Sie die kultivierenden Epithelzellen auf das Glasdeckel in die Aufzeichnungskammer, die mit ~ 1 ml Standard-PSS bei RT gefüllt ist. Ändern Sie die Bade-PSS mindestens zweimal mit einer Pipette vor den Patch-Clamp-Experimenten.
      HINWEIS: Optional füllen Sie das Perfusionssystem mit Standard-PSS oder einer anderen externen Lösung nach dem geplanten Experiment. Setzen Sie die mikroskopisch montierte Aufzeichnungskammer (RC-26G oder RC-26GLP) mit PSS ein paar Mal mit einer Geschwindigkeit von ~ 2 mL / min vor dem Start der Patch-Clamp-Experimente ein. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen am Perfusionssystem gefangen sind.
   6. Sehen und wählen Sie die Zellen unter einem invertierten Mikroskop mit 10X und 40X Objektiven mit einem differentiellen Interferenzkontrast optische System ausgestattet. Suchen Sie nach großen, isolierten Zellen für die Aufnahme. Identifizieren Sie die isolierten epididymalen Epithelzellen durch ihre sphärische Form mit rauem mIcrovilli an einem Ende der Membranen und polarisierte Verteilung von intrazellulären Inhalten ( Abbildung 1 ).
   7. Mit einer 1-ml-Spritze (hausgemachte, nichtmetallische Mikrospritzen-Nadel) füllen Sie eine Mikropipette mit der internen Lösung (niedrige EGTA K ⁺ -basierte Lösung, siehe Schritt 3.3). Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen in der Mikropipette gibt, was den Widerstand der Mikropipette erhöhen kann. Verwenden Sie genügend Lösung, so dass die interne Lösung die chloridbeschichtete Silberdraht-Elektrode im Mikropipettenhalter eintaucht.
   8. Montieren Sie die Mikropipette in den Elektrodenhalter und wenden Sie einen niedrigen Überdruck (~ 0,2 mL Spritzenvolumen) an. Halten Sie den niedrigen positiven Druck kontinuierlich, bis die Zellmembran in den späteren Schritten berührt wird.
2. Aufbau der Ganzzellkonfiguration mit Zellen für Aufnahmen
   1. Tauchen Sie die Pipette in die Badlösung mit der höchsten Geschwindigkeit des Mikromanipulators ein. Finde die PipetteTipp im Bildschirm an die Digitalkamera angeschlossen; Verlangsamen die Mikromanipulator-Geschwindigkeit auf den Mittel-Hoch-Modus.
   2. Überprüfen Sie den Mikropipettenwiderstand (5-10 MΩ) mit dem Datenerfassungsschnittstellenbefehl ( zB "Membrantest" im AXON-System) durch Anlegen eines vom computergesteuerten Verstärker erzeugten Spannungsschrittes ( zB 5 mV für 100 ms). Wechseln Sie zu einer neuen Mikropipette, wenn der Widerstand deutlich außerhalb dieses Bereichs liegt.
   3. Beginnen Sie, das auf dem Mikroskop angebrachte Objektiv nach unten zu bewegen. Allmählich die Mikropipette zur ausgewählten Zelle führen. Immer das Objektiv zuerst senken und dann die Mikropipette auf die Fokusebene senken, bis die Mikropipette oberhalb der Mittelfläche der ausgewählten Zelle liegt.
   4. Stoppen Sie das Flüssigkeitsübergangspotential zwischen Pipette und Badlösungen mit dem Befehl "Pipettenversatz" in der Kommandantenschnittstelle der Software auf Null.
   5. Stellen Sie den computergesteuerten Verstärker einAn die Spannungsklemme und den Membrantest auf den "Bad" -Modus.
   6. Feiner Fokus für eine klarere Sicht auf die Zelle, dann allmählich senken die Mikropipette mit dem Mikromanipulator bei der niedrigen mittleren Geschwindigkeit.
   7. Wenn die Mikropipette in der Nähe der Zelle liegt (durch einen verminderten Strom, wenn sie durch den Membran-Testbefehl ausgelöst wird) gezeigt wird, entfernen Sie sofort den niedrigen positiven Druck und wenden einen schwachen Unterdruck (0,1 mL Spritzenvolumen) an, um das Gigaseal (& gt; 1 G & OHgr;) zu bilden, .
   8. Überwachen Sie den Widerstand mit dem Membrantest. Wenn der Widerstand> 500 MΩ aber <1 GΩ ist, wenden Sie ein negatives Potential an (in der Regel als Haltepotential, das auf -60 mV eingestellt ist), das helfen kann, das Gigaseal zu bilden. Kompensieren Sie den transienten kapazitiven Strom der Mikropipette.
   9. Wenn die Dichtung> 1 GΩ und stabil ist (wie in der Software-Schnittstelle gezeigt), eine kurze und starke Absaugung, um die Zellmembran zu brechen. Keine Entschädigung für die SeUnd die Zellkapazität.
   10. Unmittelbar nach Erreichen einer erfolgreichen Ganzzellkonfiguration wird ein 10 mV Hyperpolarisationsschritt (5-Spuren mit minimalen Zeitintervallen, 20 ms Dauer, Signalprobe bei 20 kHz) aus einem Haltepotential von -60 mV angewendet.
   11. Schalten Sie den Spannungsmodus in den Nullstrommodus und markieren Sie die Messwerte von der Software-Schnittstelle oder führen Sie eine spaltfreie Aufnahme (10-60 s) für die Membranpotentialablesungen der Zelle durch.
   12. Schnell zurückschalten und im Spannungsmodus bleiben und die Spannungsprotokolle nach den geplanten Experimenten anwenden und die aktuellen Reaktionen messen. Die Subtraktion wird während der Aufnahmen nicht auf den intrinsischen Leckstrom angewendet.
   13. Überwachen Sie die Stabilität der Antworten während der Aufnahmen oder die verschiedenen Parameter der Zelle. Verwenden Sie zum Beispiel die Befehlsschnittstelle "Membrantest", um den Eingangswiderstand (R _i ), den Serienwiderstand (R _s ) und die Zelle zu überprüfenMembrankapazität (C _m ) im Membrantest im "Cell" -Modus während des Umschaltens von Protokollen.
       ANMERKUNG: Plötzliche Tropfen des Eingangswiderstandes sind in der Regel auf einen losen Flecken hindeuten, und ein dramatischer Anstieg des Serienwiderstands kann auf eine Mikropipettenspitze hinweisen, die durch die intrazellulären Organellen oder Membranfragmente verstopft ist. Während der Aufnahme überwacht regelmäßig die Mikropipettenposition, um zu prüfen, ob Drift auftritt, was zum Verlust des Patches führen kann. Wenn Drift ein Problem ist, heben Sie sorgfältig zusammen die Mikropipette und die Patching-Zelle weg von der Unterseite der Aufnahmekammer. Dieser Schritt kann manchmal zum Verlust des Patches führen. In diesem Fall ist es notwendig, das Ganzzell-Patch-Clamp-Verfahren zu wiederholen.

5. Analyse der passiven elektrophysiologischen Eigenschaften von Zellen

1. Nach dem Erhalten der Daten aus den Patch-Clamp-Experimenten öffnen Sie die lückenfreien Daten in der Clampfit-Software und messen den MittelwertWert für das ruhende Membranpotential für jede Zelle. Alternativ verwenden Sie den von der Nullstromspannung im aktuellen Modus abgegebenen Wert. Korrigieren Sie die Werte mit dem Flüssigkeitsübergangspotential (12,4 mV in dieser Studie).
2. Öffnen Sie die Daten aus dem aus einer Zelle erhaltenen 10-mV-Hyperpolarisationsschritt (ΔV), messen Sie die Stromdifferenz vor und während des Schrittes (Δ I- _Schritt ) und berechnen Sie den Eingangswiderstand (R _i ) unter Verwendung der Gleichung wie folgt:
   
3. Berechnen Sie die Zellenkapazität (C _m , in der Einheit von pF) (verwenden Sie die gleichen aktuellen Daten aus dem 10-mV-Hyperpolarisierungsschritt durch Integrieren der Gesamtfläche unter dem Membrankondensatorstrom während des anfänglichen transienten Abfallstroms, der auf den Spannungsstufenauslöser angehoben wird) Um den Wert der gesamten akkumulierten Ladung (Q, in der Einheit von pA • ms) der Zelle zu erhalten. Verwenden Sie die folgende Gleichung:
   
4. Berechnen Sie den Wert des Serienwiderstandes (R _s ) für jede Zelle, indem Sie den anfänglichen transienten Strom aus dem 10-mV-negativen Schritt mit einem Standard-Exponentialalgorithmus anpassen, um den zeitkonstanten Abklingstrom ( T , in der Einheit von ms) zu erhalten, und verwenden Sie die Nach Gleichung:
   

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Das beschriebene enzymatische Aufschlussverfahren für die Isolierung von Epithelzellen aus den Ratten-Cauda-Epididymiden ist ein modifiziertes Protokoll aus unseren bisherigen Studien ^{9 , 12} . Diese Methode erzeugt eine Mischung von Einzelzellen mit über 90% Lebensfähigkeit und ohne Oberflächenblasen oder gequollenes Zellvolumen. Die heterogene Zellmischung besteht hauptsächlich aus Hauptzellen, klaren Zellen und Basalzellen...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

In diesem Protokoll führte die enzymatische Dispersion der Ratten-Cauda-Epididymide konsequent zu gesunden Epithelzellen. Die Qualität der epididymalen Epithelzellen für die Patch-Clamp-Experimente hängt von einigen kritischen Schritten im Protokoll ab. Zum Beispiel ist die Zentrifugation der Zellmischung bei einer niedrigen Zentrifugalkraft (30 xg) für die Entfernung der Spermatozoen und des epididymalen Lumeninhalts wichtig; Die epididymalen Epithelzellen werden in Gegenwart der Spermatozoen in der Zellkultur ung...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument of AXON system
Computer controlled amplifier	Molecular Devices - Axon	Multiclamp 700B patch-clamp amplifier
Digital Acquisition system	Molecular Devices - Axon	Digidata 1550 converter
Microscope	Olympus	BX-61WI
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Recording chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-324C
Instrument of HEKA system
Patch Clamp amplifier	Harvard Bioscience - HEKA	EPC-10 USB double
Microscope	Olympus	IX73
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Recording chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-324C
Other Instrument
Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-1000
Recording Chamber	Warner Instruments	RC-26G or homemade chamber
Borosilicate capillary glass with filament	Sutter Instrument / Harvard Apparatus	BF150-86-10
Vibration isolation table	TMC	63544
Digital Camare	HAMAMASTU	ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
Reagents for isolation
RPMI 1640 medium	Gibco	22400089
Penicillin/Streptomycin	Gibca	15140112
IMDM	ATCC	30-2005
IMDM	Gibco	C12440500BT
Collagenase I	Sigma	C0130
Collagenase II	Sigma	C6885
5-α-dihydrotestosterone	Medchemexpress	HY-A0120
Fetal bovine serum	capricorn	FBS-12A
Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM	Sigma/various	V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM	Sigma/various	M2393
EGTA, 0.1mM	Sigma/various	E4378
HEPES, 10mM	Sigma/various	V900477
K-gluconate, 100mM	Sigma/various	P-1847
Mg-ATP, 3mM	Sigma/Various	A9187
The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM	Sigma/various	V900058
KCl, 4.7mM	Sigma/various	V900068
CaCl2, 2.5mM	Sigma/various	V900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mM	Sigma/various	M2393
NaH2PO4, 1.2mM	Sigma/various	V900060
HEPES, 10mM	Sigma/various	V900477
Glucose, 10mM	Sigma/various	V900392
For pH adjustment
NaOH	Sigma/various	V900797	Purity >=97%
KOH	Sigma/various	60371	Purity >=99.99%