Overaccumulation induzida por Ileectomy biliares no intestino de rato

Resumo

Reabsorção de ácidos biliares de intestino-dependente e feedback a inibição da síntese hepática de ácidos biliares é importante para a saúde e homeostase sistêmica. Neste estudo, descrevemos um modelo do rato para ressecção ileal avaliar a toxicidade no intestino de rato, overaccumulation e má-absorção induzida por ileectomy biliar.

Resumo

Ressecção intestinal é uma abordagem terapêutica comum para doenças humanas tais como a obesidade, doença inflamatória intestinal, doença de Crohn e câncer de cólon que muitas vezes resulta em do intestino curto grave síndrome, como os efeitos adversos incluindo diarreia de ácidos biliares, desidratação, distúrbios do eletrólito e má absorção de nutrientes. Aqui apresentamos um modelo murino de ressecção ileal, denominado ileectomy, para avaliar a comunicação de tecido e a manutenção da homeostase sistêmica. Após a ressecção ileal, circulação de sangue é permanentemente desprovida do hormônio endócrino específicas do íleo fator de crescimento 15 (FGF15), que libera sua endócrino inibição da síntese de ácidos biliares no fígado. Em combinação com o aumento da produção e abolida a reabsorção de ácidos biliares após remover o íleo, ratos que se submeteram à cirurgia sofrem overaccumulation de sais biliares no intestino e diarreia associada, morbidade e mortalidade. Romance de uso do modelo cirurgia introduzido neste estudo pode fornecer insights mecanicistas e funcionais sobre ileal controle da regulação metabólica sistêmica na fisiologia e na doença.

Introdução

Na investigação biomédica moderna, modelos animais geneticamente manipulados são amplamente utilizados para respigar insights sobre doenças humanas. Em particular, tecido ou célula específica ganho e perda de funções dos genes têm sido costumava estudar Regulamento molecular, bem como efeitos biológicos induzidos. Apesar dos avanços em manipular o alvo genes na vivo, existem limitações persistentes. Primeiro, muitas células ou tecidos exclusões específicas afetará múltiplos órgãos. Por exemplo, exclusão de gene epiteliais eliminará a expressão no epitélio de vários tecidos. Além disso, mesmo se a exclusão é restrita a um tecido específico, controle espacial é raramente viável. Por exemplo, em um tecido como o intestino, segmentos distintos realizar funções muito específicas que não podem ser manipuladas com precisão na vivo. Nessas situações, a ressecção dos tecidos contendo gene é considerada uma abordagem mais eficiente de estudar para determinar o significado mecanicista e funcional da comunicação de tecido.

Ileectomy é principalmente usado em pacientes com Crohn e doenças inflamatórias envolvendo o íleo distal ^1,2,3. O íleo normalmente produz vários hormônios de armazenamento de energia como fator de crescimento fibroblástico 15/19 (FGF15/19), peptídeo YY (PYY) e o glucagon-like peptide 1/2 (GLP1/2); Esses hormônios desempenham importantes funções locais e endócrinas em muitas funções biológicas^4,5,6. Entre esses hormônios, FGF15 foi identificado como um robusto endócrino inibidor da síntese de ácidos biliares no fígado. Depois reabsorvido enterócitos ileais, ácidos biliares ativar o receptor de farnesoid X receptor nuclear (FXR) para estimular a expressão de Fgf15 , que posteriormente leva a inibição de feedback de de síntese hepática de ácidos biliares ⁷. Em um estudo recente, introduzimos o modelo de ileectomy do rato para estudar o ileal Kruppel-como fator 15 (KLF15) -Fgf15 eixo que regula a produção de circadiano ácidos biliares no fígado ⁸de sinalização. Mais importante ainda, introduzimos uma família romance, os fatores Kruppel-como, particularmente KLF15, em biologia de ácidos biliares. Com base em estudos funcionais, incluindo cirurgia ileectomy, determinamos essa síntese de ácidos biliares upregulates KLF15 através de um mecanismo de não-hepática indireto. Finalmente, KLF15 ileal é também identificado como o primeiro regulador negativo endógeno de Fgf15.

Os segmentos intestinais, descendente de proximal para distais regiões são responsáveis pela absorção de nutrientes diferentes. O íleo é o principal segmento responsável por ácidos biliares e vitamina B₁₂ (V_B12) absorção ⁹. Um estudo mais adiantado empregou um modelo do rato da ressecção de intestino proximal para estudar a síndrome do intestino curto; vários comprimentos de ressecção, dietas e tipos de sutura foram propostos para manter um ótimo pós-operatório de sobrevivência taxa ¹⁰. Além disso, uma revisão mais recente indica que ressecção ileal geralmente resulta em doença mais grave do que outros ressecções de segmento gastrointestinais (GI) por causa da diminuição da capacidade adaptativa do restante do trato ¹¹. Este tópico tem ganhado intensivos interesses de grupos de pesquisa básica e clínica, Considerando que a compreensão da recuperação e as abordagens terapêuticas eficazes são ainda limitados.

Diarreia de ácidos biliares resulta de desequilíbrios na homeostase de ácidos biliares na circulação entero-hepática ^12,13. Pode ser uma consequência da ressecção ileal, doença gastrintestinal ou um resultado da má absorção de ácidos idiopática. Mais de 80% dos pacientes foram encontrados para apresentar com diarreia depois de submetidos a ressecção ileal ¹⁴. Ileectomy tem o potencial para ser um modelo de cirurgia importante para a investigação de diarreia de ácidos biliares. Neste estudo, uma série de ressecções ileais fornecer uma avaliação gradiente de deficiência de FGF15, bem como má absorção intestinal de sais biliares, overaccumulation e danos tóxicos.

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Protocolo

protocolo animal foi revisado e aprovado pelo Comitê de uso caso Western Reserve University School of Medicine e institucional Cuidado Animal e foi conduzido de acordo com o National Institutes of Health (NIH) guia para a Cuidado e uso de animais de laboratório (8ª edição, 2011). Os ratos foram sacrificados pelos métodos compatíveis com as diretrizes do American veterinária Medical Association (AVMA) para eutanásia de animais (edição de 2013). Camundongos machos, de 8-16 semanas C57Bl/6J, foram utilizados no presente protocolo. Os ratos foram alojados em um ambiente de ciclo claro/escuro de 12 h.

1. pré-operatório preparação

1. ratos de transferência para uma gaiola limpa 24 h antes do procedimento. São permitidos animais livre acesso à água. Substitua a comida comida comida macia (gel de suplemento dietético) 4-6 h antes da cirurgia para reduzir o conteúdo do intestino para a cirurgia.
2. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos e preparar o material cirúrgico estéril de uso único. Limpe a área de cirurgia e o cone de nariz anestésico com etanol a 70%.
3. Configurar um microscópio de dissecação, isoflurano anestésico vaporizador, instrumentos e uma temperatura controlada pequena animal mesa cirúrgica para a manutenção de temperatura do corpo. Organizar os instrumentos, suturas e seringas em um local para acesso gratuito durante a cirurgia.
4. Configurar uma fonte de luz para fornecer luz suficiente para a área cirúrgica.
5. Preparar a solução salina 0,9% estéril em seringa de 5 mL para limpeza intestinal e abdominal.

2. Ileectomy e anastomose

1. Anesthetize ratos com isoflurano (2-3%) em uma câmara de incubação de animais pequenos. Determinar a anesthetization adequada, usando a técnica de pitada de dedo do pé, enquanto o animal está no isoflurano.
2. Remover cabelo abdominal, aplicando o produto de remoção de cabelo e limpar o cabelo usando esponjas cirúrgicas, mantendo a anestesia. Coloque o mouse sobre um controle de temperatura pequeno animal mesa cirúrgica ( Figura 1 A) para manter a temperatura corporal em anestesia de manter 37 ° C. com isoflurano (1-2%) através de uma máscara. Tratar os olhos de rato com pomada ocular.
3. Limpar a pele usando iodo-povidona e 70% de álcool e cobrir a área cirúrgica do abdome com gaze estéril cirúrgica ( Figura 1 B).
4. Fazer uma incisão abdominal usando um bisturi cirúrgico, uma vez que a anestesia está em vigor. Use um cotonete para proteger o intestino e puxar rato abdominal músculo com retractores totalmente aberto e expor na cavidade abdominal ( Figura 1 C).
5. Localizar o ceco. A partir do ceco, deslocar cuidadosamente o íleo conectado e parte do jejuno fora da cavidade abdominal ( Figura 1 D).
   Nota: O ceco pode ser facilmente identificado devido à sua grande dimensão mesmo após jejum.
6. Ligate o ramo superior da artéria mesentérica superior com uma sutura de seda de 7-0 para obstruir o sangue, fornecendo o segmento ileal que deve ser extirpado. A ileal alterações cor de rosa para roxo escuro depois da ligadura. ( Figura 1 E - F).
7. Dependendo da finalidade do experimento, com uma tesoura, impostos especiais de consumo e retire 50% ou 90% de íleo.
   Nota: Para a cirurgia de farsa, não realizar a ligadura da artéria mesentérica superior e não remova o íleo.
8. , Irrigue o lúmen de ambas as extremidades ileais com soro fisiológico a 0,9%.
   Nota: como o íleo intacto restante ainda está recebendo um suprimento de sangue normal da artéria mesentérica superior, uma pequena quantidade de sangue também é expelida durante o processo. Isso também indica que o fornecimento de sangue para as extremidades ileais é normal e garante sem isquemia durante o procedimento de anastomose ( Figura 1 G).
9. Localizar as mesenteries do lado de ambas as extremidades ileais. Alinhar os mesenteries e suturar as extremidades ileais juntos usando sutura 8-0 ( Figura 1 G - H).
10. Sutura do lado contralateral do íleo para manter o íleo anastomosado em uma maneira natural ( Figura 1 eu).
11. Suturar os lados superiores e inferiores, entre as duas suturas originais para completamente unir os dois ileal termina juntos ( Figura 1 J).
12. Confirmar que não há nenhum escapamento do local da anastomose depois de terminar o procedimento de sutura de três etapas ( Figura 1 G-eu). Retorne o ceco e intestino na cavidade abdominal para a localização anatômica original. Lave a área da cirurgia com solução salina 0,9% quente usando uma agulha. ( Figura 1-K).
13. Fechar a incisão da camada muscular abdominal com sutura de 6-0. Alinhe a incisão da pele abdominal usando fórceps e sutura da pele abdominal para facilitar a cicatrização de feridas ideal ( Figura 1 L).

3. Cuidados pós-operatórios

ratos de

1. o pós-operatório de transferência para uma unidade de terapia intensiva para recuperação. Colocá-los em uma gaiola de papel-roupas de cama em uma almofada de aquecimento temperatura controlada para continuar a recuperação pós-cirurgia durante a noite. Fornecemos os ratos com comida macia, além de água e comida normal.
2. Administrar buprenorfina (0,05 - 0,1 mg/kg) com injeção subcutânea a cada 8-12 h para analgesia.
   Nota: Eutanásia em ratos pelo CO ₂ se severamente doente.
3. No ponto final, sacrificar os ratos usando uma overdose de isoflurano e colheita de amostras conforme necessário (secção 4).

4. Avaliação de Overaccumulation de Bile induzida por Ileectomy

1. pesar e dissecar os ratos um dia após uma ressecção de 0% (sham), 50% ou 90% de íleo.
2. Remover o trato Gastrintestinal e pesá-lo. Calcular o peso de GI a relação do peso de corpo para avaliar a gravidade da má absorção de sais biliares e overaccumulation.
3. Transferir o trato GI para tubos cônico de 15 mL e corte-as em segmentos curtos com uma tesoura. Após o corte, centrifugar 3.000 x g por 10 min. Transfira o sobrenadante (GI fluido contendo sais biliares) para um tubo limpo.
4. Medir o volume total e o peso de fluido de GI e calcular o peso de fluido à relação de peso do trato GI para avaliar overaccumulation bile no trato GI.
5. Determinar a quantidade total de bile no sobrenadante por ensaio de ácidos biliares, conforme descrito na referência ⁸.

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Resultados

Os procedimentos para ileectomy são mostrados na Figura 1. A primeira etapa inclui a preparar a pele abdominal de rato, fazendo uma incisão abdominal e utilizando retractores expor totalmente o intestino (Figura 1A-C). Em seguida, se localizava o ceco de rato (Figura 1D); dado que o seu tamanho e forma tornam um marco facilmente identificável. O ceco, íleo e part...

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Discussão

Para realizar uma ileectomy bem sucedida, a artéria mesentérica superior deve ser ligada com antecedência para bloquear o suprimento de sangue ao segmento resecting. O segmento ileal isquêmico girará roxo escuro depois da ligadura. O segmento ileal, então deve ser completamente ressecado. Assegurar um suprimento de sangue normal para as extremidades retidas. Isto é essencial para evitar a remoção inadequada e sangramento, que pode facilmente causa falha cirúrgica devido à necrose isquêmica após a sutura. Dur...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection microscope	Olympus	SZ61	For surgery
Animal temperature controller	Physitemp Instruments, Inc.	TCAT-2LV	For body temperature control
Isoflurane anesthetic vaporizer	VetEquip	911104	For anesthesia
Dissection forceps	Fine Science Tools, Inc.	11274-20	For surgery
Scissors	Fine Science Tools, Inc.	14084-08	For surgery
Needle holder	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7882	For surgery
Micro knives-needle blade	Fisher Scientific	10318-14	For surgery
6-0 monofilament suture	Ethicon	1698G	For abdominal skin closure
7-0 silk suture	Ethicon	766G	For ligation
8-0 monofilament suture	Ethicon	1714G	For anastomosis
Surgical sponges	Dynarex Corp.	3333	For surgery
Small cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-118	For surgery
Isoflurane	Piramal Healthcare Limited	66794-013-25	For anasthesia
Buprenorphine hydrochloride	Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals	12496-0757-1	For analgesia
0.9% sodium chloride Injection	B. Braun Medical Inc.	0264-7800-10	For washing/injection
Povidone iodine prep solution	Dynarex Corp.	1413	For skin preparation
Puralube vet ointment	Dechra Veterinary Products	17033-211-38	For eye pretection
Hair remover lotion	Church & Dwight Co., Inc.		For skin preparation
Intensive care unit	ThermoCare	FW-1	For post-surgery recovery
DietGel recovery	ClearH2O	72-06-5022	For post-surgery recovery
Aurum total RNA fatty and fibrous tissue kit	Bio-Rad	7326830	For RNA isolation
iScript reverse transcription supermix for RT-qPCR	Bio-Rad	1708841	For reverse transcription assay
TaqMan fast advanced master mix	Applied Biosystems/Life Technologies	4444965	For QPCR analysis
Total bile acid assay kit	Genzyme Diagnostic	DZ042A-K01	For bile acid assay
C57BL/6J	The Jackson Laboratory