أوفيراككوموليشن الناجمة عن إيليكتومي الصفراوية في الأمعاء الماوس

Summary

إعادة استيعاب حامض الصفراء تعتمد على الأمعاء وتثبيط تغذية مرتدة التوليفي الكبدية الصفراوية حمض مهم للتوازن المنهجي والصحة. في هذه الدراسة، يصف لنا نموذج ماوس لاستئصال لفائفي لتقييم سوء الامتصاص الناجم عن إيليكتومي الصفراء، أوفيراككوموليشن، وسمية في الأمعاء الماوس.

Abstract

استئصال الأمعاء هو نهج علاجي مشترك للأمراض التي تصيب الإنسان مثل السمنة ومرض التهاب الأمعاء وداء كرون وسرطان القولون الذي غالباً ما ينتج عن الآثار الضارة مثل متلازمة الأمعاء القصيرة شديدة بما في ذلك الإسهال حامض الصفراء، الجفاف واضطرابات المنحل بالكهرباء، وسوء امتصاص المغذيات. هنا نقدم نموذجا بتر لفائفي مورين، يسمى إيليكتومي، لتقييم الاتصالات الأنسجة والحفاظ على التوازن المنهجي. بعد بتر لفائفي، تعميم الدم بشكل دائم تخلو من عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية هرمون الغدد الصماء خاصة الدقاق 15 (FGF15)، التي تصدر عن تثبيط الصماء تخليق حامض الصفراء في الكبد. في تركيبة مع زيادة الإنتاج وإعادة استيعاب الملغاة من الأحماض الصفراوية بعد إزالة الدقاق، تعاني الفئران التي خضعت لعملية جراحية أوفيراككومولاتيون الملح الصفراوية في الأمعاء والإسهال المرتبطة بها، والاعتلال، والوفيات. رواية استخدام نموذج عملية جراحية في هذه الدراسة قد ثاقبة الميكانيكية والفنية التحكم لفائفي التنظيم الأيضي المنهجية في علم وظائف الأعضاء والأمراض.

Introduction

في البحوث الطبية الحيوية الحديثة، ونماذج حيوانية محوره وراثيا تستخدم على نطاق واسع استخلاص رؤى في الأمراض التي تصيب الإنسان. على وجه الخصوص، قد استخدمت الأنسجة أو وظائف الربح والخسارة الخاصة بالخلية الجينات لدراسة التنظيم الجزيئي، فضلا عن الآثار البيولوجية المستحث. وعلى الرغم من التقدم في معالجة الهدف الجينات في فيفو، هناك قيود الذي طال أمده. الحذف الخاصة الأولى، العديد من الخلايا أو الأنسجة سوف تؤثر على أجهزة متعددة. على سبيل المثال، حذف الجينات الظهارية سيقضي على التعبير ابيثيليا من الأنسجة المتعددة. علاوة على ذلك، حتى لو حذف مقصور على نسيج معين، نادراً ما أمكن السيطرة المكانية. على سبيل المثال، تنفيذ جزأين متمايزين في أنسجة مثل الأمعاء، مهام محددة للغاية التي لا يمكن معالجته مع الدقة في فيفو. وفي هذه الحالات، يعتبر استئصال الأنسجة المحتوية على الجينات نهج دراسة أكثر كفاءة لتحديد أهمية الاتصال الأنسجة الميكانيكية والفنية.

إيليكتومي الغالب تستخدم في مرضى كرون والتهابات الأمراض التي تنطوي على الدقاق القاصي ^1،2،3. الدقاق تنتج عادة عدة هرمونات تخزين الطاقة مثل عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية 15/19 (FGF15/19) والببتيد YY (بيي) مثل الجلوكاجون الببتيد 1/2 (GLP1/2)؛ هذه الهرمونات تلعب أدواراً هامة في المحلية والغدد الصماء في الكثير من الوظائف البيولوجية^4،،من⁵⁶. من بين هذه الهرمونات، تم التعرف على FGF15 كمثبط الغدد الصماء قوية تخليق حامض الصفراء في الكبد. بمجرد إعادة استيعاب في انتيروسيتيس لفائفي، الأحماض الصفراوية تنشيط مستقبلات فارنيسويد X مستقبلات النووية (FXR) لتحفيز التعبير Fgf15 ، الأمر الذي يؤدي بعد ذلك إلى تثبيط التغذية المرتدة من حامض الصفراء الكبدية توليف ⁷. في دراسة أجريت مؤخرا، قدمنا نموذج إيليكتومي الماوس من أجل دراسة العوامل مثل كروبيل لفائفي 15 (KLF15)--Fgf15 يشير إلى المحور الذي ينظم إنتاج حامض الصفراء الإيقاعية في الكبد ⁸. الأهم من ذلك، أدرجنا عائلة رواية، عوامل مثل كروبيل، لا سيما KLF15، في البيولوجيا حامض الصفراء. استناداً إلى الدراسات الفنية بما في ذلك الجراحة إيليكتومي، عقدنا العزم أن توليف حمض الصفراء أوبريجولاتيس KLF15 عبر إليه غير الكبد غير مباشرة. وأخيراً، اعتبرت KLF15 لفائفي أيضا الجهة السلبية الذاتية أول من Fgf15.

أجزاء الأمعاء تنازلي من الأقرب إلى المناطق البعيدة المسؤولة عن امتصاص المواد الغذائية المختلفة. الدقاق هو الجزء الرئيسية المسؤولة عن حامض الصفراء، وفيتامين ب₁₂ (V_B12) الاستيعاب ⁹. دراسة سابقة استخدمت نموذج ماوس لاستئصال القناة الهضمية الدانية لدراسة متلازمة الأمعاء القصيرة؛ واقترحت مختلف أطوال بتر والوجبات الغذائية وأنواع خياطة الاحتفاظ معدل أمثل جراحة بعد بقاء ¹⁰. وعلاوة على ذلك، يشير استعراض عهدا إلى أن بتر لفائفي عادة ينتج عن المرض أكثر شدة من ريسيكتيونس الجزء (غي) الجهاز الهضمي الأخرى نظراً لانخفاض قدرة التكيف المسالك المتبقية ¹¹. هذا الموضوع اكتسب مكثفة مصالح جماعات البحوث الأساسية والسريرية، بينما فهم الانتعاش والنهج العلاجية الفعالة التي لا تزال محدودة.

ينتج الإسهال حامض الصفراء من اختلالات في التوازن حامض الصفراء في ^12،تداول enterohepatic¹³. يمكن أن يكون نتيجة لاستئصال لفائفي، أمراض الجهاز الهضمي، أو نتيجة لسوء امتصاص الأحماض الصفراوية مجهول السبب. أكثر من 80 في المائة مرضى وجدت أن يقدم مع الإسهال بعد أن خضع لاستئصال لفائفي ¹⁴. وقد إيليكتومي يمكن أن تكون نموذجا جراحة مهمة لتحقيق الإسهال حامض الصفراء. في هذه الدراسة، وتقديم سلسلة من ريسيكشنز لفائفي تقييم تدرج لنقص FGF15، فضلا عن سوء الامتصاص المعوي الصفراوية الملح، أوفيراككوموليشن، والأضرار السامة.

Protocol

البروتوكول الحيوان واستعرضت ووافقت عليه لجنة الاستخدام في "حالة الاحتياطي الغربية كلية الطب بجامعة" ورعاية الحيوان المؤسسية وأجرى وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (الطبعة الثامنة، 2011). وقد euthanized الفئران بأساليب متوافقة مع المبادئ التوجيهية للرابطة الطبية البيطرية الأميركية (وبرايتون) "القتل الرحيم للحيوانات" (طبعة عام 2013). واستخدمت C57BL/6J، ذكور، 8-16 أسبوع القديمة الفئران في هذا البروتوكول. تم إيواء الفئران في بيئة دورة الضوء الظلام/12 ح.

1-"إعداد المنطوق" قبل

1. نقل الفئران إلى قفص نظيف 24 ساعة قبل الإجراء. تتيح حرية الوصول إلى المياه للحيوانات. استبدال الأغذية تشو مع الأغذية لينة هلام (مكملات غذائية) ح 4-6 قبل الجراحة للحد من محتويات الأمعاء الدقيقة للجراحة-
2. تعقيم جميع الأدوات الجراحية وإعداد المواد الجراحية المعقمة التي تستخدم مرة واحدة. تنظيف منطقة الجراحة ومخروط الآنف مخدر مع الإيثانول 70%-
3. إعداد مجهر تشريح والمبخر isoflurane مخدر والصكوك والتحكم في درجة الحرارة حيوانية جراحية طاولة صغيرة للحفاظ على درجة حرارة الجسم. تنظيم الصكوك وخياطة الجروح، والمحاقن في موقع للوصول الحر أثناء الجراحة.
4. إعداد مصدر ضوء لتوفير ما يكفي من الضوء لمنطقة الجراحية.
5. تعد عقيمة المالحة 0.9 في المائة في 5 مل حقنه لتنظيف الأمعاء والبطن.

2. إيليكتومي وملامسة

1. أنيسثيتيزي الفئران مع إيسوفلوراني (2-3 ٪) في غرفة حضانة حيوانات صغيرة. تحديد أنيسثيتيزيشن الكافية باستخدام تقنية قرصه إصبع القدم بينما الحيوان على إيسوفلوراني-
إزالة شعر البطن بتطبيق المنتج إزالة الشعر
2. ويمسح الشعر باستخدام الأسفنج الجراحية بعيداً مع المحافظة على التخدير. ضع الماوس على التحكم في درجة حرارة حيوان جراحية طاولة صغيرة ( الشكل 1 أ) للحفاظ على درجة حرارة الجسم في 37 درجة مئوية. المحافظة على التخدير مع إيسوفلوراني (1-2 ٪) من خلال فاسيماسك. علاج العيون الماوس مع مرهم العين.
3. تنظيف الجلد باستخدام الكحول بوفيدون و 70 في المائة، وتغطي منطقة العمليات الجراحية للبطن مع شاش معقم الجراحية ( الشكل 1 ب)-
4. جعل شق البطن خط الوسط باستخدام مشرط جراحة بعد التخدير في الواقع. استخدم قضيب القطن ذات الرؤوس لحماية الأمعاء وسحب الماوس البطن العضلات مع الكامشات تماما فتح وفضح تجويف البطن ( الشكل 1 ج)-
5. موقع الأعور. بدءاً من الأعور، الانتقال بعناية الدقاق متصلة وجزء من الصائم خارج تجويف البطن ( الشكل 1 د)-
   ملاحظة: الأعور يمكن بسهولة تحديد نظراً لكبر حجمها حتى بعد الصيام.
6. اضطر الفرع العلوي للشريان المساريقي العلوي مع 7-0 خياطة حرير أوككلودي الدم إمداد الجزء لفائفي أن اقتطعت. يتغير لون لفائفي من الوردي إلى الأرجواني الداكن بعد عملية ربط. ( الشكل 1 ﻫ-F).
7. تبعاً للغرض من هذه التجربة، باستخدام مقص، المكوس وإزالة 50% أو 90% من الدقاق.
   ملاحظة: لإجراء عملية جراحية الشام، لا تقوم بتنفيذ عملية ربط الشريان المساريقي العلوي ولا تقم بإزالة الدقاق-
مسح
8. التجويف كلا طرفي لفائفي مع المالحة 0.9%.
   ملاحظة: كما الدقاق سليمة الباقية يزال يتلقى إمدادات دم عادي من الشريان المساريقي العلوي، كمية صغيرة من الدم سيتم مسح أثناء العملية. وهذا يشير أيضا إلى أن إمدادات الدم إلى نهايات لفائفي العادي ويضمن لا الاسكيمية أثناء إجراء مفاغره ( الشكل 1 ز)-
9. موقع ميسينتيريس على جانب طرفي لفائفي. محاذاة ميسينتيريس وخياطة نهايات لفائفي معا باستخدام 8-0 خياطة ( الشكل 1 ز-ح)-
10. خياطة أناستوموسيد إلى جانب contralateral الدقاق للحفاظ الدقاق بطريقة طبيعية ( الشكل 1 أنا)-
11. خياطة الطرفين العلوي والسفلي بين خيوط الأصلي اثنين لدقة التسجيل الاثنين لفائفي ينتهي معا ( الشكل 1 ي)-
12. يؤكد أنه لا يوجد أي تسرب من موقع ملامسة بعد الانتهاء من الإجراء سوتورينج ثلاث خطوات ( الشكل 1 ز--أنا). العودة الأعور والأمعاء الدقيقة في تجويف البطن إلى الموقع الأصلي التشريحية. تغسل منطقة الجراحة مع الحارة المالحة 0.9% باستخدام إبرة حادة. ( الشكل 1 ك)-
13. إغلاق شق طبقة العضلات البطن مع خياطة 6-0. محاذاة إلى شق البطن من الجلد باستخدام الملقط وخياطة الجلد البطن لتسهيل التئام الأمثل ( الشكل 1 لتر)-

3. الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية

الفئران

1. نقل بعد الجراحة إلى وحدة العناية المركزة للانتعاش. منزل لهم في قفص الفراش الورق على لوح تدفئة درجة الحرارة التي تسيطر على مواصلة الانتعاش ما بعد الجراحة بين عشية وضحاها. توريد الفئران مع الأغذية الناعمة بالإضافة إلى المياه والأغذية العادية-
2. تول البوبرينورفين (0.05-0.1 مغ/كغ) بالحقن تحت الجلد كل ح 8-12 للتسكين.
   ملاحظة: Euthanize الفئران CO ₂ في حالة شدة المرضى.
3. في نقطة النهاية، التضحية بالفئران باستخدام عينات isoflurane والحصاد أوفيردوسيد حسب الحاجة (القسم 4)-

4. تقييم الصفراء الناجمة عن إيليكتومي "أوفيراككوموليشن"

1. تزن وتشريح الفئران بعد بتر 0% (الشام) أو 50% أو 90% من الدقاق يوم واحد.
إزالة الجهاز الهضمي
2. وتزن عليه. حساب وزن غي بنسبة وزن الجسم لتقييم شدة سوء امتصاص الملح الصفراوية وأوفيراككوموليشن-
تحويل مساحات غي إلى أنابيب مخروطية الشكل 15 مل
3. وقطع منها إلى مقاطع قصيرة باستخدام مقص. بعد القطع، نقل أجهزة الطرد المركزي في 3,000 س ز للحد الأدنى 10 المادة طافية (غي السوائل التي تحتوي على أملاح الصفراء) في أنبوب نظيف.
4. قياس إجمالي حجم ووزن السائل غي وحساب وزن السوائل لغي المسالك نسبة الوزن مواصلة تقييم overaccumulation الصفراء في الجهاز الهضمي.
5. تحديد المبلغ الإجمالي الصفراوية في المادة طافية بمقايسة حمض الصفراء كما هو موضح في مرجع ⁸.

النتائج

وترد الإجراءات المتعلقة إيليكتومي في الشكل 1. وتشمل الخطوة الأولى إعداد الماوس جلد البطن وإجراء شق البطن، واستخدام الكامشات لفضح تماما الأمعاء (الشكل 1أ-ج). بعد ذلك، كان يقع الأعور الماوس (الشكل 1د)؛ ونظرا ...

Discussion

بغية تنفيذ إيليكتومي نجاح، يجب أن متصلة الشريان المساريقي العلوي مقدما لمنع إمدادات الدم إلى الجزء ريسيكتينج. سيتم تشغيل الجزء لفائفي الدماغية أرجواني داكن بعد عملية ربط. ثم يجب أن تكون تماما مستأصل الجزء لفائفي. ويجب ضمان إمدادات دم طبيعي لنهايات المحتفظ بها. وهذا ضروري لتجنب إزالة النز?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection microscope	Olympus	SZ61	For surgery
Animal temperature controller	Physitemp Instruments, Inc.	TCAT-2LV	For body temperature control
Isoflurane anesthetic vaporizer	VetEquip	911104	For anesthesia
Dissection forceps	Fine Science Tools, Inc.	11274-20	For surgery
Scissors	Fine Science Tools, Inc.	14084-08	For surgery
Needle holder	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7882	For surgery
Micro knives-needle blade	Fisher Scientific	10318-14	For surgery
6-0 monofilament suture	Ethicon	1698G	For abdominal skin closure
7-0 silk suture	Ethicon	766G	For ligation
8-0 monofilament suture	Ethicon	1714G	For anastomosis
Surgical sponges	Dynarex Corp.	3333	For surgery
Small cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-118	For surgery
Isoflurane	Piramal Healthcare Limited	66794-013-25	For anasthesia
Buprenorphine hydrochloride	Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals	12496-0757-1	For analgesia
0.9% sodium chloride Injection	B. Braun Medical Inc.	0264-7800-10	For washing/injection
Povidone iodine prep solution	Dynarex Corp.	1413	For skin preparation
Puralube vet ointment	Dechra Veterinary Products	17033-211-38	For eye pretection
Hair remover lotion	Church & Dwight Co., Inc.		For skin preparation
Intensive care unit	ThermoCare	FW-1	For post-surgery recovery
DietGel recovery	ClearH2O	72-06-5022	For post-surgery recovery
Aurum total RNA fatty and fibrous tissue kit	Bio-Rad	7326830	For RNA isolation
iScript reverse transcription supermix for RT-qPCR	Bio-Rad	1708841	For reverse transcription assay
TaqMan fast advanced master mix	Applied Biosystems/Life Technologies	4444965	For QPCR analysis
Total bile acid assay kit	Genzyme Diagnostic	DZ042A-K01	For bile acid assay
C57BL/6J	The Jackson Laboratory