Gravação de grampos-grampo de células inteiras de células epiteliais primárias isoladas do epidídimo

Resumo

Apresentamos um protocolo que combina o isolamento celular e a gravação de grampos-grampos de células inteiras para medir as propriedades elétricas das células epiteliais dissociadas primárias dos epidídimos da cauda do rato. Este protocolo permite a investigação das propriedades funcionais das células epiteliais primárias epidídmicas para elucidar ainda mais o papel fisiológico do epidídimo.

Resumo

O epidídimo é um órgão essencial para a maturação do esperma e a saúde reprodutiva. O epitélio epididimétrico consiste em tipos de células intrinsecamente conectados que são distintos, não apenas em características moleculares e morfológicas, mas também em propriedades fisiológicas. Essas diferenças refletem suas diversas funções, que juntos estabelecem o microambiente necessário para o desenvolvimento do esperma pós-testicular no lúmen epidídimo. A compreensão das propriedades biofísicas das células epiteliais epididimais é fundamental para revelar suas funções no esperma e na saúde reprodutiva, em condições fisiológicas e fisiopatológicas. Embora suas propriedades funcionais ainda não tenham sido totalmente elucidadas, as células epiteliais epididimais podem ser estudadas usando a técnica de patch-clamp, uma ferramenta para medir os eventos celulares e as propriedades da membrana de células isoladas. Aqui, descrevemos os métodos de isolamento celular e gravação de grampos-grampos de células inteiras para meaCom certeza as propriedades elétricas das células epiteliais dissociadas primárias dos epidídimos da cauda do rato.

Introdução

O epidídimo no trato reprodutivo masculino é um órgão alinhado com uma camada de células epiteliais de mosaico. Como em outros tecidos epiteliais, os vários tipos de células do epitélio epidídmico, incluindo células principais, células claras, células basais e células dos sistemas imunológico e linfático, trabalham de forma concertada para funcionar como a barreira na linha de frente do túnete e como a Células de suporte para a maturação do esperma e fisiologia ^{1 , 2 , 3} . Assim, essas células epiteliais desempenham um papel essencial na saúde reprodutiva.

As células epiteliais são geralmente consideradas como células não excitáveis ​​que são incapazes de gerar potenciais de ação tudo-ou-nenhum em resposta a estímulos despolarizantes, devido à falta de canais de Na ⁺ ou Ca ^{2+ com} tensão ^{gaseada 4 , 5} . No entanto, células epiteliais expressam uniQue conjuntos de canais iônicos e transportadores que regulam seus papéis fisiológicos especializados, como secreção e transporte de nutrientes ⁶ . Diferentes células epiteliais, portanto, possuem propriedades elétricas características. Por exemplo, as células principais expressam o CFTR para o transporte de fluidos e cloretos e expressam o TRPV6 para a reabsorção de cálcio, enquanto que as células claras expressam a V-ATPase da bomba de protões para a acidificação luminal ^{1 , 7 , 8 , 9} . Alguns transportadores e canais iónicos que regulam as características fisiológicas das células epiteliais epididimais têm sido relatados, mas as propriedades funcionais das células epiteliais epididimais ainda não foram ainda compreendidas ^{10 , 11 , 12 , 13} .

WhA gravação de grampos e grampos de células oleicas é uma técnica bem estabelecida para examinar as propriedades intrínsecas de ambas as células excitáveis ​​e não excitantes e é particularmente útil para estudar as funções de células primariamente dissociadas em amostras de células heterogêneas; A tensão-braçadeira é usada para medir as propriedades da membrana passiva e as correntes iónicas de células simples ^{14 , 15} . As propriedades da membrana passiva incluem resistência de entrada e capacitância. O parâmetro anterior indica a condutância da membrana intrínseca, enquanto a última implica a área superficial da membrana celular (uma bicamada de fosfolipídios, onde se localizam os canais iónicos e os transportadores, que serve como um isolador fino que separa a mídia extracelular e intracelular). A capacitância da membrana é diretamente proporcional à superfície da membrana celular. Juntamente com a resistência da membrana que é refletida pela resistência de entrada, a constante de tempo da membrana, wO que indica quão rápido o potencial da membrana celular responde ao fluxo de correntes dos canais iónicos, pode ser determinado. A este respeito, ao combinar as características de resposta atuais de uma série de etapas de tensão aplicadas às células, a cinética biofísica e as propriedades das células são determinadas ^{15 , 16 , 17 , 18} .

No presente trabalho, descrevemos os procedimentos para isolar células epiteliais do epidídimo de cauda de rato e os passos para medir as propriedades da membrana de diferentes tipos de células na mistura de células dissociadas usando o grampo de grampo inteiro. Mostramos que as células principais epididimais apresentam propriedades eletrofisiológicas da membrana distintas e que as condutas podem ser facilmente identificadas a partir de outros tipos de células.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais são realizados de acordo com as diretrizes do Comitê de Uso e Cuidados de Animais Institucionais da Universidade Shanghai-Tech, que cumprem os requisitos locais e internacionais.

1. Animais experimentais

1. Use ratos Sprague-Dawley machos adultos (~ 300-450 g) entre 8 a 12 semanas de idade. A esta idade nos ratos, o esperma chegou aos epidídimos da cauda.

2. Isolamento de células epiteliais de Epididímides de Cauda de Rato

NOTA: As seguintes etapas são realizadas em condições não assépticas, salvo indicação em contrário.

1. Preparação de instrumentos de dissecação e reagentes
   1. Desinfecte as ferramentas de dissecação por imersão em etanol a 70% e deixe secar ao ar.
   2. Ligue o banho de aquecimento (32 ° C); Preparar e pré-aquecer 500 mL de 1x Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI) suplementado com 1% (v / v) de antibióticoTiques (100 U / mL de penicilina e 100 μg / mL de final de estreptomicina) e rotulados como "RPMI (+ P / S 1: 100)". Execute esta etapa em uma estação de trabalho controlada por fluxo de ar limpo.
   3. Preparar e pré-aquecer 1x 500 mL de Meio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM) contendo aminoácidos não essenciais (0,1 mM) e piruvato de sódio (1 mM) e suplementado com 5-a-di-hidrotestosterona (1 nM), 10% de bovino fetal Soro, antibióticos a 1% (v / v) (100 U / mL de penicilina e 100 μg / mL de final de estreptomicina) e rotulados como "IMDM completo". Crie alíquotas de 50 mL e selar com parafilme; Armazenar a 4 ° C. Use condições assépticas.
   4. Prepare uma solução de digestão com enzimas colagenase dissolvendo colagenase tipo I e colagenase Tipo II em RPMI (+ P / S 1: 100) resultando em 1 mg / mL de cada colagenase na solução. Filtra através de uma membrana de 0,22 μm e marca como "Solução de colagenasa". Mantenha a temperatura ambiente (RT) até o uso. Ajustar o volume da solução enzimática com baseSobre o peso da enzima; O volume mínimo necessário para ambos os epidídimos de cauda de um único rato é de 2 mL.
   5. Preencha um prato de 35 mm com RPMI (+ P / S 1: 100).
2. Dissecção de epidídimos de cauda de ratos
   1. Sacrifique o animal usando o pentobarbital de sódio 85 mg / kg ip ou usando uma câmara de isoflurano até que o animal não responda à estimulação da compressão da cauda; Acompanhar a deslocação cervical.
   2. Desinfecte a parte inferior do abdômen limpando com 70% de etanol, empurre os dois testículos para baixo até o abdômen e, em seguida, abra a parte inferior do abdômen perto do escroto.
   3. Pegue a gordura epidídima, disseca todos os órgãos reprodutivos (testículos, epidídimas e deferentes) e mergulhe no prato com RPMI (+ P / S 1: 100).
   4. Transfira os órgãos reprodutores no prato com RPMI (+ P / S 1: 100) para uma estação de trabalho asséptica.
   5. Disse os epidídimos da cauda dos tecidos conectivos e gordurosos e do epiCápsula didymal. Coloque um epidídimo com ~ 0,2 mL de solução de colagenaçao em um tubo de 1,5 mL. Aperte este passo em uma estação de trabalho controlada por fluxo de ar limpo.
3. Dissociação de células únicas de epidídimos de cauda de rato
   1. Corte os epidídimos na Solução de Collagenase usando tesouras finas até o tecido se tornar um fluido semelhante a pasta. Enxágüe a tesoura suavemente com o resto da solução de enzima (~ 0,8 mL) no tubo de 1,5 mL.
   2. Coloque o tubo em um termomixer de metal durante 30 min a 37 ° C com uma velocidade de agitação de 1.000 rpm.
   3. Centrifugar a mistura de enzimas e tecidos a 30 xg à TA por 3 min e decantar o sobrenadante pegajoso que contém principalmente o esperma.
   4. Ressuspender o sedimento em 1 mL de IMDM completo para apagar toda a atividade enzimática. Transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mL contendo 49 mL de RPMI (+ P / S 1: 100).
      NOTA: Opcionalmente, filtre a suspensão celular através de uma membrana de malha de 100 μm com triturat constantePara evitar grandes agregados celulares. No entanto, não use um filtro de malha se a suspensão celular for necessária para o crescimento de células monocamadas.
   5. Centrifugar a mistura celular a 30 xg à TA por 10 min; Decanta o sobrenadante.
   6. Ressuspender o sedimento em 1 ml de IMDM completo com trituração suave durante pelo menos 5 minutos para dissociar células únicas das misturas de tecido epidídmico tratado enzimáticamente.
4. Separação de células epiteliais de outras células em condições assépticas
   1. Cultive a suspensão celular em uma placa de Petri de 10 cm contendo Full-IMDM durante pelo menos 8 h ou durante a noite, em uma incubadora a 32 ° C em 5% de CO ₂ .
   2. Prepare lamínulas esterilizadas com antecedência por imersão em 100% de álcool. Ar seco e mergulhar em um pequeno volume do meio de cultura. Coloque os lamínulas em pratos de cultura de 6 cm ou em poços simples de uma placa de 24 poços.
   3. Na manhã seguinte, colhe as células epiteliais dissociadas coletando suavemente o suspen celularA partir da placa de Petri, que consiste principalmente em células epiteliais. Centrifugar a suspensão celular a 30 xg à TA por 5 min, e depois decantar o sobrenadante.
   4. Ressuspender o sedimento celular em ~ 2 mL Full-IMDM.
   5. Semear 0,2 mL da suspensão de células colhidas no centro de cada lamínula esterilizada.
   6. Deixe a suspensão celular se depositar na gota de líquido durante pelo menos 10 minutos para permitir que as células aderem vagamente aos lamínulas de vidro. Adicione com cuidado 1 ml de IMDM completo na ponta de 10 cm de prato ou 0,3 mL de IMDM completo em cada poço de uma placa de 24 poços; Não perturbe células.
   7. Mantenha as células solteiras isoladas em lamínulas na incubadora a 32 ° C em 5% de CO ₂ até as experiências de patch-clamp.

3. Soluções de gravação e micropipetas

NOTA: Para as experiências de patch-clamp, use produtos químicos e soluções de melhor qualidade.

1. Preparação de soluções de estoque
   1. Autoclave todas as garrafas para armazenamento de estoque e filtre todas as soluções de estoque (exceto as soluções corrosivas) e filtre através de membranas de 0,22 μm antes de usar.
   2. Prepare todas as soluções de estoque antecipadamente na RT e armazene a 4 ^o C: NaCl 5 M; 1 M KCl; 100 mM de MgCl _2; 100 mM de CaCl _2; 200 mM de NaH ₂ PO _4; EGTA 100 mM (pH 7,0 com KOH). Manusear 5 M NaOH, 1 M HCl e 1 M KOH como soluções corrosivas.
2. Preparação de solução de sal fisiológica de registro externo padrão (PSS)
   1. Aqueça as soluções de estoque para a RT na manhã da gravação do patch-clamp.
   2. Pipetar os ingredientes a partir de cada unidade de acordo com o volume final desejado, com excepção de _CaCl2, por exemplo, para a preparação de 500 mL de PSS: NaCl a 140 mM = 14 mL de 5M; KCl 5 mM = 2,5 mL de 1M; 1,2 mM de MgCl ₂ = 6 ml de 100 mM; 1,2 mM de NaH ₂ PO ₄ = 3 mL de 200 mM.
   3. Adicionar o dobro- água destilada (ddH ₂ O) até o volume final de 400 mL e equilibrar.
   4. Pesar 0,9 g de glicose e 1,19 g de HEPES e dissolver completamente na mistura de solução.
   5. Adicionar o estoque de _CaCl2 (2,5 mM = 12,5 mL de 100 mM) com agitação.
   6. Adicione até 99% do volume final.
   7. Ajuste o pH para 7,4 utilizando NaOH ou HCl.
   8. Verifique a osmolaridade e ajuste usando NaCl 5 M ou glicose, se necessário.
   9. Adicione ddH ₂ O ao volume final de 500 mL em um cilindro.
3. Preparação de soluções internas de micropipetas (baixas soluções baseadas em EGTA K ⁺ )
   1. Pesar ou pipetar o volume correto dos reagentes de cada estoque de acordo com o volume e a concentração final desejados, por exemplo , para preparar 50 mL de solução intracelular baixa em EGTA K ⁺ com um volume de ~ 30 mL de ddH ₂ O: K-gluconato de 100 mM = 1,17 g; KCl 35 mM = 1,75 mL de 1 M; 2 mM de MgCl ₂ = 1 mLDe 100 mM; EGTA 0,1 mM = 0,05 mL de 100 mM; HEPES 10 mM = 0,072 g.
   2. Adicione água suficiente para ~ 95% do volume final e permita que a solução se equilibre na RT. Certifique-se de que a solução está clara.
   3. Ao mexer constantemente a solução, ajuste o pH para 7,2 usando KOH.
   4. Pesar e adicionar 0,078 g de Mg-ATP à solução até que seja completamente dissolvido.
   5. Coloque a solução no gelo e use uma pequena alíquota para medir a osmolaridade; Tipicamente, as soluções medem ~ 290 mOsmol e não precisam de ajuste. Se a osmolaridade difere significativamente de 280-295 mOsmol, prepare uma nova solução.
   6. Adicione ddH ₂ O ao volume final.
   7. Divida a solução em alíquotas de 500 μL, filtre com um filtro de seringa de 0,2 μm, feche e feche imediatamente a ≤ -20 ° C.
   8. Na data do experimento de patch-clamp, descongelar uma alíquota de solução intracelular no gelo e manter a temperatura ambiente durante o experimento de patch-clamp paraEvitar a degradação.
4. Puxe as pipetas de remendo dos capilares de vidro (seguindo o manual do usuário do extrator de pipeta) para obter tamanhos de micropipetas com resistência de 5-10 M quando preenchidos com solução intracelular.

4. Configurando o Patch-Clamp Experiment e estabelecendo a configuração de células inteiras com células

1. Configurando o experimento de patch-clamp
   1. Ligue a configuração do patch-clamp (computador, amplificador controlado por computador, digitalizador, etc. )
   2. Abra o software patch-clamp ( por exemplo, AXON pCLAMP10 ou HEKA PatchMaster) e configure os protocolos para gravações eletrofisiológicas. Defina o filtro para o sinal passar baixo a 1-3 kHz e o digitalizador a 10-20 kHz.
   3. Ligue a câmera, micromanipulador e fonte de luz.
   4. Quando o amplificador controlado pelo computador está ligado, aplique o corpo do experimentador tocando com as mãos o equipamento de grampos e grampos que foi aterrado,Antes de tocar o headstage, para protegê-lo de choques elétricos.
   5. Transfira as células epiteliais de cultura no lamínula de vidro para a câmara de gravação preenchida com ~ 1 mL de PSS padrão à RT. Altere cuidadosamente o PSS de banho pelo menos duas vezes usando uma pipeta antes de qualquer experimento de patch-clamp.
      NOTA: Opcionalmente, preencha o sistema de perfusão com PSS padrão ou outra solução externa de acordo com a experiência planejada. Perfogue a câmara de gravação montada no microscópio (RC-26G ou RC-26GLP) com PSS algumas vezes a uma velocidade de ~ 2 mL / min antes do início das experiências de patch-clamp. Certifique-se de que não há bolhas de ar presas ao longo do sistema de perfusão.
   6. Visualize e selecione as células sob um microscópio invertido com objetivos 10X e 40X equipados com um sistema óptico de contraste de interferência diferencial. Procure grandes células isoladas isoladas para gravação. Identificar as células epiteliais epididimais isoladas por sua forma esférica com m ásperoIcrovilli em uma extremidade das membranas e distribuição polarizada de conteúdo intracelular ( Figura 1 ).
   7. Usando uma seringa de 1 mL (uma agulha de microondas não metálicas), preencha uma micropipeta com a solução interna (solução baixa baseada em EGTA K ⁺ , ver passo 3.3). Certifique-se de que não há bolhas de ar na micropipeta, o que pode aumentar a resistência da micropipeta. Use solução suficiente para que a solução interna submerja o eletrodo de arame de prata revestido com cloreto dentro do suporte de micropipetas.
   8. Monte a micropipleta no suporte do eletrodo e aplique uma baixa pressão positiva (volume de seringa de 0,2 mL). Mantenha a pressão positiva baixa contínua até tocar a membrana celular nas etapas posteriores.
2. Estabelecendo configuração de células inteiras com células para gravações
   1. Mergulhe a pipeta na solução do banho à velocidade máxima do micromanipulador. Encontre a pipetaDica na tela conectada à câmera digital; Desacelere a velocidade do micromanipulador para o modo médio-alto.
   2. Verifique rapidamente a resistência da micropipleta (5-10 MΩ) usando o comando da interface de aquisição de dados ( por exemplo, "Teste de Membrana" no sistema AXON), aplicando um passo de tensão ( por exemplo, 5 mV por 100 ms) gerado a partir do amplificador controlado por computador. Mude para uma nova micropipeta se a resistência estiver significativamente fora desse intervalo.
   3. Comece a deslocar o objetivo montado no microscópio; Guie gradualmente a micropipeta em direção à célula selecionada. Abaixe sempre o objetivo primeiro e, em seguida, abaixe a micropipeta para o plano de foco, até que a micropipeta esteja acima da superfície central da célula selecionada.
   4. Cancelar o potencial de junção de líquido entre as soluções de pipeta e banho para zero usando o comando "Pipette offset" na interface de comando do software.
   5. Defina o comando amplificador controlado por computadorE para a tensão-braçadeira e a prova de membrana para o modo "Banho".
   6. Foco para uma visão mais clara da célula, depois baixe gradualmente a micropipeta usando o micromanipulador na velocidade baixa-média.
   7. Quando a micropipeta está próxima da célula (demonstrada por uma corrente diminuída quando acionada pelo comando de teste da membrana), remova a pressão positiva baixa imediatamente e aplique uma pressão negativa fraca (0,1 mL de volume da seringa) para formar o gigaseal (> 1 GΩ) .
   8. Monitorize a resistência com o teste de membrana. Se a resistência for> 500 MΩ, mas <1 GΩ, aplique um potencial negativo (geralmente como o potencial de retenção definido para -60 mV), que pode ajudar a formar o gigaseal. Compensar a corrente capacitiva transitória da micropipeta.
   9. Se a vedação for> 1 GΩ e estável (como mostrado na interface do software), aplique uma sucção breve e forte para quebrar a membrana celular. Não aplique uma compensação pelo seE a capacitância celular.
   10. Imediatamente após alcançar uma configuração bem sucedida de células inteiras, aplique um passo de hiperpolarização de 10 mV (5 traços com intervalos de tempo mínimos, 20 ms de duração, amostra de sinal a 20 kHz) a partir de um potencial de espera de -60 mV.
   11. Mude o modo de tensão para o modo de corrente zero e marque as leituras da interface do software ou execute uma gravação sem espaço (10-60 s) para as leituras de potencial da membrana da célula.
   12. Volte rapidamente e permaneça no modo de tensão e aplique os protocolos de tensão de acordo com as experiências planejadas e mire as respostas atuais. A subtração não é aplicada à corrente de vazamento intrínseca durante as gravações.
   13. Monitorize a estabilidade das respostas durante as gravações ou os diferentes parâmetros da célula. Por exemplo, use a interface de comando "Membrane Test" para verificar a resistência de entrada (R _i ), a resistência da série (R _s ) e a célulaCapacitância de membrana (C _m ) no teste de membrana no modo "Celda" durante a troca de protocolos.
       NOTA: gotas súbitas na resistência de entrada são geralmente indicativas de um remendo solto, e um aumento dramático na resistência da série pode ser indicativo de obstrução da ponta da micropipeta pelas organelas intracelulares ou fragmentos de membrana. Durante a gravação, monitore regularmente o local da micropipette para verificar se ocorre a deriva, o que pode levar à perda do patch. Se a deriva for um problema, levante cuidadosamente a micropipeta e a célula de remendo longe da parte inferior da câmara de gravação. Este passo às vezes pode levar à perda do patch, caso em que é necessário repetir o procedimento de grampo-grampo de células inteiras.

5. Análise das propriedades eletrofisiológicas passivas das células

1. Depois de obter os dados das experiências de patch-clamp, abra os dados livres de lacunas no software Clampfit e mire a médiaValor para o potencial de membrana em repouso para cada célula. Alternativamente, use o valor como marcado para baixo a partir da tensão de corrente zero no modo atual. Corrija os valores com potencial de junção líquida (12,4 mV neste estudo).
2. Abra os dados a partir do passo hiperpolarizante 10-mV (? V) obtido a partir de uma célula, medir a diferença de corrente antes e durante o passo (Δ eu _passo), e calcular a resistência de entrada (R _i) utilizando a equação como:
   
3. Calcule a capacitância da célula (C _m , na unidade de pF) (use os mesmos dados atuais do passo de hiperpolarização de 10 mV integrando a área total sob a corrente do capacitor de membrana durante a corrente de decaimento do transiente inicial levantada sobre o gatilho da etapa de tensão) Para obter o valor da carga total acumulada (Q, na unidade de pA • ms) da célula. Use a seguinte equação:
   
4. Calcule o valor da resistência da série (R _s ) para cada célula ajustando a corrente transitória inicial do passo negativo de 10 mV com um algoritmo exponencial padrão para obter a corrente de decaimento da constante de tempo ( T , na unidade de ms) e use a Seguinte equação:
   

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Resultados

O procedimento de digestão enzimática descrito para o isolamento de células epiteliais dos epidídimos de cauda de rato é um protocolo modificado de nossos estudos anteriores ^{9 , 12} . Este método produz uma mistura de células individuais com mais de 90% de viabilidade e sem bolhas de superfície ou volume de células inchadas. A mistura celular heterogênea consiste principalmente de células principais, células claras e c...

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Discussão

Neste protocolo, a dispersão enzimática dos epidídimos de cauda de ratos produziu consistentemente células epiteliais saudáveis. A qualidade das células epiteliais epidídmicas para as experiências de grampos e grampo depende de alguns passos críticos no protocolo. Por exemplo, a centrifugação da mistura celular com baixa força centrífuga (30 xg) é importante para remover os espermatozóides e o conteúdo luminal epidídmico; As células epiteliais epididimais tornam-se pouco saudáveis ​​na presença d...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument of AXON system
Computer controlled amplifier	Molecular Devices - Axon	Multiclamp 700B patch-clamp amplifier
Digital Acquisition system	Molecular Devices - Axon	Digidata 1550 converter
Microscope	Olympus	BX-61WI
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Recording chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-324C
Instrument of HEKA system
Patch Clamp amplifier	Harvard Bioscience - HEKA	EPC-10 USB double
Microscope	Olympus	IX73
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Recording chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-324C
Other Instrument
Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-1000
Recording Chamber	Warner Instruments	RC-26G or homemade chamber
Borosilicate capillary glass with filament	Sutter Instrument / Harvard Apparatus	BF150-86-10
Vibration isolation table	TMC	63544
Digital Camare	HAMAMASTU	ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
Reagents for isolation
RPMI 1640 medium	Gibco	22400089
Penicillin/Streptomycin	Gibca	15140112
IMDM	ATCC	30-2005
IMDM	Gibco	C12440500BT
Collagenase I	Sigma	C0130
Collagenase II	Sigma	C6885
5-α-dihydrotestosterone	Medchemexpress	HY-A0120
Fetal bovine serum	capricorn	FBS-12A
Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM	Sigma/various	V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM	Sigma/various	M2393
EGTA, 0.1mM	Sigma/various	E4378
HEPES, 10mM	Sigma/various	V900477
K-gluconate, 100mM	Sigma/various	P-1847
Mg-ATP, 3mM	Sigma/Various	A9187
The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM	Sigma/various	V900058
KCl, 4.7mM	Sigma/various	V900068
CaCl2, 2.5mM	Sigma/various	V900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mM	Sigma/various	M2393
NaH2PO4, 1.2mM	Sigma/various	V900060
HEPES, 10mM	Sigma/various	V900477
Glucose, 10mM	Sigma/various	V900392
For pH adjustment
NaOH	Sigma/various	V900797	Purity >=97%
KOH	Sigma/various	60371	Purity >=99.99%