Registrazioni Patch-clamp intere cellule delle cellule epiteliali primarie isolate dall'epididimo

Riepilogo

Presentiamo un protocollo che combina l'isolamento delle cellule e la registrazione delle patch-clamp a cellule intere per misurare le proprietà elettriche delle cellule epiteliali primarie dissociate dagli epididimidi di cauda di cauda. Questo protocollo consente di indagare le proprietà funzionali delle cellule epitidimali epididimali primarie per illustrare ulteriormente il ruolo fisiologico dell'epididimo.

Abstract

L'epididimo è un organo essenziale per la maturazione dello sperma e la salute riproduttiva. L'epitelio epididimo è costituito da tipi cellulari connessi intricati e distinti non solo in termini molecolari e morfologici ma anche in proprietà fisiologiche. Queste differenze riflettono le loro diverse funzioni, che insieme stabiliscono il microambiente necessario per lo sviluppo spermatico post-testicolo nel lume epididimale. La comprensione delle proprietà biofisiche delle cellule epitidimali epiteliali è fondamentale per rivelare le loro funzioni nello sperma e nella salute riproduttiva, in condizioni sia fisiologiche che patofisiologiche. Mentre le loro proprietà funzionali devono ancora essere completamente chiarite, le cellule epitidimali epiteliali possono essere studiate usando la tecnica patch-clamp, uno strumento per misurare gli eventi cellulari e le proprietà delle membrane delle singole cellule. Qui descriviamo i metodi di isolamento delle cellule e la registrazione di patch-clamp a cellule intere a meaAssicurare le proprietà elettriche delle cellule epiteliali primarie dissociate dagli epididimidi cauda del caudali.

Introduzione

L'epididimo nel tratto riproduttivo maschile è un organo allineato con uno strato di cellule epiteliali mosaiche. Come in altri tessuti epiteliali, i diversi tipi di cellule dell'epitelio epididimo, comprese le cellule principali, le cellule chiare, le cellule basali e le cellule dei sistemi immunologici e linfatici, funzionano in modo concertato per funzionare come barriera alla linea frontale tubulare e come Sostenere le cellule per la maturazione e la fisiologia dello sperma ^{1 , 2 , 3} . Così, queste cellule epiteliali svolgono un ruolo essenziale nella salute riproduttiva.

Le cellule epiteliali sono generalmente considerate come cellule non eccitabili che non sono in grado di generare potenziali d'azione di tutti o nessuno in risposta a stimoli depolarizzanti, a causa della mancanza di canali Na ⁺ o Ca ^{2+ a} tensione ^{4 , 5} . Tuttavia, le cellule epiteliali esprimono uniQue set di canali ionici e trasportatori che regolano i loro ruoli fisiologici specializzati, come il secreto e il trasporto dei nutrienti ⁶ . Diverse cellule epiteliali quindi possiedono caratteristiche elettriche caratteristiche. Ad esempio, le cellule principali esprimono il CFTR per il trasporto di fluidi e cloruri e esprimono il TRPV6 per il riassorbimento del calcio, mentre le cellule chiare esprimono la pompa protonica V-ATPasi per l'acidificazione lumina ^{1 , 7 , 8 , 9} . Sono stati riportati alcuni trasportatori e canali ionici che regolano le caratteristiche fisiologiche delle cellule epitidimali epiteliali, ma le proprietà funzionali delle cellule epitidimali non sono ancora state ancora comprese ^{10 , 11 , 12 , 13} .

WhLa registrazione di patch-clamp di olea-cell è una tecnica ben consolidata per esaminare le proprietà intrinseche di cellule eccitabili e non-eccitabili ed è particolarmente utile per studiare le funzioni delle cellule principalmente dissociate in campioni di cellule eterogenee; Il morsetto di tensione viene utilizzato per misurare le proprietà passive della membrana e le correnti ioniche delle singole cellule ^{14 , 15} . Le proprietà passive della membrana includono la resistenza di ingresso e la capacità. L'ex parametro indica la conduttanza intrinseca della membrana, mentre quest'ultima implica la superficie della membrana cellulare (un bilayer di fosfolipidi, dove sono posizionati canali ionici e trasportatori), che funge da sottile isolante che separa i media extracellulari e intracellulari). La capacità della membrana è direttamente proporzionale alla superficie della membrana cellulare. Insieme alla resistenza della membrana che si riflette dalla resistenza di ingresso, la costante di tempo della membrana, wChe indica quanto velocemente il potenziale della membrana cellulare risponde al flusso delle correnti del canale ionico, può essere determinato. A questo proposito, combinando le caratteristiche di risposta di corrente da una serie di passi di tensione applicati alle cellule, le cinetiche biofisiche e le proprietà delle cellule sono determinate ^{15 , 16 , 17 , 18} .

Nel presente documento descriviamo le procedure per l'isolamento delle cellule epiteliali dal ratto cauda epididymis e le fasi per misurare le proprietà delle membrane di differenti tipi di cellule nella miscela cellulare dissociata usando il patch-clamp di tutta la cellula. Mostriamo che le cellule principali epididimali presentano proprietà elettrofisiologiche distinte delle membrane e che le conduttanze possono essere facilmente identificate da altri tipi di cellule.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti su animali vengono eseguiti in conformità alle linee guida del comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di ShanghaiTech, che soddisfano i requisiti locali e internazionali.

1. Animali sperimentali

1. Usi i topi Sprague-Dawley maschi adulti (~ 300-450 g) tra i 8-12 settimane. A questa età nei ratti, gli spermatozoi sono arrivati ​​negli epididimidi cauda.

2. Isolamento delle cellule epiteliali da Rat Epididimide di Cauda

NOTA: Le seguenti operazioni vengono eseguite in condizioni non asettiche, salvo diversa indicazione.

1. Preparazione di strumenti di dissezione e reagenti
   1. Disinfettare gli strumenti di dissezione mediante immersione nel 70% di etanolo e lasciarli asciugare all'aria.
   2. Accendere il bagno di riscaldamento (32 ° C); Preparare e pre-riscaldare 500 ml di 1x Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI) integrato con 1% (v / v) antibio(100 U / mL penicillina e 100 μg / mL di streptomicina finale) e etichettato come "RPMI (+ P / S 1: 100)". Eseguire questo passaggio in una stazione di lavoro controllata con aria pulita.
   3. Preparare e preriscaldare 1x 500 mL di Medio Modulato Dulbecco (IMDM) Iscove contenente aminoacidi non essenziali (0,1 mM) e piruvato di sodio (1 mM) e integrato con 5-α-diidrotestosterone (1 nM), 10% di bovini fetali Siero, 1% (v / v) antibiotici (100 U / mL penicillina e 100 μg / mL streptomicina finale) e etichettati come "Full-IMDM". Creare aliquote da 50 ml e sigillare con parafilm; Conservare a 4 ° C. Utilizzare condizioni asettiche.
   4. Preparare una soluzione di digestione dell'enzima di collagenasi sciogliendo collagenasi tipo I e collagenasi tipo II in RPMI (+ P / S 1: 100) ottenendo 1 mg / mL di ciascuna collagenasi nella soluzione. Filtro attraverso una membrana da 0,22 μm e contrassegnata come "Collagenase Solution". Tenere a temperatura ambiente (RT) fino all'uso. Regolare il volume della soluzione enzimatica basataSul peso dell'enzima; Il volume minimo richiesto per entrambi gli epididimidi cauda da un solo ratto è di 2 ml.
   5. Riempire un piatto da 35 mm con RPMI (+ P / S 1: 100).
2. Dissezione di epididimide di cauda di caccia
   1. Sacrificare l'animale usando pentobarbital di sodio 85 mg / kg ip o utilizzando una camera di isoflurano fino a quando l'animale non risponde alla stimolazione a coda; Segui la dislocazione cervicale.
   2. Disinfettare l'addome inferiore pulendo con il 70% di etanolo, spingere delicatamente i due testicoli fino all'addome inferiore e quindi aprire l'addome inferiore vicino allo scroto.
   3. Raccogliere il grasso epididimo, disseccare tutti gli organi riproduttivi (testicoli, epididimidi e vas deferenti) e immergere nel piatto con RPMI (+ P / S 1: 100).
   4. Trasferire gli organi riproduttivi nel piatto con RPMI (+ P / S 1: 100) in una stazione di lavoro asettica.
   5. Disseccare i cauda epididimidi dai tessuti connettivi e grassi e dall'epiaCapsula didimale. Posizionare un'epididima con ~ 0,2 ml di soluzione collagenasi in un tubo da 1,5 ml. Pertanto questo passo in una stazione di lavoro controllata con aria libera.
3. Dissociazione di singole cellule da epididimide di cauda di cauda
   1. Tagliare l'epididimide nella soluzione collagenasi utilizzando forbici fino a quando il tessuto diventa un liquido pasta. Sciacquare delicatamente le forbici con il resto della soluzione enzimatica (~ 0,8 mL) nel tubo da 1,5 mL.
   2. Mettere il tubo su un termomixer metallico per 30 minuti a 37 ° C con una velocità di scatto di 1.000 giri / min.
   3. Centrifugare la miscela di tessuto enzimatico a 30 xg a RT per 3 minuti e decantare il supernatante adesivo che contiene principalmente lo sperma.
   4. Resuspendere il pellet in 1 ml di Full-IMDM per abbattere tutta l'attività enzimatica. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 mL contenente 49 mL RPMI (+ P / S 1: 100).
      NOTA: Facoltativamente, filtrare la sospensione cellulare attraverso una membrana a maglia da 100 μm con triturat costantePer evitare grandi aggregati di cellule. Tuttavia, non utilizzare un filtro a maglia se è necessaria sospensione cellulare per aumentare i monostrati di cellule.
   5. Centrifugare la miscela cellulare a 30 xg a RT per 10 min; Decanta il surnatante.
   6. Resuspendere il pellet in 1 ml di Full-IMDM con triturazione delicata per almeno 5 min per dissociare singole cellule dalle miscele tissutali epididimali trattate enzimatiche.
4. Separazione delle cellule epiteliali da altre cellule in condizioni asettiche
   1. Coltivare la sospensione cellulare su un piatto da 10 cm di Petri contenente Full-IMDM per almeno 8 ore o durante la notte, in un incubatore a 32 ° C in 5% CO ₂ .
   2. Preparare in anticipo le copertine sterili mediante l'immersione in alcool al 100%. Asciugare l'aria e immergere in un piccolo volume del mezzo di coltura. Posizionare le copertine in piatti da 6 cm di coltura o in singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.
   3. La mattina successiva, raccogliere le cellule epiteliali dissociate raccolgendo delicatamente la sospensione cellulareSione dal piatto di Petri, costituito prevalentemente da cellule epiteliali. Centrifugare la sospensione cellulare a 30 xg a RT per 5 min e quindi decantare il surnatante.
   4. Resuspendere il pellet di cellule in ~ 2 mL di Full-IMDM.
   5. Sementa 0,2 ml della sospensione cellulare raccolta al centro di ogni coperchio sterile.
   6. Lasciare che la sospensione cellulare si depositi nella gocce di liquido per almeno 10 minuti per consentire alle cellule di aderire leggermente alle copertine di vetro. Aggiungete con attenzione 1 mL di Full-IMDM al bordo di un piatto da 10 cm o di 0,3 mL di Full-IMDM ad ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti; Non disturbare le celle.
   7. Mantenere le singole cellule isolate sui coperchi in incubatore a 32 ° C in 5% di CO ₂ fino a quando gli esperimenti di patch-clamp.

3. Soluzioni di registrazione e micropipette

NOTA: Per gli esperimenti di patch-clamp, utilizzare le migliori sostanze chimiche e soluzioni di qualità.

1. Preparazione di soluzioni di magazzino
   1. Autoclave tutte le bottiglie per l'immagazzinaggio di magazzino e filtrare tutte le soluzioni di magazzino (ad eccezione delle soluzioni corrosive) e filtrare con membrane da 0,22 μm prima dell'uso.
   2. Preparare in anteprima tutte le soluzioni di magazzino a RT e conservare a 4 ^o C: 5 M NaCl; 1 M KCl; 100 mM MgCl _2; 100 mM CaCl _2; 200 mM NaH ₂ PO ₄ ; 100 mM EGTA (pH 7,0 con KOH). Maneggiare 5 M NaOH, 1 M HCl e 1 M KOH come soluzioni corrosive.
2. Preparazione della soluzione salina fisiologica di registrazione esterna standard (PSS)
   1. Riscaldare le soluzioni di riserva a RT la mattina della registrazione di patch-clamp.
   2. Pipettare l'ingredienti da ogni stock in base al volume finale desiderato, tranne CaCl _2, ad esempio per preparare 500 mL di PSS: 140 mM NaCl = 14 mL di 5M; 5 mM KCl = 2,5 mL di 1 M; 1.2 mM MgCl ₂ = 6 mL di 100 mM; 1,2 mM NaH ₂ PO ₄ = 3 ml di 200 mM.
   3. Aggiungi doppiaacqua -distilled (DDH ₂ O) al volume finale di 400 mL ed equilibrata.
   4. Ponderare 0,9 g di glucosio e 1,19 g di HEPES e sciogliere completamente nella miscela di soluzione.
   5. Aggiungere il titolo CaCl ₂ (2,5 mM = 12,5 ml di 100 mM) con agitazione.
   6. Aggiungi fino al 99% del volume finale.
   7. Regolare il pH a 7,4 utilizzando NaOH o HCl.
   8. Controllare l'osmolarità e regolare usando 5 M NaCl o glucosio, se necessario.
   9. Aggiungere ddH ₂ O al volume finale di 500 mL in un cilindro.
3. Preparazione di soluzioni interne a micropipette (basse soluzioni a base di EGTA K ⁺ )
   1. Pesare o pipettare il corretto volume dei reagenti ciascuno stock in base al volume finale desiderato e concentrazione, ad esempio per preparare 50 mL partire EGTA K ⁺ intracellulare sede soluzione ad un volume di circa 30 mL DDH ₂ O: 100 mM K-gluconato = 1,17 g; 35 mM KCl = 1,75 mL di 1 M; 2 mM MgCl ₂ = 1 mLDi 100 mM; 0,1 mM EGTA = 0,05 mL di 100 mM; 10 mM HEPES = 0,072 g.
   2. Aggiungere abbastanza acqua per ~ 95% del volume finale e permettere alla soluzione di equilibrare a RT. Assicurarsi che la soluzione sia chiara.
   3. Durante la miscelazione continua della soluzione, regolare il pH a 7,2 con KOH.
   4. Pesare e aggiungere 0,078 g di Mg-ATP alla soluzione fino a quando non viene completamente sciolto.
   5. Posizionare la soluzione sul ghiaccio e utilizzare una piccola aliquota per la misura dell'osmolarità; Tipicamente, le soluzioni misura ~ 290 mOsmol e non ha bisogno di aggiustamenti. Se l'osmolarità differisce significativamente da 280-295 mOsmol, preparare una nuova soluzione.
   6. Aggiungere ddH ₂ O al volume finale.
   7. Dividere la soluzione in 500 μL di aliquote, filtrare con un filtro a siringa da 0,2 μm, sigillare e conservare immediatamente a ≤ -20 ° C.
   8. Alla data dell'esperimento patch-clamp, scongelare una aliquota di soluzione intracellulare sul ghiaccio e mantenerla refrigerata durante l'esperimento di patch-clamp perPrevenire il degrado.
4. Tirare le pipette patch dai capillari di vetro (seguendo il manuale d'uso del puller pipetta) per ottenere dimensioni micropipette con resistenza di 5-10 M quando riempite con soluzione intracellulare.

4. Impostazione dell'esperimento Patch-Clamp e creazione di una configurazione intero a cellule

1. Impostazione dell'esperimento patch-clamp
   1. Attivare il set di patch-clamp (computer, amplificatore controllato da computer, digitalizzatore, ecc. )
   2. Aprire il software patch-clamp ( ad es. AXON pCLAMP10 o HEKA PatchMaster) e impostare i protocolli per le registrazioni elettrofisiologiche. Impostare il filtro per il segnale a basso passaggio a 1-3 kHz e il digitalizzatore a 10-20 kHz.
   3. Accendere la fotocamera, il micromanipolatore e la sorgente luminosa.
   4. Quando l'amplificatore controllato dal computer è acceso, messa a terra il corpo dello sperimentatore toccando con mano la striscia di patch-clamp che è stata messa a terra,Prima di toccare il headstage, per proteggerlo da scosse elettriche.
   5. Trasferire le cellule epiteliali colturali sulla copertura in vetro alla camera di registrazione riempita di ~ 1 ml di standard PSS a RT. Cambiare attentamente il bagno PSS almeno due volte utilizzando una pipetta prima di ogni esperimento di patch-clamp.
      NOTA: Facoltativamente, riempire il sistema di perfusione con PSS standard o un'altra soluzione esterna in base all'esperimento previsto. Perfuse la camera di registrazione a microscopio (RC-26G o RC-26GLP) con PSS poche volte ad una velocità di ~ 2 mL / min prima di avviare gli esperimenti di patch-clamp. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria intrappolate lungo il sistema di perfusione.
   6. Visualizzare e selezionare le celle sotto un microscopio invertito con obiettivi da 10x e 40x dotati di un sistema ottico di contrasto differenziale di disturbo. Cercare grandi singole celle isolate per la registrazione. Identificare le cellule epitidimali isolate per la loro forma sferica con mIcrovilli su un'estremità delle membrane e distribuzione polarizzata di contenuti intracellulari ( Figura 1 ).
   7. Utilizzando una siringa da 1 ml (un ago in microsiringa non metallica fatta in casa), riempire una micropipetta con la soluzione interna (basata su EGTA K ⁺ , vedere la fase 3.3). Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nella micropipetta, che possono aumentare la resistenza della micropipetta. Utilizzare una soluzione sufficiente affinché la soluzione interna immerga l'elettrodo di filo d'argento rivestito con cloruro all'interno del porta micropipetta.
   8. Montare la micropipetta nel supporto dell'elettrodo e applicare una bassa pressione positiva (~ 0,2 ml di volume della siringa). Tenere la bassa pressione positiva continua fino a toccare la membrana cellulare nei passaggi successivi.
2. Stabilire la configurazione di celle intere con le celle per le registrazioni
   1. Immergere la pipetta nella soluzione del bagno alla massima velocità del micromanipolatore. Trovate la pipettaPunta sullo schermo collegato alla fotocamera digitale; Rallentare la velocità del micromanipulator verso la modalità medio-alta.
   2. Controllare rapidamente la resistenza micropipetta (5-10 MΩ) utilizzando il comando dell'interfaccia di acquisizione dati ( ad es. "Test della membrana" nel sistema AXON) applicando una fase di tensione ( ad es. 5 mV per 100 ms) generata dall'amplificatore controllato dal computer. Cambiare su una nuova micropipetta se la resistenza è notevolmente fuori da questa gamma.
   3. Inizia a spostare verso il basso l'obiettivo montato sul microscopio; Gradualmente guidare la micropipetta verso la cella selezionata. Abbassare sempre l'obiettivo in primo luogo e quindi abbassare la micropipetta al piano di messa a fuoco, finché la micropipetta non supera la superficie centrale della cella selezionata.
   4. Annullare il potenziale di giunzione del liquido tra le pipette e le soluzioni dei bagni a zero utilizzando il comando "pipette offset" nell'interfaccia comandi del software.
   5. Impostare l'amplificatore comm controllato dal computerAnder al morsetto di tensione e la prova della membrana alla modalità "Bath".
   6. Messa a fuoco fine per una visione più chiara della cella, quindi gradualmente abbassare la micropipetta utilizzando il micromanipolatore a bassa e media velocità.
   7. Quando la micropipetta è vicina alla cella (dimostrata da una corrente diminuita quando viene attivata dal comando di prova a membrana), rimuovere immediatamente la bassa pressione positiva e applicare una pressione negativa negativa (0,1 ml di siringa volume) per formare il gigaseale (> 1 GΩ) .
   8. Monitorare la resistenza con il test della membrana. Se la resistenza è> 500 MΩ ma <1 GΩ, applicare un potenziale negativo (di solito come potenziale di mantenimento impostato a -60 mV), che può contribuire a formare il gigaseo. Compensare la corrente capacitiva transitoria della micropipetta.
   9. Se la tenuta è> 1 GΩ e stabile (come mostrato nell'interfaccia software), applicare una aspirazione corta e forte per rompere la membrana cellulare. Non applicare una compensazione per il seLa resistenza dei ries e la capacità cellulare.
   10. Immediatamente dopo aver raggiunto una configurazione di cella intero di successo, applicare un passo di iperpolarizzazione di 10 mV (5 tracce con intervalli di tempo minimi, durata di 20 ms, campione di segnale a 20 kHz) da un potenziale di holding di -60 mV.
   11. Passare la modalità di tensione alla modalità a zero corrente e contrassegnare le letture dall'interfaccia software o eseguire una registrazione senza interruzioni (10-60 s) per le letture potenziali della membrana della cella.
   12. Rapidamente tornare indietro e rimanere in modalità tensione e applicare i protocolli di tensione secondo gli esperimenti pianificati e misurare le risposte correnti. La sottrazione non viene applicata alla corrente di perdita intrinseca durante le registrazioni.
   13. Monitorare la stabilità delle risposte durante le registrazioni oi diversi parametri della cella. Ad esempio, utilizzare l'interfaccia di comando "Test a membrana" per controllare la resistenza di ingresso (R _i ), la resistenza di serie (R _s ) e la cellaCapacità di membrana (C _m ) nel test della membrana in modalità "Cella" durante l'interruzione dei protocolli.
       NOTA: Le gocce improvvise nella resistenza di ingresso sono di solito indicative di una patch sciolta e un drammatico aumento della resistenza di serie può indicare la intasamento delle punte di micropipetta dagli organi intracellulari o da frammenti di membrana. Durante la registrazione, controllare regolarmente la posizione del micropipette per verificare se si verifica una deriva, che può portare alla perdita della patch. Se la deriva è un problema, sollevare attentamente la micropipetta e la cella di taglio lontano dalla parte inferiore della camera di registrazione. Questo passaggio può talvolta portare alla perdita della patch, nel qual caso, è necessario ripetere la procedura di patch-clamp intere cellule.

5. Analisi delle proprietà elettrofisiologiche passive delle cellule

1. Dopo aver ottenuto i dati dagli esperimenti di patch-clamp, aprire i dati vuoti nel software Clampfit e misurare la mediaValore per il potenziale di membrana di riposo per ogni cella. In alternativa, utilizzare il valore contrassegnato dalla tensione di zero corrente nella modalità corrente. Correggere i valori con il potenziale di giunzione del liquido (12,4 mV in questo studio).
2. Aprire i dati dalla fase di iperpolarizzazione da 10 mV (ΔV) ottenuti da una cella, misurare la differenza di corrente prima e durante il passo ( _fase I ) e calcolare la resistenza di ingresso (R _i ) utilizzando l'equazione come:
   
3. Calcolare la capacità cellulare (C _m , in unità di pF) (utilizzare gli stessi dati correnti dal passo di iperpolarizzazione 10-mv integrando l'area totale sotto la corrente del condensatore di membrana durante la corrente iniziale di decadimento iniziale sollevata sul trigger di tensione) Per ottenere il valore della carica totale accumulata (Q, in unità di pA • ms) della cella. Utilizzare la seguente equazione:
   
4. Calcolare il valore della resistenza di serie (R _s ) per ciascuna cella inserendo la corrente transitoria iniziale dal passo negativo di 10 mV con un algoritmo esponenziale standard per ottenere la corrente di decadimento della costante di tempo ( T , in unità di ms) e utilizzare il Seguente equazione:
   

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Risultati

La procedura di digestione enzimatica descritta per l'isolamento delle cellule epiteliali provenienti dai rasi di epididimide cauda è un protocollo modificato dei nostri precedenti studi ^{9 , 12} . Questo metodo produce una miscela di singole cellule con più di 90% di vitalità e senza blister di superficie o volume di cellule gonfie. La miscela cellulare eterogenea è costituita principalmente da cellule principali, cellule ...

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Discussione

In questo protocollo, la dispersione enzimatica dei cauda epididimidi di ratto ha fornito costantemente cellule epiteliali sane. La qualità delle cellule epitidimali epiteliali per gli esperimenti di patch-clamp dipende da alcuni passi critici del protocollo. Per esempio, la centrifugazione della miscela cellulare a bassa forza centrifuga (30 xg) è importante per eliminare lo spermatozoo e il contenuto lumino epididimo; Le cellule epitidimali epiteliali diventano insalubre in presenza degli spermatozoi nella coltura c...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument of AXON system
Computer controlled amplifier	Molecular Devices - Axon	Multiclamp 700B patch-clamp amplifier
Digital Acquisition system	Molecular Devices - Axon	Digidata 1550 converter
Microscope	Olympus	BX-61WI
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Recording chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-324C
Instrument of HEKA system
Patch Clamp amplifier	Harvard Bioscience - HEKA	EPC-10 USB double
Microscope	Olympus	IX73
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Recording chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-324C
Other Instrument
Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-1000
Recording Chamber	Warner Instruments	RC-26G or homemade chamber
Borosilicate capillary glass with filament	Sutter Instrument / Harvard Apparatus	BF150-86-10
Vibration isolation table	TMC	63544
Digital Camare	HAMAMASTU	ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
Reagents for isolation
RPMI 1640 medium	Gibco	22400089
Penicillin/Streptomycin	Gibca	15140112
IMDM	ATCC	30-2005
IMDM	Gibco	C12440500BT
Collagenase I	Sigma	C0130
Collagenase II	Sigma	C6885
5-α-dihydrotestosterone	Medchemexpress	HY-A0120
Fetal bovine serum	capricorn	FBS-12A
Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM	Sigma/various	V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM	Sigma/various	M2393
EGTA, 0.1mM	Sigma/various	E4378
HEPES, 10mM	Sigma/various	V900477
K-gluconate, 100mM	Sigma/various	P-1847
Mg-ATP, 3mM	Sigma/Various	A9187
The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM	Sigma/various	V900058
KCl, 4.7mM	Sigma/various	V900068
CaCl2, 2.5mM	Sigma/various	V900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mM	Sigma/various	M2393
NaH2PO4, 1.2mM	Sigma/various	V900060
HEPES, 10mM	Sigma/various	V900477
Glucose, 10mM	Sigma/various	V900392
For pH adjustment
NaOH	Sigma/various	V900797	Purity >=97%
KOH	Sigma/various	60371	Purity >=99.99%