Sobreacumulación de Ileectomy inducida por bilis en intestino de ratón

Resumen

Reabsorción del ácido de bilis del intestino-dependiente y la inhibición de la regeneración de la síntesis hepática de ácidos biliares es importante para la salud y la homeostasis sistémica. En este estudio, describimos un modelo de ratón para la resección ileal evaluar la malabsorción biliar inducida por ileectomy, la sobreacumulación y la toxicidad en intestino de ratón.

Resumen

La resección intestinal es un enfoque terapéutico común para enfermedades humanas como la obesidad, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn y cáncer de colon que a menudo resulta en intestino corto severo síndrome-como los efectos adversos como diarrea de ácidos biliares, deshidratación, trastornos electrolíticos y mala absorción de nutrientes. Aquí introducimos un modelo murino de resección iléica, denominado ileectomy, para evaluar la comunicación de tejido y el mantenimiento de la homeostasis sistémica. Después de la resección ileal, sangre circulante carece permanentemente el factor de crecimiento del fibroblasto hormona endocrina específica de íleon 15 (FGF15), que lanza su endocrinas inhibición de la síntesis de ácidos biliares en el hígado. En combinación con el aumento de la producción y suprimido la reabsorción de ácidos biliares después de quitar el íleo, ratones que experimentaron la cirugía sufren de sobreacumulación de sales biliares en el intestino y asoció diarrea, morbilidad y mortalidad. Uso novedoso del cirugía modelo introducido en este estudio puede proporcionar la visión mecanicista y funcional control ileal de regulación metabólica sistémica en fisiología y enfermedad.

Introducción

En investigación biomédica moderna, modelos de animales genéticamente manipulados son ampliamente utilizados para recoger ideas sobre enfermedades humanas. En particular, tejido o célula-funciones específicas de ganancia y la pérdida de genes se han utilizado para estudiar la regulación molecular así como efectos biológicos inducidos. A pesar de los avances en la manipulación de genes diana en vivo, hay limitaciones persistentes. Primero, muchas células o tejido deleciones específicas afecta múltiples órganos. Por ejemplo, canceladura del gene epitelial eliminará la expresión en los epitelios de tejidos múltiples. Además, incluso si la eliminación se limita a un tejido específico, control espacial es raramente factible. Por ejemplo, en un tejido como el intestino, distintos segmentos realizan funciones muy específicas que no pueden manipularse con precisión en vivo. En estas situaciones, la resección de los tejidos que contienen el gen se considera un enfoque de estudio más eficiente para determinar el significado funcional y mecanicista de la comunicación del tejido.

Ileectomy es sobre todo utilizado en pacientes con Crohn y enfermedades inflamatorias que involucra el íleo distal ^1,2,3. El íleon normalmente produce varias hormonas de almacenamiento de energía como factor de crecimiento fibroblástico 15/19 (FGF15/19), péptido YY (PYY) y péptido similar al glucagón GLP1/2; 1/2 estas hormonas desempeñan importantes funciones locales y endocrinas en muchas funciones biológicas^4,5,6. Entre estas hormonas, FGF15 ha sido identificado como un robusto endocrino inhibidor de síntesis de ácidos biliares en el hígado. Una vez reabsorbido en enterocitos ileales, ácidos biliares activan el receptor de farnesoid X receptor nuclear (FXR) para estimular la expresión de Fgf15 , que posteriormente conduce a la inhibición de la regeneración de la síntesis de ácido biliar hepática ⁷. En un estudio reciente, introdujo el modelo de ileectomy de ratón para estudiar el íleon kruppel-like factor 15 (KLF15) -Fgf15 señalización eje que regula la producción de los ácidos biliares en el hígado ⁸. Lo más importante, hemos introducido a una nueva familia, los factores kruppel-like, particularmente KLF15, en Biología del ácido de bilis. Basado en estudios funcionales, incluyendo la ileectomy, se determinan KLF15 estimula ácido de bilis síntesis a través de un mecanismo indirecto de no-hepático. Por último, KLF15 ileal también se identifica como el primer regulador negativo endógeno de Fgf15.

Los segmentos intestinales desde proximal a distales regiones son responsables de la absorción de diferentes nutrientes. El íleon es el segmento principal responsable de ácido biliar y vitamina B₁₂ (v._B12) absorción ⁹. Un estudio anterior empleó un modelo de ratón de la resección de intestino proximal para estudiar el síndrome de intestino corto; varias longitudes de resección, las dietas y tipos de sutura se propusieron mantener una tasa de supervivencia después de la cirugía óptima del ¹⁰. Además, una revisión más reciente indica que la resección ileal típicamente resulta en una enfermedad más severa que otras resecciones de segmentos gastrointestinales (GI) debido a la disminuida capacidad de adaptación de los restantes de la zona ¹¹. Este tema ha ganado a intensivo intereses de grupos de investigación básica y clínica, mientras que la comprensión de los enfoques terapéuticos eficaces y recuperación son todavía limitadas.

Diarrea biliar ácida el resultado de desequilibrios en la homeostasis ácido de bilis en la circulación enterohepática ^12,13. Puede ser una consecuencia de la resección ileal, enfermedad gastrointestinal o un resultado de malabsorción idiopática de ácidos biliares. Se han encontrado más de 80% de los pacientes que presentan diarrea tras someterse a una resección ileal ¹⁴. Ileectomy tiene el potencial para ser un modelo de cirugía importante para la investigación de la diarrea de ácidos biliares. En este estudio, una serie de resecciones ileales proporcionar una evaluación del gradiente de FGF15 deficiencia así como malabsorción de sales biliares intestinales, sobreacumulación y daños tóxicos.

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Protocolo

animal protocolo fue revisado y aprobado por el cuidado institucional de animales y uso en el caso Western Reserve University School of Medicine y se llevó a cabo con arreglo a la guía de institutos nacionales de salud (NIH) para la Uso y cuidado de animales de laboratorio (8ª edición, 2011). Ratones fueron sacrificados por métodos compatibles con las directrices de la Asociación Médica Veterinaria americana (AVMA) para la eutanasia de animales (edición de 2013). C57BL/6J, ratones machos, de 8-16 semanas de edad fueron utilizados en el presente Protocolo. Ratones fueron alojados en un entorno de ciclo luz/oscuridad de 12 horas.

1. preparación preoperatoria

1. transferencia de ratones en una jaula limpia 24 h antes del procedimiento. Permitir que los animales libre acceso al agua. Vuelva a poner comida chow con alimentos blandos (suplemento dietético gel) 4-6 h antes de la cirugía para reducir el contenido del intestino para la cirugía.
2. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos y preparar el material quirúrgico estéril de un solo uso. Limpiar el área de cirugía y el cono de nariz anestesia con etanol al 70%.
3. Creó un microscopio de disección, vaporizador anestésico isoflurano, instrumentos y una control de temperatura pequeños animal mesa quirúrgica para el mantenimiento de la temperatura de cuerpo. Organizar los instrumentos, suturas y jeringas en un lugar de libre acceso durante la cirugía.
4. Configurar una fuente de luz para proporcionar suficiente luz para el área quirúrgico.
5. Preparación de solución salina 0.9% estéril en la jeringa de 5 mL para la limpieza intestinal y abdominal.

2. Ileectomy y Anastomosis

1. Anesthetize ratones con isoflurano (2-3%) en una cámara de incubación animales pequeños. Determinar la anestesia adecuada, utilizando la técnica del pellizco del dedo del pie mientras que el animal está en isoflurano.
2. Retire pelo abdominal aplicando producto del retiro del pelo y pelo lejos usando esponjas quirúrgicas mientras mantiene la anestesia. Coloque el ratón sobre un control de temperatura pequeños animal mesa quirúrgica ( figura 1 A) a mantener la temperatura corporal en anestesia de mantenimiento de 37 ° C. con isoflurano (1-2%) a través de una máscara. Tratamiento de los ojos del ratón con el ungüento ocular.
3. Limpiar la piel con povidona yodada y el 70% alcohol y cubrir la zona quirúrgica del abdomen con una gasa quirúrgica estéril ( figura 1 B).
4. Hacer una incisión abdominal de línea media, utilizando un bisturí quirúrgico una vez que la anestesia es en efecto. Use un aplicador con punta de algodón para proteger el intestino y tire del ratón músculo abdominal con separadores para poder abrir y exponer la cavidad abdominal ( figura 1 C).
5. Localiza el ciego. A partir del ciego, mueva con cuidado la parte del yeyuno e íleon conectado fuera de cavidad abdominal ( figura 1 D).
   Nota: El ciego puede ser fácilmente identificado debido a su gran tamaño incluso después de un ayuno.
6. Ligar la rama superior de la arteria mesentérica superior con una sutura de seda 7-0 para ocluir la sangre suministra el segmento ileal que debe ser suprimido. El íleon color cambia de rosado a púrpura oscuro después de la ligadura. ( figura 1 E - F).
7. Dependiendo de la finalidad del experimento, usando las tijeras, suprimir y eliminar el 50% o el 90% de íleon.
   Nota: Para la cirugía del impostor, no realice la ligadura de la arteria mesentérica superior y no retire el íleo.
8. Irrigue el lumen de ambos extremos ileales con solución salina al 0.9%.
   Nota: como el íleo intacto restantes todavía está recibiendo un suministro normal de sangre desde la arteria mesentérica superior, una pequeña cantidad de sangre saldrán hacia fuera durante el proceso. Esto también indica que el suministro de sangre a los extremos ileales es normal y no garantiza isquemia durante el procedimiento de la anastomosis ( figura 1 G).
9. Ubicar los entresijos del lado de ambos extremos ileales. Alinee los entresijos y suturar los extremos ileales con sutura 8-0 ( figura 1 G - H).
10. Sutura de la parte contralateral del íleo para evitar el íleo anastomosada de forma natural ( figura 1 ).
11. Sutura los lados superiores e inferiores entre las dos suturas originales a bien unir los dos ileal extremos juntos ( figura 1 J).
12. Confirmar que no hay ninguna salida desde el sitio de la anastomosis después de terminar el procedimiento de sutura de tres pasos ( figura 1 G-I). Volver el intestino ciego y el intestino en la cavidad abdominal a la localización anatómica original. Lave el área quirúrgica con solución salina 0.9% tibia utilizando una aguja Roma. ( figura 1 K).
13. Cerrar la incisión de la capa de músculo abdominal con sutura 6-0. Alinee la incisión de la piel abdominal con unas pinzas y sutura de la piel abdominal para facilitar la óptima cicatrización de heridas ( figura 1 L).

3. Cuidados postoperatorios

ratones

1. transferencia después de la cirugía a la unidad de cuidados intensivos para recuperación. Alojarlos en una jaula de la ropa de cama de papel sobre una almohadilla de calefacción de temperatura controlada para continuar la recuperación después de la cirugía durante la noche. Ratones con alimentos blandos además de comida regular y el agua de la fuente.
2. Administra buprenorfina (0.05 - 0.1 mg/kg) con la inyección subcutánea cada 8-12 h para la analgesia.
   Nota: Eutanasia ratones por CO ₂ si severamente enfermo.
3. En el punto final, sacrificar ratones utilizando muestras overdosed de isoflurano y cosecha según sea necesario (sección 4).

4. Evaluación de sobreacumulación de bilis inducida por Ileectomy

1. pesan y diseccionar los ratones un día después de una resección de 0% (falso), 50% o el 90% de íleon.
2. Retirar el tracto gastrointestinal y pésalo. Calcular el peso de GI al cociente de peso corporal para evaluar la gravedad de la malabsorción de sales biliares y sobreacumulación.
3. Transferencia de los tractos GI en tubos cónicos de 15 mL y cortarlas en segmentos cortos con unas tijeras. Después del corte, centrifugar a 3.000 x g durante 10 minutos transferir el sobrenadante (líquido de GI que contiene sales biliares) a un tubo limpio.
4. Medir el volumen total y el peso de líquido GI y calcular el peso de fluido al cociente de peso tracto GI más evaluar sobreacumulación de bilis en el tracto GI.
5. Determinar la cantidad total de bilis en el sobrenadante por el análisis de ácido biliar como se describe en la referencia ⁸.

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Resultados

Los procedimientos para la ileectomy se muestran en la figura 1. El primer paso incluye preparación de la piel abdominal de ratón, haciendo una incisión abdominal y usando retractores para exponer completamente el intestino (figura 1A-C). A continuación, el ciego de ratón fue localizado (figura 1D); Dado que su tamaño y su forma hacen un hito fácilmente identi...

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Discusión

Para llevar a cabo una exitosa ileectomy, la arteria mesentérica superior debe ligarse por adelantado para bloquear el suministro de sangre al segmento resecting. El segmento de íleon isquémico volverá púrpura oscuro después de la ligadura. El segmento ileal entonces debe ser resecado totalmente. Un suministro normal de sangre se realizará para los extremos retenidos. Esto es esencial para evitar el sangrado e incorrecta eliminación, que puede fácilmente causa fracaso quirúrgico debido a la necrosis isquémica ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection microscope	Olympus	SZ61	For surgery
Animal temperature controller	Physitemp Instruments, Inc.	TCAT-2LV	For body temperature control
Isoflurane anesthetic vaporizer	VetEquip	911104	For anesthesia
Dissection forceps	Fine Science Tools, Inc.	11274-20	For surgery
Scissors	Fine Science Tools, Inc.	14084-08	For surgery
Needle holder	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7882	For surgery
Micro knives-needle blade	Fisher Scientific	10318-14	For surgery
6-0 monofilament suture	Ethicon	1698G	For abdominal skin closure
7-0 silk suture	Ethicon	766G	For ligation
8-0 monofilament suture	Ethicon	1714G	For anastomosis
Surgical sponges	Dynarex Corp.	3333	For surgery
Small cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-118	For surgery
Isoflurane	Piramal Healthcare Limited	66794-013-25	For anasthesia
Buprenorphine hydrochloride	Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals	12496-0757-1	For analgesia
0.9% sodium chloride Injection	B. Braun Medical Inc.	0264-7800-10	For washing/injection
Povidone iodine prep solution	Dynarex Corp.	1413	For skin preparation
Puralube vet ointment	Dechra Veterinary Products	17033-211-38	For eye pretection
Hair remover lotion	Church & Dwight Co., Inc.		For skin preparation
Intensive care unit	ThermoCare	FW-1	For post-surgery recovery
DietGel recovery	ClearH2O	72-06-5022	For post-surgery recovery
Aurum total RNA fatty and fibrous tissue kit	Bio-Rad	7326830	For RNA isolation
iScript reverse transcription supermix for RT-qPCR	Bio-Rad	1708841	For reverse transcription assay
TaqMan fast advanced master mix	Applied Biosystems/Life Technologies	4444965	For QPCR analysis
Total bile acid assay kit	Genzyme Diagnostic	DZ042A-K01	For bile acid assay
C57BL/6J	The Jackson Laboratory