Записи цельного клеточного зажима с изолированными первичными эпителиальными клетками от эпидидимиса

Резюме

Мы представляем протокол, который объединяет изоляцию клеток и запись цельноклеточного патч-зажима для измерения электрических свойств первичных диссоциированных эпителиальных клеток из эпидидимидов кауды крысы. Этот протокол позволяет исследовать функциональные свойства первичных эпидидиальных эпидиальных клеток для дальнейшего выяснения физиологической роли эпидидимиса.

Аннотация

Эпидидимис является важным органом для созревания спермы и репродуктивного здоровья. Эпидидиальный эпителий состоит из сложно связанных типов клеток, которые отличаются не только молекулярными и морфологическими особенностями, но и физиологическими свойствами. Эти различия отражают их разнообразные функции, которые вместе создают необходимую микросреду для развития постпикулярных сперматозоидов в эпидидимальном просвете. Понимание биофизических свойств эпидидиальных эпителиальных клеток имеет решающее значение для выявления их функций в области спермы и репродуктивного здоровья как в физиологических, так и в патофизиологических условиях. Хотя их функциональные свойства еще не полностью выяснены, эпидидиальные эпителиальные клетки могут быть изучены с использованием метода патч-зажима, инструмента для измерения клеточных событий и мембранных свойств отдельных клеток. Здесь мы описываем методы изоляции ячеек и записи патч-зажима цельной ячейки в meaЧто электрические свойства первичных диссоциированных эпителиальных клеток из эпидидимидов кауды крысы.

Введение

Эпидидимом в мужском репродуктивном тракте является орган, облицованный слоем эпителиальных клеток мозаики. Как и в других эпителиальных тканях, различные клеточные типы эпидидиального эпителия, включая основные клетки, прозрачные клетки, базальные клетки и клетки иммунологических и лимфатических систем, работают согласованным образом, чтобы действовать как барьер на фронте трубочки и как Поддерживающие клетки для созревания спермы и физиологии ^{1 , 2 , 3} . Таким образом, эти эпителиальные клетки играют важную роль в репродуктивном здоровье.

Эпителиальные клетки, как правило, рассматриваются как невосприимчивые клетки, которые неспособны генерировать все или ничтожные потенциалы действия в ответ на деполяризующие стимулы из-за отсутствия каналов Na ⁺ или Ca ²⁺ с напряжением ^{4 , 5} . Однако эпителиальные клетки экспрессируют uniНаборов ионных каналов и транспортеров, которые регулируют их специализированные физиологические роли, такие как секреция и транспортировка питательных веществ ⁶ . Поэтому различные эпителиальные клетки обладают характерными электрическими свойствами. Например, основные клетки экспрессируют CFTR для переноса жидкости и хлора и экспрессируют TRPV6 для реабсорбции кальция, тогда как прозрачные клетки экспрессируют V-АТФазу протонового насоса для люминальной подкисления ^{1 , 7 , 8 , 9} . Сообщалось о некоторых перевозчиках и ионных каналах, которые регулируют физиологические особенности эпидиальных эпителиальных клеток, но функциональные свойства эпидиальных эпидиальных клеток в значительной степени еще не поняты ^{10 , 11 , 12 , 13} .

белыйOle-cell patch-clamp - это хорошо зарекомендовавший себя метод для изучения внутренних свойств как возбудимых, так и невосприимчивых клеток, и особенно полезен для изучения функций прежде всего диссоциированных клеток в образцах гетерогенных клеток; Напряжение-зажим используется для измерения пассивных свойств мембраны и ионных токов отдельных ячеек ^{14 , 15} . Пассивные свойства мембраны включают входное сопротивление и емкость. Первый параметр указывает на внутреннюю проводимость мембраны, в то время как последняя подразумевает площадь поверхности клеточной мембраны (фосфолипидный бислой, где расположены ионные каналы и транспортеры, который служит в качестве тонкого изолятора, разделяющего внеклеточные и внутриклеточные среды). Мембранная емкость прямо пропорциональна площади поверхности клеточной мембраны. Вместе с сопротивлением мембраны, отражаемым входным сопротивлением, постоянная времени мембраны, wПоказывает, насколько быстро потенциал клеточной мембраны реагирует на поток токов ионного канала, можно определить. В связи с этим, комбинируя текущие характеристики отклика от серии этапов напряжения, применяемых к клеткам, определяются биофизическая кинетика и свойства клеток ^{15 , 16 , 17 , 18} .

В настоящей статье мы описываем процедуры выделения эпителиальных клеток из эпидидимиса кауды крысы и шаги для измерения мембранных свойств различных типов клеток в диссоциированной клеточной смеси с использованием цельноклеточного пластыря. Мы показываем, что основные эпидидимальные клетки проявляют отличные мембранные электрофизиологические свойства и что проводимости можно легко идентифицировать из других типов клеток.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты на животных проводятся в соответствии с руководящими принципами Комитета по институциональному уходу и использованию животных Университета Шанхая, которые отвечают местным и международным требованиям.

1. Экспериментальные животные

1. Используйте взрослых самцов крыс Sprague-Dawley (~ 300-450 г) в возрасте 8-12 недель. В этом возрасте у крыс сперма попала в кауда эпидидимиды.

2. Выделение эпителиальных клеток из крысиных эпидадимидов

ПРИМЕЧАНИЕ. Следующие шаги выполняются в неасептических условиях, если не указано иное.

1. Подготовка инструментов для вскрытия и реагентов
   1. Дезинфицируйте инструменты для вскрытия путем погружения в 70% этанола и дайте им высохнуть на воздухе.
   2. Включите нагревательную ванну (32 ° C); Подготовьте и предварительно подогрейте 500 мл 1x Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI) с добавлением 1% (об. / Об.) Антибиотика(100 мкг / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) и помечены как «RPMI (+ P / S 1: 100)». Выполните этот шаг на чистой рабочей станции с контролируемым воздушным потоком.
   3. Приготовление и предварительное нагревание 1 × 500 мл модифицированной среды Ивальсона (IMDM), содержащей незаменимые аминокислоты (0,1 мМ) и пирувата натрия (1 мМ), и дополненную 5-α-дигидротестостероном (1 нМ), 10% эмбриональной бычьей Сыворотка, 1% (об. / Об.) Антибиотиков (100 ед. / Мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) и помечены как «Full-IMDM». Создавайте аликвоты по 50 мл и герметизируйте парафильмом; Хранить при температуре 4 ° C. Используйте асептические условия.
   4. Подготовьте раствор для расщепления фермента коллагеназы путем растворения коллагеназы типа I и коллагеназы типа II в RPMI (+ P / S 1: 100), что приводит к 1 мг / мл каждой коллагеназы в растворе. Фильтруют через мембрану 0,22 мкм и маркируют как «раствор коллагеназы». Хранить при комнатной температуре (RT) до использования. Отрегулируйте объем раствора на основе ферментаПо весу фермента; Минимальный объем, необходимый для обоих кауда-эпидидимидов у одной крысы, составляет 2 мл.
   5. Заполните 35-миллиметровое блюдо RPMI (+ P / S 1: 100).
2. Рассечение эпидидимидов кауды крысы
   1. Жертвуйте животным либо с помощью пентобарбитала натрия 85 мг / кг внутрибрюшинно, либо с использованием камеры изофлюрана до тех пор, пока животное не ответит на раздражение хвоста; Следует за цервикальной дислокацией.
   2. Дезинфицируйте нижнюю часть живота, протирая 70% этанолом, осторожно подтолкните два семенника к нижней части живота, а затем откройте нижний живот около мошонки.
   3. Возьмите эпидидимальный жир, вырежьте все репродуктивные органы (яички, эпидидимиды и семявыносящие семена) и погрузите в блюдо с RPMI (+ P / S 1: 100).
   4. Перенесите репродуктивные органы в блюдо с RPMI (+ P / S 1: 100) на асептическую рабочую станцию.
   5. Вырезать кауда-эпидидимиды из соединительных и жировых тканей и эпиДидимальная капсула. Поместите один эпидидимис с ~ 0,2 мл раствора коллагеназы в пробирке объемом 1,5 мл. Проведите этот шаг на чистой рабочей станции с контролируемым потоком воздуха.
3. Диссоциация отдельных клеток из крысиных кауда-эпидидимидов
   1. Разрежьте эпидидимиды в растворе коллагеназы, используя тонкие ножницы, пока ткань не станет пастообразной жидкостью. Промойте ножницы осторожно с остальным (~ 0,8 мл) раствором фермента в пробирке 1,5 мл.
   2. Поместите трубку на металлический термомиксер в течение 30 мин при 37 ° С со скоростью встряхивания 1000 об / мин.
   3. Центрифугируйте смесь фермент-ткань при 30 мкг при комнатной температуре в течение 3 мин и декантируйте липкий супернатант, который содержит в основном сперму.
   4. Ресуспендируют гранулу в 1 мл Full-IMDM для гашения всей ферментативной активности. Перенесите клеточную суспензию в 50 мл пробирку, содержащую 49 мл RPMI (+ P / S 1: 100).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Необязательно фильтруйте клеточную суспензию через сетчатую мембрану 100 мкм с постоянным тритуратомЧтобы избежать крупных, клеточных агрегатов. Однако не используйте сетчатый фильтр, если необходима клеточная суспензия для выращивания монослоев клеток.
   5. Центрифугировать клеточную смесь при 30 мкг при комнатной температуре в течение 10 мин; Декантируют супернатант.
   6. Ресуспендируют гранулу в 1 мл Full-IMDM с нежным растиранием в течение по меньшей мере 5 минут для диссоциации отдельных клеток из ферментативно обработанных смесей эпидидимальной ткани.
4. Отделение эпителиальных клеток из других клеток в асептических условиях
   1. Культуру клеточной суспензии на 10 см чашке Петри, содержащей полный IMDM, в течение по меньшей мере 8 ч или в течение ночи, в инкубаторе при 32 ° С в 5% СО ₂ .
   2. Приготовьте стерильные покровные стекла заранее путем погружения в 100% -ный спирт. Воздух сушат и окунают в небольшой объем культуральной среды. Поместите покровные стекла в 6 см культуральные чашки или в одиночные лунки 24-луночного планшета.
   3. На следующее утро собирайте диссоциированные эпителиальные клетки, аккуратно собирая клеточную суспензиюSion из чашки Петри, которая состоит в основном из эпителиальных клеток. Центрифугируют клеточную суспензию при 30 мкг при комнатной температуре в течение 5 мин, а затем декантируют супернатант.
   4. Ресуспендируют осадок клеток в ~ 2 мл Full-IMDM.
   5. Вылейте 0,2 мл собранной суспензии клеток в центр каждого стерильного покровного стекла.
   6. Пусть клеточная суспензия оседает в капельке жидкости в течение по меньшей мере 10 минут, чтобы клетки могли свободно прилипать к покровным стеклам. Тщательно добавьте 1 мл Full-IMDM на краю 10 см чашки или 0,3 мл Full-IMDM в каждую лунку 24-луночного планшета; Не беспокоить клетки.
   7. Держите изолированные одиночные клетки в покровных стеклах в инкубаторе при 32 ° C в 5% CO ₂ до тех пор, пока эксперименты с патч-зажимами не будут выполнены.

3. Решения для записи и микропипетки

ПРИМЕЧАНИЕ. Для экспериментов с патч-зажимами используйте химикаты и решения наилучшего качества.

1. Подготовка запасных растворов
   1. Автоклавируйте все бутылки для хранения запасов и отфильтровывайте все исходные растворы (за исключением коррозионных растворов) и фильтруйте через мембраны 0,22 мкм перед использованием.
   2. Предварительно подготовьте все запасные растворы при комнатной температуре и храните при 4 ^o C: 5 М NaCl; 1 М KCl; 100 мМ MgCl ₂ ; 100 мМ CaCl ₂ ; 200 мМ NaH ₂ PO ₄ ; 100 мМ ЭГТА (pH 7,0 с КОН). Обрабатывать 5 М NaOH, 1 M HCl и 1 M KOH в качестве агрессивных растворов.
2. Подготовка стандартного внешнего физиологического раствора соли (PSS)
   1. Теплые запасы раствора RT в утренние часы записи патч-зажим.
   2. Внесите ингредиенты из каждого запаса в соответствии с желаемым конечным объемом, за исключением CaCl ₂ , например, для приготовления 500 мл PSS: 140 мМ NaCl = 14 мл 5 М; 5 мМ KCl = 2,5 мл 1 М; 1,2 мМ MgCl ₂ = 6 мл 100 мМ; 1,2 мМ NaH ₂ PO ₄ = 3 мл 200 мМ.
   3. Добавить двойной-дистиллированной воды (ddH ₂ O) до конечного объема 400 мл и уравновешивают.
   4. Взвешивают 0,9 г глюкозы и 1,19 г HEPES и полностью растворяют в смеси растворов.
   5. Добавьте при перемешивании смесь CaCl ₂ (2,5 мМ = 12,5 мл 100 мМ).
   6. Добавьте до 99% от конечного объема.
   7. Отрегулируйте рН до 7,4, используя NaOH или HCl.
   8. Проверьте осмолярность и отрегулируйте с помощью 5 М NaCl или глюкозы, если необходимо.
   9. Добавить ddH ₂ O до конечного объема 500 мл в цилиндре.
3. Подготовка внутренних растворов микропипетки (низкие растворы на основе EGTA K ⁺ )
   1. Взвешивают или пипетируют правильный объем реагентов из каждого запаса в соответствии с желаемым конечным объемом и концентрацией, например, для приготовления внутриклеточного раствора на 50 мл с низким содержанием EGTA K ⁺ до объема 30 мл ddH ₂ O: 100 мМ K-глюконата = 1,17 г; 35 мМ KCl = 1,75 мл 1 М; 2 мМ MgCl ₂ = 1 мл100 мМ; 0,1 мМ EGTA = 0,05 мл 100 мМ; 10 мМ HEPES = 0,072 г.
   2. Добавьте достаточное количество воды для ~ 95% конечного объема и позвольте раствору уравновешиваться при комнатной температуре. Убедитесь, что решение понятное.
   3. При постоянном перемешивании раствора отрегулируйте pH до 7.2 с помощью KOH.
   4. Взвесьте и добавьте 0,078 г Mg-ATP в раствор до полного растворения.
   5. Поместите раствор на лед и используйте небольшую аликвоту для измерения осмолярности; Как правило, решения измеряют ~ 290 mOsmol и не нуждаются в корректировке. Если осмолярность значительно отличается от 280-295 мОсмоль, подготовьте новое решение.
   6. Добавьте ddH ₂ O в конечный объем.
   7. Разделите раствор на аликвоты объемом 500 мкл, фильтр с фильтром для шприца 0,2 мкм, плотно уплотните и сразу же сохраните при ≤ -20 ° C.
   8. В день эксперимента с использованием патч-зажима оттаивайте одну аликвоту внутриклеточного раствора на льду и продолжайте охлаждать во время эксперимента с зажимамиПредотвращать деградацию.
4. Вытяните пипетки патча из стеклянных капилляров (в соответствии с руководством пользователя пипетки), чтобы получить размеры микропипетки с сопротивлением 5-10 М при заполнении внутриклеточным раствором.

4. Настройка эксперимента Patch-Clamp и установление конфигурации цельной ячейки с ячейками

1. Настройка эксперимента по патч-зажимам
   1. Включите установочный патч (компьютер, компьютерный усилитель, дигитайзер и т. Д. ).
   2. Откройте программное обеспечение patch-clamp ( например, AXON pCLAMP10 или HEKA PatchMaster) и настройте протоколы для электрофизиологических записей. Установите фильтр для сигнала на низкий проход на 1-3 кГц и дигитайзер на 10-20 кГц.
   3. Включите камеру, микроманипулятор и источник света.
   4. Когда усилитель с компьютерным управлением включен, заземлите корпус экспериментатора, прикоснувшись руками к заземляющей установке патч-зажима,Прежде чем прикоснуться к головной части, чтобы защитить его от поражения электрическим током.
   5. Перенесите культуральные эпителиальные клетки на покровное стекло на записывающую камеру, заполненную 1 мл стандартного PSS при комнатной температуре. Аккуратно смените купальный PSS как минимум два раза, используя пипетку перед любыми экспериментами по патч-зажимам.
      ПРИМЕЧАНИЕ. При необходимости, заполните систему перфузии стандартным PSS или другим внешним решением в соответствии с запланированным экспериментом. Перфузируйте записывающую камеру на микроскопе (RC-26G или RC-26GLP) с помощью PSS несколько раз со скоростью ~ 2 мл / мин до начала экспериментов с патч-зажимами. Убедитесь, что в системе перфузии нет пузырьков воздуха.
   6. Просмотр и выбор ячеек под инвертированным микроскопом с использованием целей 10X и 40X, оснащенных дифференциальной оптической системой с контрастными помехами. Ищите большие одиночные изолированные ячейки для записи. Идентифицировать изолированные эпидидиальные эпителиальные клетки по их сферической форме с грубым мIcrovilli на одном конце мембран и поляризованное распределение внутриклеточного содержимого ( рис. 1 ).
   7. Используя 1 мл шприц (самодельную иглу неметаллического микрошара), заполните микропипетку внутренним раствором (с низким раствором EGTA K ⁺ , см. Шаг 3.3). Убедитесь, что в микропипетке нет пузырьков воздуха, что может увеличить сопротивление микропипетки. Используйте достаточное количество раствора, чтобы внутренний раствор погрузил в держатель микропипетки покрытый хлоридом серебряный проволочный электрод.
   8. Установите микропипетку в держатель электрода и нанесите небольшое положительное давление (~ 0,2 мл объема шприца). Поддерживайте низкое положительное давление до тех пор, пока не коснитесь клеточной мембраны на последующих этапах.
2. Установление конфигурации целых ячеек с ячейками для записей
   1. Погрузите пипетку в раствор для ванны с максимальной скоростью микроманипулятора. Найти пипеткуНа экране, подключенном к цифровой камере; Замедлите скорость микроманипулятора до средневысотного режима.
   2. Быстро проверьте сопротивление микропипетки (5-10 МОм) с помощью команды интерфейса сбора данных ( например, «Мембранный тест» в системе AXON) путем применения шага напряжения ( например, 5 мВ на 100 мс), генерируемого с помощью компьютерного усилителя. Перейдите на новую микропипетку, если сопротивление значительно превышает этот диапазон.
   3. Начинайте движение вниз по объекту, установленному на микроскопе; Постепенно направляйте микропипетку к выбранной ячейке. Сначала сначала опускайте объектив, а затем опустите микропипетку в плоскость фокусировки, пока микропипетка не окажется над центральной поверхностью выбранной ячейки.
   4. Отмените потенциал соединения жидкости между пипеткой и растворами ванны до нуля, используя команду «смещение пипетки» в интерфейсе программного обеспечения командира программного обеспечения.
   5. Установите управляемый компьютером усилительИ к испытанию на напряжение и мембранный тест в режиме «Ванна».
   6. Тонкая фокусировка для более четкого обзора ячейки, затем постепенно опускайте микропипетку с помощью микроманипулятора с низкой средней скоростью.
   7. Когда микропипетка находится близко к ячейке (демонстрируется уменьшением тока при срабатывании команды мембранной проверки), немедленно снимите низкое положительное давление и примените слабое отрицательное давление (0,1 мл объема шприца), чтобы сформировать гигазальный (> 1 ГΩ) ,
   8. Контролируйте сопротивление с помощью теста мембраны. Если сопротивление> 500 МОм, но <1 ГΩ, примените отрицательный потенциал (обычно как потенциал удержания, который установлен на -60 мВ), что может помочь сформировать гигапазон. Компенсировать переходный емкостный ток микропипетки.
   9. Если уплотнение> 1 GΩ и стабильное (как показано в программном интерфейсе), примените короткое и сильное всасывание, чтобы сломать клеточную мембрану. Не применяйте компенсацию заРезистентности и емкости ячейки.
   10. Сразу же после достижения успешной конфигурации целых ячеек примените шаг гиперполяризации 10 мВ (5-трассировки с минимальными временными интервалами, длительность 20 мс, образец сигнала при 20 кГц) от удерживающего потенциала -60 мВ.
   11. Переключите режим напряжения в режим нулевого тока и отметьте показания с программного интерфейса или выполните запись без зазора (10-60 с) для показаний мембранного потенциала ячейки.
   12. Быстро переключайтесь обратно в режим напряжения и оставайтесь в режиме напряжения и применяйте протоколы напряжения в соответствии с запланированными экспериментами и измеряйте текущие ответы. Вычитание не применяется к внутреннему течению утечки во время записи.
   13. Контролируйте стабильность ответов во время записи или различные параметры ячейки. Например, используйте интерфейс команды «Membrane Test» для проверки входного сопротивления (R _i ), последовательного сопротивления (R _s ) и ячейки(C _m ) в мембранном тесте в режиме «Cell» во время переключения протоколов.
       ПРИМЕЧАНИЕ. Внезапные падения входного сопротивления обычно указывают на свободный патч, и резкое увеличение сопротивления серии может указывать на засорение наконечника микропипетки внутриклеточными органеллами или фрагментами мембраны. Во время записи регулярно контролируйте местоположение микропипетки, чтобы проверить, не происходит ли дрейф, что может привести к потере патча. Если дрифт является проблемой, осторожно поднимите микропипетку и исправляющую ячейку со дна камеры записи. Этот шаг иногда может привести к потере патча, и в этом случае необходимо повторить процедуру цельного клеточного зажима.

5. Анализ пассивных электрофизиологических свойств клеток

1. После получения данных из экспериментов с патч-зажимами, откройте данные без пробелов в программном обеспечении Clampfit и измерьте среднее значениеЗначение для потенциала покоя мембраны для каждой ячейки. В качестве альтернативы используйте значение, указанное ниже от напряжения нулевого тока в текущем режиме. Исправьте значения с потенциалом перехода жидкости (12,4 мВ в этом исследовании).
2. Открыть данные из гиперполяризационного шага 10 мВ ( & Dgr ; v) , полученный из клетки, измерить текущую разницу до и во время стадии (Δ я _шаг), и рассчитать входное сопротивление (R _I) , используя уравнение как:
   
3. Вычислите емкость ячейки (C _m , в единицах pF) (используйте те же самые текущие данные с этапа гиперполяризации 10 мВ, объединив общую площадь под током мембранного конденсатора во время начального тока спада переходного процесса, поднятого на триггер ступени напряжения) Для получения значения общего накопленного заряда (Q, в единицах pA • ms) ячейки. Используйте следующее уравнение:
   
4. Вычислите значение последовательного сопротивления (R _s ) для каждой ячейки, установив исходный переходный ток с отрицательного шага 10 мВ со стандартным экспоненциальным алгоритмом, чтобы получить постоянный ток распада времени ( T , в единицах мс) и использовать Следующее уравнение:
   

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Описанная процедура ферментативного расщепления для выделения эпителиальных клеток из эпидидимидов кауды крысы представляет собой модифицированный протокол из наших предыдущих исследований ^{9 , 12} . Этот метод дает смесь одиночных кле?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом протоколе ферментативная дисперсия эпидидимидов кауды крысы последовательно давала здоровые эпителиальные клетки. Качество эпидидиальных эпителиальных клеток для экспериментов с патч-зажимами зависит от нескольких критических шагов в протоколе. Например, центрифугирование...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument of AXON system
Computer controlled amplifier	Molecular Devices - Axon	Multiclamp 700B patch-clamp amplifier
Digital Acquisition system	Molecular Devices - Axon	Digidata 1550 converter
Microscope	Olympus	BX-61WI
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Recording chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-324C
Instrument of HEKA system
Patch Clamp amplifier	Harvard Bioscience - HEKA	EPC-10 USB double
Microscope	Olympus	IX73
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Recording chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-324C
Other Instrument
Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-1000
Recording Chamber	Warner Instruments	RC-26G or homemade chamber
Borosilicate capillary glass with filament	Sutter Instrument / Harvard Apparatus	BF150-86-10
Vibration isolation table	TMC	63544
Digital Camare	HAMAMASTU	ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
Reagents for isolation
RPMI 1640 medium	Gibco	22400089
Penicillin/Streptomycin	Gibca	15140112
IMDM	ATCC	30-2005
IMDM	Gibco	C12440500BT
Collagenase I	Sigma	C0130
Collagenase II	Sigma	C6885
5-α-dihydrotestosterone	Medchemexpress	HY-A0120
Fetal bovine serum	capricorn	FBS-12A
Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM	Sigma/various	V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM	Sigma/various	M2393
EGTA, 0.1mM	Sigma/various	E4378
HEPES, 10mM	Sigma/various	V900477
K-gluconate, 100mM	Sigma/various	P-1847
Mg-ATP, 3mM	Sigma/Various	A9187
The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM	Sigma/various	V900058
KCl, 4.7mM	Sigma/various	V900068
CaCl2, 2.5mM	Sigma/various	V900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mM	Sigma/various	M2393
NaH2PO4, 1.2mM	Sigma/various	V900060
HEPES, 10mM	Sigma/various	V900477
Glucose, 10mM	Sigma/various	V900392
For pH adjustment
NaOH	Sigma/various	V900797	Purity >=97%
KOH	Sigma/various	60371	Purity >=99.99%