精巣上体から分離した一次上皮細胞の全細胞パッチクランプ記録

要約

本発明者らは、ラット尾部精巣上体からの一次解離上皮細胞の電気的特性を測定するために、細胞分離および全細胞パッチクランプ記録を組み合わせたプロトコルを提示する。このプロトコルは、副睾丸の生理的役割をさらに解明するために、初代副睾丸上皮細胞の機能的特性の調査を可能にする。

要約

精巣上体は、精子の成熟および生殖に関する健康に不可欠な器官である。副睾丸上皮は、分子および形態学的特徴だけでなく生理学的特性においても区別される複雑に連結された細胞型からなる。これらの違いは、精巣上体内腔における精巣後精子の発生に必要な微小環境を共に確立する多様な機能を反映している。副睾丸上皮細胞の生物物理学的特性の理解は、生理学的および病態生理学的条件下での精子および生殖器の健康におけるそれらの機能を明らかにするために重要である。それらの機能的特性はまだ完全に解明されていないが、副睾丸上皮細胞は、細胞事象および単一細胞の膜特性を測定するためのツールであるパッチクランプ技術を用いて研究することができる。ここでは、細胞単離法および全細胞パッチクランプ法を用いて、ラット尾部精巣上体からの一次解離上皮細胞の電気的特性を確認してください。

概要

男性生殖管の精巣上体は、モザイク上皮細胞の層で裏打ちされた器官である。他の上皮組織と同様に、主細胞、清澄な細胞、基底細胞および免疫系およびリンパ系からの細胞を含む種々の細胞型の副睾丸上皮は、尿細管最前線で障壁として機能するよう協調して働き、精子成熟および生理学^1、2、3のための細胞を支持します。したがって、これらの上皮細胞は、リプロダクティブ・ヘルスに必須の役割を果たす。

上皮細胞は、一般による電圧依存性Na ⁺またはCa ²⁺チャネル^4,5の欠如に、刺激を脱分極に応答して、全か無かの活動電位を生成することができない非興奮性の細胞とみなされます。しかし、上皮細胞はユニ分泌および栄養輸送などの特殊な生理的役割を調節するイオンチャネルおよび輸送体のセット⁶ 。したがって、異なる上皮細胞は、特徴的な電気的特性を有する。例えば、主細胞は、流体及び塩化物輸送のためにCFTRを発現し、明確な細胞が管腔酸性^{1、7、8、9}のためのプロトンポンプV-ATPアーゼを発現するのに対し、カルシウム再吸収のためのTRPV6を発現します。精巣上体上皮細胞の生理機能を調節するいくつかのトランスポーターおよびイオンチャネルが報告されているが、精巣上体上皮細胞の機能的特性は、主として、まだ^{10、11、12、13に}は理解されていません。

Whオレ細胞パッチクランプ記録は、興奮性細胞および非興奮性細胞の両方の固有特性を調べるための確立された技術であり、異種細胞試料中の主に解離した細胞の機能を研究するのに特に有用である。電圧クランプは、受動膜特性と単セル^14、15のイオン電流を測定するために使用されます。受動的膜特性には、入力抵抗および容量が含まれる。前者のパラメータは固有膜コンダクタンスを示し、後者は細胞膜の表面積（細胞外および細胞内の媒体を分離する薄い絶縁体として働く、イオンチャネルおよび輸送体が位置するリン脂質二重層）を意味する。膜容量は、細胞膜の表面積に正比例する。入力抵抗によって反映される膜抵抗と共に、膜時定数w細胞膜電位がイオンチャネル電流の流れにどのくらい速く応答するかを示す指標を決定することができる。この点で、セルに印加される電圧の一連の工程からの電流応答特性を組み合わせることによって、細胞の生物物理学的動態及び特性は^{15、16、17、18を}決定します。

本論文では、ラット尾部精巣上体から上皮細胞を単離するための手順、および全細胞パッチクランプを用いて解離した細胞混合物中の異なる細胞型の膜特性を測定するための工程を記載する。精巣上体の主要細胞は明確な膜電気生理学的特性を示し、コンダクタンスは他の細胞型から容易に同定できることを示す。

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プロトコル

全ての動物実験は、ShanghaiTech University Institutional Animal Care and Use Committeeのガイドラインに従って実施され、これは国内外の要件を満たすものである。

1.実験動物

1. 成熟雄Sprague-Dawleyラット（約300〜450g）を8-12週齢の間に使用する。ラットのこの年齢で、精子は尾部精巣上体に到着した。

ラット・カウダ・エピジディミドからの上皮細胞の単離

注記：以下の手順は、特に明記しない限り、無菌条件下で実施します。

1. 解剖器具および試薬の調製
   1. 解離ツールを70％エタノールに浸して消毒し、空気乾燥させます。
   2. 温浴（32℃）を入れます。 1％（v / v）の抗生物質を補充した1x Roswell Park Memorial Institute 1640培地（RPMI）500mLを調製し、（100U / mLペニシリンおよび100μg/ mL最終ストレプトマイシン）で標識し、「RPMI（+ P / S 1：100）」と表示した。この手順は、清潔なエアーフロー制御作業ステーションで行います。
   3. 非必須アミノ酸（0.1mM）およびピルビン酸ナトリウム（1mM）を含有し、5-α-ジヒドロテストステロン（1nM）、10％ウシ胎仔血清（1mM）を補充した1×500mLのイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM） 1％（v / v）抗生物質（100U / mLペニシリンおよび100μg/ mL最終ストレプトマイシン）で洗浄し、「Full-IMDM」として標識した。 50 mLアリコートを作り、パラフィルムで密封する。 4℃で保存する。無菌状態を使用する。
   4. コラゲナーゼタイプIおよびコラーゲナーゼタイプIIをRPMI（+ P / S 1：100）に溶解して、溶液中の各コラゲナーゼ1mg / mLを生じるように、コラゲナーゼ酵素消化溶液を調製する。 0.22μm膜を通してろ過し、「コラゲナーゼ溶液」としてマークする。使用するまで室温（RT）に保つ。酵素溶液の容量を調整する酵素の重量に対して; 1匹のラットの両方の尾副睾丸に必要な最小量は2mLである。
   5. RPMI（+ P / S 1：100）で35mmディッシュを満たす。
2. ラット尾部精巣上体の解剖
   1. ペントバルビタールナトリウム85mg / kgを腹腔内投与するか、またはイソフルランチャンバーを使用して、動物が尾摘み刺激に応答しなくなるまで、動物を屠殺する。頚椎脱臼が続く。
   2. 下腹部を70％エタノールで拭いて消毒し、静かに2匹の精巣を下部腹部に押し込み、陰嚢近くの下部腹部を開きます。
   3. 精巣上体脂肪を拾い、全生殖器（精巣、精巣上体および精管）を摘出し、RPMI（+ P / S 1：100）で皿に浸す。
   4. RPMI（+ P / S 1：100）で皿の生殖器官を無菌作業ステーションに移す。
   5. 結合組織および脂肪組織からepididymidesを摘出し、epi異形カプセル。 1 mLの副睾丸を約0.2 mLのコラゲナーゼ溶液で1.5 mLのチューブに入れます。このステップを清潔な空気流量制御ワークステーションに行います。
3. ラット尾部精巣上体から単細胞の解離
   1. 組織がペースト状の液体になるまで、細かいはさみを使用してコラゲナーゼ溶液中の精巣上体を切断する。はさみをゆっくりと1.5mLチューブの残りの（〜0.8mL）酵素溶液ですすぎます。
   2. チューブをメタルサーモミキサー上に37℃で30分間、1000rpmの振盪速度で置く。
   3. 酵素 - 組織混合物をRTで30xgで3分間遠心分離し、ほとんどが精子を含む粘着性の上清を傾瀉する。
   4. ペレットを1mLのFull-IMDMに再懸濁し、すべての酵素活性を消失させる。 49mLのRPMI（+ P / S 1：100）を含む50mLチューブに細胞懸濁液を移す。
      注：必要に応じて、細胞懸濁液を100μmメッシュメンブレンに一定のトリチウムでろ過します大規模な細胞凝集を避けるためにイオン。ただし、増殖細胞単層の細胞懸濁液が必要な場合は、メッシュフィルターを使用しないでください。
   5. 室温で30分間、細胞混合物を10分間遠心分離する;上清を傾瀉する。
   6. 少なくとも5分間穏やかに磨り潰しながらペレットを1mL Full-IMDMに再懸濁し、酵素処理された副睾丸組織混合物から単一細胞を解離させる。
4. 無菌条件下での他の細胞からの上皮細胞の分離
   1. Full-IMDMを含む10cmペトリ皿上で少なくとも8時間または一晩、細胞懸濁液を5％CO ₂中の32℃のインキュベーター内で培養する。
   2. 100％アルコールに浸漬することにより、予め滅菌カバースリップを調製する。空気を乾燥させ、少量の培地に浸す。カバースリップを6cm培養皿または24ウェルプレートの単一ウェルに入れる。
   3. 翌朝、穏やかに細胞懸濁液を収集することによって解離した上皮細胞を回収する大部分は上皮細胞からなるペトリ皿からのものである。細胞懸濁液を室温で30xgで5分間遠心分離し、上清を傾瀉する。
   4. 〜2 mL Full-IMDMに細胞ペレットを再懸濁する。
   5. 採取した細胞懸濁液0.2mLを各無菌カバースリップの中心に置く。
   6. 細胞懸濁液を液滴中に少なくとも10分間置いて、細胞をガラスカバースリップに緩く付着させる。注意深く10 mLディッシュの端に1 mL Full-IMDMを、または24ウェルプレートの各ウェルに0.3 mL Full-IMDMを加えます。細胞を乱さないでください。
   7. パッチクランプ実験まで32℃、5％CO ₂インキュベーター内のカバーガラス上に単離された単一細胞を保つ。

3.記録液とマイクロピペット

注：パッチクランプ実験では、最高品質の化学物質と溶液を使用してください。

1. ストック溶液の調製
   1. ストック保存用にすべてのボトルをオートクレーブし、使用前にすべてのストック溶液（腐食性溶液を除く）をろ過し、0.22μmメンブレンでろ過する。
   2. 全てのストックRTに予め溶液、及び4 ^O Cで保存準備：5 MのNaCl; 1M KCl; 100mM MgCl ₂ ; 100mM CaCl ₂ ; 200mM NaH ₂ PO ₄ ; 100mM EGTA（pH7.0、KOH）。腐食性溶液として5M NaOH、1M HClおよび1M KOHストックを取り扱う。
2. 標準的な外部記録生理食塩水（PSS）の調製
   1. パッチクランプ記録の朝、ストック溶液を室温に温める。
   2. CaCl ₂を除く所望の最終容量に従って、 例えば 500mLのPSSを調製するために、各ストックから成分をピペットで採取する：140mMのNaCl = 14mLの5M; 5mM KCl = 2.5mLの1M; 1.2mM MgCl ₂ = 100mMの6mL; 1.2mMのNaH ₂ PO ₄ = 3mLの200mM。
   3. ダブルを追加（ddH ₂ O）を最終容量400mLになるまで加え、平衡化する。
   4. 0.9gのグルコースおよび1.19gのHEPESを秤量し、溶液混合物中に完全に溶解させる。
   5. 撹拌しながらCaCl ₂ストック（2.5mM = 100mMの12.5mL）を添加する。
   6. 最終体積の99％を追加します。
   7. NaOHまたはHClを用いてpHを7.4に調整する。
   8. 浸透圧を確認し、必要に応じて5M NaClまたはグルコースを用いて調整する。
   9. シリンダー中でddH ₂ Oを500mLの最終容量に加える。
3. マイクロピペット内部溶液の調製（低EGTA K ⁺ベースの溶液）
   1. 所望の最終容量および濃度に従って、各ストックからの正しい量の試薬を計量またはピペットで採取する（ 例えば 、50mLの低EGTA K ⁺ベースの細胞内溶液を約30mLの容量に調製するため）ddH ₂ O：100mM K-グルコン酸= 1.17g; 35mM KCl = 1M 1.75mL; 2mM MgCl ₂ = 1mL100mMの濃度; 0.1mMのEGTA = 0.05mLの100mM; 10mM HEPES = 0.072g。
   2. 〜95％の最終容量に十分な水を加え、溶液を室温で平衡させる。ソリューションがクリアであることを確認します。
   3. 溶液を絶えず攪拌しながら、KOHを用いてpHを7.2に調整する。
   4. 0.078gのMg-ATPを秤量し、完全に溶解するまで溶液に加える。
   5. 溶液を氷上に置き、浸透圧の測定に少量のアリコートを用いる。典型的には、溶液は〜290mOsmolを測定し、調整する必要はない。オスモル濃度が280-295mOsmolと著しく異なる場合は、新しい解決法を用意する。
   6. 最終容量にddH ₂ Oを加える。
   7. 溶液を500μLアリコートに分け、0.2μmシリンジフィルターでろ過し、密封して直ちに-20℃以下で保存します。
   8. パッチクランプ実験の日付に、細胞内溶液の1つのアリコートを氷上で解凍し、パッチクランプ実験中に冷却したままにする。劣化を防ぐ。
4. パッチピペットをガラス製の毛細管から引き出し（ピペットプラーユーザーズマニュアルに従ってください）、細胞内溶液で満たされたときに5-10Mの抵抗を有するマイクロピペットサイズを得る。

4.パッチクランプ実験のセットアップと細胞による全細胞構成の確立

1. パッチクランプ実験のセットアップ
   1. パッチクランプセットアップ（コンピュータ、コンピュータ制御アンプ、デジタイザなど ）の電源を入れます。
   2. パッチクランプソフトウェア（ 例えば、 AXON pCLAMP10またはHEKA PatchMaster）を開き、電気生理学的記録のためのプロトコールを設定する。信号のフィルタを1~3 kHzでローパス、デジタイザを10~20 kHzに設定します。
   3. カメラ、マイクロマニピュレータ、光源の電源を入れます。
   4. コンピュータ制御アンプがオンになっているときは、接地されたパッチクランプリグを手で触れて実験者の身体を接地し、感電から保護するために、ヘッドステージに触れる前に。
   5. ガラスカバースリップ上の培養上皮細胞を、室温で〜1mLの標準PSSで満たされた記録チャンバーに移す。パッチクランプ実験の前に、入浴PSSをピペットで少なくとも2回慎重に交換してください。
      注記：必要に応じて、計画された実験に従って標準PSSまたは別の外部ソリューションで潅流システムを満たします。パッチクランプ実験を開始する前に、顕微鏡マウントされた記録チャンバー（RC-26GまたはRC-26GLP）を〜2mL /分の速度で数回PSSで灌流する。灌流システムに沿って気泡が閉じ込められていないことを確認します。
   6. 差動干渉コントラスト光学系を備えた10倍および40倍対物レンズを使用して、倒立顕微鏡下で細胞を表示および選択する。大きな単一の単離された細胞を記録のために探す。単離された精巣上皮細胞を、球状の粗いmで同定する膜の一端にあるミクロビリと細胞内の内容物の分極分布（ 図1 ）。
   7. 1 mLシリンジ（自家製の非金属マイクロシリンジ針）を使用して、マイクロピペットに内部溶液（低EGTA K ⁺ベースの溶液、ステップ3.3を参照）を充填する。マイクロピペットに気泡がないことを確認し、マイクロピペットの抵抗を高めることができます。内部溶液がマイクロピペットホルダー内の塩化物被覆銀ワイヤー電極を浸漬するのに十分な溶液を使用する。
   8. マイクロピペットを電極ホルダーに取り付け、低正圧（〜0.2 mLシリンジ容量）をかけます。後のステップで細胞膜に触れるまで、低陽性の圧力を続けてください。
2. 録音用のセルで全セル構成を確立する
   1. ピペットをマイクロマニピュレーターの最高速度の浴溶液に浸します。ピペットを見つけるデジタルカメラに接続された画面の先端。マイクロマニピュレータの速度を中速モードにまで遅くします。
   2. 迅速にコンピュータ制御増幅器から発生する電圧ステップ（ 例えば 100ミリ秒5 MV）を適用することによって、データ収集インターフェースコマンド（軸索システムにおいて、例えば 「膜テスト」）を用いてマイクロピペットの抵抗（5-10MΩ）を確認。抵抗がこの範囲外に大きくなると、新しいマイクロピペットに変更してください。
   3. 顕微鏡に取り付けられた対物レンズを下ろし始めます。徐々にマイクロピペットを選択された細胞の方に導く。マイクロピペットが選択されたセルの中心面の上に来るまで、常に目的を下げてから、マイクロピペットを焦点面に下ろします。
   4. ソフトウェアのコマンダーインターフェースで「ピペットオフセット」コマンドを使用して、ピペットと浴の溶液間の液体接合電位をゼロに戻します。
   5. コンピュータ制御のアンプを設定する電圧クランプおよび膜試験から「バス」モードに移行する。
   6. 細胞のより明瞭な視野のために細かい焦点を合わせ、その後、低中速でマイクロマニピュレーターを用いて徐々にマイクロピペットを下げる。
   7. マイクロピペットが細胞に近接しているとき（メンブレン試験コマンドによってトリガーされたときに電流が減少することにより示される）、すぐに低陽性圧力を除去し、弱い負圧（0.1mLシリンジ容量）を適用して、 。
   8. メンブレンテストで抵抗を監視する。抵抗が500MΩ以上で1GΩ未満の場合は、負の電位（通常は-60 mVに設定された保持電位）を印加します。これはギガシールの形成を助けます。マイクロピペットの過渡的な容量性電流を補償する。
   9. シールが> 1GΩ以上で安定している場合（ソフトウェアインタフェースで示されているように）、細胞膜を破壊するために短時間で強く吸引してください。あなたのために補償を適用しないでください抵抗とセル容量を低減します。
   10. 成功した全細胞構成を達成した直後に、-60mVの保持電位から10mV過分極段階（最小時間間隔、20ms持続時間、20kHzでのシグナルサンプル）を適用する。
   11. 電圧モードをゼロ電流モードに切り替え、ソフトウェアインターフェースからの読み取り値をマークするか、または細胞の膜電位測定値のギャップフリー記録（10-60秒）を実行します。
   12. 電圧モードに素早く戻って電圧モードを維持し、計画された実験に従って電圧プロトコルを適用し、現在の応答を測定します。減算は、記録中に本来のリーク電流に適用されません。
   13. 記録中の応答の安定性、または細胞の異なるパラメータを監視する。たとえば、「膜試験」コマンドインターフェイスを使用して、入力抵抗（R _i ）、直列抵抗（R _s ）およびセルプロトコールの切り替え中の「細胞」モードでの膜試験における膜容量（C _m ）。
       注：入力抵抗の急激な低下は、通常、緩いパッチを示し、直列抵抗の劇的な増加は、細胞内小器官または膜断片によるマイクロピペット先端の目詰まりを示し得る。記録中、マイクロピペットの位置を定期的に監視して、ドリフトが発生しているかどうかを確認します。これにより、パッチが失われる可能性があります。ドリフトが問題の場合は、マイクロピペットとパッチニングセルを一緒に持ち上げて、記録チャンバーの底から離してください。このステップでは、パッチが失われることがあります。この場合、セル全体のパッチクランプ手順を繰り返す必要があります。

5.細胞の受動電気生理学的性質の分析

1. パッチクランプ実験からデータを得た後、Clampfitソフトウェアで空隙のないデータを開き、平均を測定する各細胞の休止膜電位の値。あるいは、現在のモードでゼロ電流電圧から下げた値を使用してください。液体接合電位（この研究では12.4mV）で値を補正する。
2. 式などを用いて、入力抵抗（R _i）を 、細胞から得られた10-mVの過分極工程（ΔV）からデータを開く（ΔIは _ステップ ）の前、ステップ中の電流の差を測定し、計算します。
   
3. セル容量（C _m 、pF単位）を計算する（電圧ステップ・トリガで発生した最初の過渡減衰電流の間の膜コンデンサ電流の下の合計面積を積分することにより、10mV過分極ステップからの同じ電流データを使用する）。細胞の総蓄積電荷（pA・ms単位のQ）の値を得る。次の式を使用します。
   
4. 10mVの負のステップからの初期過渡電流を標準指数アルゴリズムでフィッティングして時定数減衰電流（ T 、単位はms）を得ることによって、各セル_の直列抵抗（R _s ）の値を計算し、次の方程式：
   

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結果

ラットカウダの精巣上体から上皮細胞を単離するための説明酵素消化手順は、我々の以前の研究^9、12から修正されたプロトコルです。この方法は、90％以上の生存率を有し、表面ブリスターまたは膨潤した細胞容積のない単一細胞の混合物を産生する。我々は以前に^1を記載しているように異種細胞混合物?...

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ディスカッション

このプロトコルにおいて、ラット尾部精巣上体の酵素的分散は、一貫して健常な上皮細胞を産生した。パッチクランプ実験のための副睾丸上皮細胞の質は、プロトコルのいくつかの重要なステップに依存する。例えば、低遠心力（30×g）での細胞混合物の遠心分離は、精子および精巣上体内腔の内容物を除去するために重要である。精巣上体細胞は、細胞培養中の精子の存在下では不健康に?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument of AXON system
Computer controlled amplifier	Molecular Devices - Axon	Multiclamp 700B patch-clamp amplifier
Digital Acquisition system	Molecular Devices - Axon	Digidata 1550 converter
Microscope	Olympus	BX-61WI
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Recording chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-324C
Instrument of HEKA system
Patch Clamp amplifier	Harvard Bioscience - HEKA	EPC-10 USB double
Microscope	Olympus	IX73
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Recording chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-324C
Other Instrument
Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-1000
Recording Chamber	Warner Instruments	RC-26G or homemade chamber
Borosilicate capillary glass with filament	Sutter Instrument / Harvard Apparatus	BF150-86-10
Vibration isolation table	TMC	63544
Digital Camare	HAMAMASTU	ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
Reagents for isolation
RPMI 1640 medium	Gibco	22400089
Penicillin/Streptomycin	Gibca	15140112
IMDM	ATCC	30-2005
IMDM	Gibco	C12440500BT
Collagenase I	Sigma	C0130
Collagenase II	Sigma	C6885
5-α-dihydrotestosterone	Medchemexpress	HY-A0120
Fetal bovine serum	capricorn	FBS-12A
Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM	Sigma/various	V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM	Sigma/various	M2393
EGTA, 0.1mM	Sigma/various	E4378
HEPES, 10mM	Sigma/various	V900477
K-gluconate, 100mM	Sigma/various	P-1847
Mg-ATP, 3mM	Sigma/Various	A9187
The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM	Sigma/various	V900058
KCl, 4.7mM	Sigma/various	V900068
CaCl2, 2.5mM	Sigma/various	V900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mM	Sigma/various	M2393
NaH2PO4, 1.2mM	Sigma/various	V900060
HEPES, 10mM	Sigma/various	V900477
Glucose, 10mM	Sigma/various	V900392
For pH adjustment
NaOH	Sigma/various	V900797	Purity >=97%
KOH	Sigma/various	60371	Purity >=99.99%