Ileectomy 유도 담 즙 Overaccumulation 마우스 소장에서

요약

소장-종속 담 즙 산 재흡수 및 간 담 즙 산 합성의 피드백 저해 조직의 항상성 및 건강에 대 한 중요 하다. 이 연구에서 우리는 ileal 절제술 ileectomy 유도 담 즙 흡수 장애, overaccumulation, 그리고 마우스 소장에서 독성 평가를 위한 마우스 모델을 설명 합니다.

초록

창 자 절제술은 비만 같은 인간의 질병, 염증 성 장 질환, 크 론 병, 및 종종 결과 심한 짧은 창 자 증후군 같은 부작용 등 담 즙 산 성 설사, 대 장 암에 대 한 일반적인 치료 방법 탈수, 전해질 장애, 고 영양 흡수 장애입니다. 여기 ileectomy, 조직 커뮤니케이션 및 조직의 항상성 유지 되 나 murine ileal 절제 모델을 소개 합니다. Ileal 절제 후 혈액 순환 영구적으로 없는 상태입니다 회장 관련 내 분 비 호르몬 섬유 아 세포 성장 인자 15 (FGF15), 간에 서 담 즙 산 합성의 endocrinal 그것의 금지를 해제. 생산 증가는 회장을 제거 후 담 즙 산의 폐지 재흡수와 함께, 수술 마우스 소장와 관련 된 설사, 사망률, 및 사망률에서 담 즙 소금 overaccumulation에서 고통. 이 연구에 도입 된 수술 모델의 비 발한 사용 생리학과 질병에 조직 대사 규제의 ileal 제어에 대 한 기계적이 고 기능적인 통찰력을 제공할 수 있습니다.

서문

현대 생물 의학 연구에 유전자 조작된 동물 모델은 인간의 질병에 대 한 통찰력을 수집에 널리 활용 된다. 특히, 조직 또는 세포 특정 이득 및 손실 기능 유전자의 분자 규제 유도 생물학적 효과 공부 사용 되었습니다. 대상 유전자에서 vivo에서조작에 전진에도 불구 하 고 느린 한계가 있다. 처음, 많은 세포 또는 조직의 특정 삭제 여러 장기에 영향을 것입니다. 예를 들어 상피 유전자 삭제 여러 조직의 epithelia에 식을 제거 합니다. 또한, 삭제는 특정 조직에 제한 하는 경우에 공간 컨트롤은 거의 가능 합니다. 예를 들어 내장 같은 조직에서 고유한 세그먼트 vivo에서정밀 조작 될 수 없는 매우 특정 기능을 수행. 이러한 상황에서 유전자를 포함 하는 조직의 절제 조직 커뮤니케이션의 기계적이 고 기능적인 의미를 결정 하기 위해 보다 효율적인 공부 방법이 될 여겨진다.

Ileectomy는 크의 대부분에 사용된 환자 및 원심 회장 ^1,2,3를 포함 하는 염증 성 질환. 회장은 일반적으로 생산 하 고 여러 섬유 아 세포 성장 인자 15/19 같은 에너지 저장 호르몬 (FGF15/19), 펩 티 드 YY (PYY), 글 루카 곤 유사 펩 티 드 1/2 (GLP1/2); 이러한 호르몬 많은 생물학 기능^4,,56에 중요 한 지역 및 내 분 비 역할을 재생합니다. 이들이 호르몬 중 FGF15는 간에 서 담 즙 산 합성의 강력한 내 분 비 억제제로 발견 되었습니다. 일단 ileal enterocytes로 재흡수, 담 즙 산 핵 수용 체 farnesoid X 수용 체 (FXR) Fgf15 식 자극을 연속적으로 간 담 즙 산 합성 ⁷의 피드백 저해에 이르게 활성화 합니다. 최근 연구에서 우리는 ileal kruppel 같은 인자 15 (KLF15)를 공부 하기 위하여 마우스 ileectomy 모델을 도입-Fgf15 축 간 ⁸circadian 담 즙 산 생산을 조절 하는 신호. 가장 중요 한 것은, 우리 소설 가족을, kruppel와 같은 요인, 특히 KLF15, 담 즙 산 생물학에 소개 했다. Ileectomy 수술을 포함 한 기능 연구를 바탕으로, 우리는 간접 키 모 비 메커니즘을 통해 그 KLF15 upregulates 담 즙 산 합성 결정. 마지막으로, ileal KLF15 Fgf15의 첫 번째 내 생 부정적인 레 귤 레이 터로도 식별 됩니다.

말 초 영역에 인접에서 내림차순 장 세그먼트 다른 영양소의 흡수에 대 한 책임이 있습니다. 회장은 주요 세그먼트 담 즙 산과 비타민 B₁₂ (V_{b 12}) 흡수 ⁹에 대 한 책임 이다. 이전 연구를 고용 짧은 창 자 증후군; 공부를 인접 창 자 절제술의 마우스 모델 다양 한 절제 길이, 다이어트, 및 봉합 사 종류는 최적의 수술 후 생존 율 ¹⁰을 유지 하기 위해 제시 되었다. 또한, 최근 검토 ileal 절제 그 나머지로 ¹¹의 감소 적응 능력 때문에 다른 위장 (GI) 세그먼트 절제술 보다 더 심각한 질병에 일반적으로 결과 나타냅니다. 이 항목 복구 및 효과적인 치료 접근의 이해는 제한 하는 반면 기초 및 임상 연구 그룹의 집중적인 관심을 얻고 있다.

담 즙 산 설사 장 순환 ^12,13에서 담 즙 산 항상성 불균형에서 발생합니다. Ileal 절제술, 위장 질환, 또는 idiopathic 담 즙 산 흡수 장애의 결과의 결과 수 있습니다. 환자의 80% 이상이 ¹⁴ileal 절제술 받은 후 설사와 함께 현재 발견 되었습니다. Ileectomy 담 즙 산 성 설사의 조사에 대 한 중요 한 수술 모델이 될 가능성이 있다. 본이 연구에서는 ileal 절제술의 시리즈 FGF15 결핍으로 장의 담 즙 소금 흡수 장애, overaccumulation, 그리고 독성 손상의 그라데이션 평가 제공 합니다.

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프로토콜

동물 프로토콜 검토 기관 동물 관리 및 사용 케이스 서쪽 예비 대학의과 대학에 위원회에 의해 승인 및 가이드는 국립 보건원 (NIH)에 따라 실시 했다는 관리 및 실험 동물의 사용 (제 8 판, 2011). 마우스는 미국 수의 의학 협회 (AVMA) 지침 준수 방법으로 동물의 안락사에 대 한 안락사 했다 (2013 판). C57BL/6J, 남성, 8-16 주 오래 된 마우스는이 프로토콜에 사용 되었다. 마우스는 12 h 다크/라이트 사이클 환경에서 지 내게 했다.

1. 사전 요원 준비

1. 깨끗 한 케이지 절차 전에 24 h를 이동 마우스. 동물 물에 자유 접근을 허용 합니다. 부드러운 음식 (젤 규정식 보충 교재)와 차 우 식품 대체 수술에 대 한 소장 내용을 줄이기 위해 수술 전에 4-6 h.
2. 모든 수술 기구를 소독 하 고 단일 사용 무 균 수술 재료를 준비 합니다. 깨끗 한 수술 영역 및 70% 에탄올과 마 취 코 콘.
3. 해 부 현미경, isoflurane 마 취 기화 기, 계기, 및 온도 제어 작은 동물성 수술 테이블 신체 온도 유지에 대 한 설정합니다. 악기, 봉합, 수술 하는 동안 무료 액세스에 대 한 위치에 주사기를 구성.
4. 외과 영역에 대 한 충분 한 빛을 제공 하는 광원 설정.
5. 살 균 0.9% 염 분 장 및 복 부 청소 5 mL 주사기에 준비.

2. Ileectomy 및 문 합

1. 작은 동물 보육 실에서 isoflurane (2-3%)와 Anesthetize 쥐. 동물 isoflurane에 동안 발가락 핀치 기술을 사용 하 여 적절 한 anesthetization 결정.
2. 머리 제거 제품을 적용 하 여 복 부 머리를 제거 하 고 멀리 외과 스폰지를 사용 하 여 마 취를 유지 하면서 머리를 닦아. 37 ° C 유지 마 취와 isoflurane (1-2%)는 안 면을 통해에 온도 제어 작은 동물성 수술 테이블에 ( 그림 1 A) 체온을 유지 하기 위해 마우스를 놓습니다. 눈 연 고와 마우스 눈 치료.
3. Povidone-요오드와 70% 알코올을 사용 하 여 피부를 깨끗 하 고 메 마른 외과 거 즈 ( 그림 1 B)와 복 부의 수술 영역을 커버.
4. 중간 복 부 절 개를 일단 마 취는 수술 메스를 사용 하 여 확인 합니다. 솜 밀고 주걱을 사용 하 여 보호 장과 풀 마우스 복 부 근육을 완전히 열고 복 부 구멍 ( 그림 1 C) 노출 브래킷으로와.
5. 맹을 찾습니다. 맹에서 시작 신중 하 게 이동 연결된 회장 및 공장 부분의 복 부 구멍 ( 그림 1 D).
   참고: 맹 확인 될 수 있다 쉽게 그것의 큰 크기 때문에 금식 후에.
6. 선 가리고 excised 됩니다 ileal 세그먼트를 공급 하는 혈액을 7-0 비단 봉합 사로 우수한 mesenteric 동맥의 위 지점. Ileal 색 결 찰 후 어두운 자주색 분홍색에서 변경 됩니다. ( 그림 1 E-F).
7. 가 위를 사용 하 여 실험의 목적에 따라 소비 세 및 50% 또는 회장의 90% 제거.
   참고: 가짜 수술에 대 한 우수한 mesenteric 동맥 결 찰을 수행 하지 마십시오와 회장을 제거 하지 마십시오.
8. 플러시 0.9% 식 염 수와 ileal 양쪽의 루멘.
   참고: 나머지 그대로 회장 여전히 정상적인 혈액 공급을 받고으로 우수한 mesenteric 동맥에서 혈액의 작은 양의 플러시됩니다 밖으로 과정. 이것 또한 ileal 끝에 혈액 공급은 정상과 문 합 수술 ( 그림 1 G) 중 아무 허 혈을 보장 나타냅니다.
9. Ileal 양쪽 측면에 mesenteries를 찾습니다. mesenteries 및 8-0 봉합 ( 그림 1 G-H)를 사용 하 여 함께 ileal 끝 봉합.
10. 유지는 회장을 회장의 contralateral 측면 anastomosed ( 그림 1 나) 자연적인 방식으로 봉합.
11. 철저 하 게 조인 두 ileal 끝 함께 ( 그림 1 J) 2 개의 원래 봉합 사이 위와 더 낮은 측면 봉합.
12. 확인 3 단계 suturing 절차를 마친 후 문 합 사이트에서 누설입니다 ( 그림 1 G-난). 맹 고 소장 복 부 구멍으로 원래 해 부 위치를 반환 합니다. 무뚝뚝한 바늘을 사용 하 여 따뜻한 0.9% 식 염 수로 수술 영역을 씻어. ( 그림 1 K).
13. 6-0 봉합과 복 부 근육 층의 절 개를 닫습니다. 집게를 사용 하 여 복 부 피부 절 개를 정렬 하 고 최적의 상처 치유 ( 그림 1 L) 촉진 하기 위하여 복 부 피부를 봉합.

3. 수술 치료

복구에 대 한 집중 치료 단위에

1. 이전 수술 후 쥐. 수술 후 회복을 밤새 계속 온도 제어 난방 패드에서 종이 침구 장에 그들을 집. 일정 한 음식 및 물 부드러운 음식으로 마우스 공급.
2. 관리 buprenorphine (0.05-0.1 mg/kg) 피하 주사로 진통에 대 한 모든 8-12 h.
   참고: 심각 하 게 아픈 경우 CO ₂로 마우스를 안락사.
3. 는 끝점에서 마우스 필요에 따라 과다 isoflurane 및 수확 샘플을 사용 하 여 (제 4) 희생.

4. Ileectomy 유도 담 즙 Overaccumulation의 평가

1. 무게 및 0% (가짜), 50%, 또는 회장의 90%의 절제 후에 1 일 쥐를 해 부.
2. GI로 제거 하 고 그것의 무게. 담 즙 소금 흡수 장애 및 overaccumulation의 심각도 평가 하기 위해 몸 무게 비율 기 무게 계산.
3. 15 mL 원뿔 튜브로 기 책자를 전송 하 고가 위를 사용 하 여 짧은 세그먼트로 그들을 잘라. 절단 후, 10 분에 대 한 3000 x g에서 원심 전송 상쾌한 (담 즙 염을 포함 하는 유기 액체) 깨끗 한 튜브.
4. 총 볼륨 및 기 액체의 무게를 측정 하 고 GI로 중량 비에 더 기 관에 담 즙 overaccumulation 평가 유체 무게 계산.
5. 참조 ⁸에 설명 된 대로 담 즙 산 분석 결과 여는 상쾌한에 총 담 즙 금액을 결정.

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결과

Ileectomy에 대 한 절차는 그림 1에 표시 됩니다. 첫 번째 단계 마우스 복 부 피부를 준비 하 고, 복 부 절 개를 하 고 견인 기를 사용 하 여 창 (그림 1A-C)를 완전히 노출 하는 합니다. 다음, 마우스 맹 위치 했다 (그림 1D); 주어진 그것의 크기와 모양이 그것을 쉽게 식별할 수 있는 랜드?...

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토론

성공적인 ileectomy를 수행 하기 위해 우수한 mesenteric 동맥 resecting 세그먼트에 혈액 공급을 차단 하도록 사전에 출혈 수 해야 합니다. 허 혈 성 ileal 세그먼트 결 찰 후 어두운 자주색을 돌 것 이다. Ileal 세그먼트 해야 합니다 다음 완전히 절제 수 있습니다. 정상적인 혈액 공급 유지 종료에 대 한 보장 되어야 합니다. 이 쉽게 봉합 후 원인 때문에 허 혈 성 괴 사 수술 실패 수 출혈 및 부적 절 한 제거를...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection microscope	Olympus	SZ61	For surgery
Animal temperature controller	Physitemp Instruments, Inc.	TCAT-2LV	For body temperature control
Isoflurane anesthetic vaporizer	VetEquip	911104	For anesthesia
Dissection forceps	Fine Science Tools, Inc.	11274-20	For surgery
Scissors	Fine Science Tools, Inc.	14084-08	For surgery
Needle holder	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7882	For surgery
Micro knives-needle blade	Fisher Scientific	10318-14	For surgery
6-0 monofilament suture	Ethicon	1698G	For abdominal skin closure
7-0 silk suture	Ethicon	766G	For ligation
8-0 monofilament suture	Ethicon	1714G	For anastomosis
Surgical sponges	Dynarex Corp.	3333	For surgery
Small cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-118	For surgery
Isoflurane	Piramal Healthcare Limited	66794-013-25	For anasthesia
Buprenorphine hydrochloride	Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals	12496-0757-1	For analgesia
0.9% sodium chloride Injection	B. Braun Medical Inc.	0264-7800-10	For washing/injection
Povidone iodine prep solution	Dynarex Corp.	1413	For skin preparation
Puralube vet ointment	Dechra Veterinary Products	17033-211-38	For eye pretection
Hair remover lotion	Church & Dwight Co., Inc.		For skin preparation
Intensive care unit	ThermoCare	FW-1	For post-surgery recovery
DietGel recovery	ClearH2O	72-06-5022	For post-surgery recovery
Aurum total RNA fatty and fibrous tissue kit	Bio-Rad	7326830	For RNA isolation
iScript reverse transcription supermix for RT-qPCR	Bio-Rad	1708841	For reverse transcription assay
TaqMan fast advanced master mix	Applied Biosystems/Life Technologies	4444965	For QPCR analysis
Total bile acid assay kit	Genzyme Diagnostic	DZ042A-K01	For bile acid assay
C57BL/6J	The Jackson Laboratory