回肠致胆汁积滞在小鼠肠道中

摘要

小肠依赖胆汁酸的重吸收和反馈抑制肝胆汁酸合成系统稳态和健康至关重要。在此研究中，我们描述为回肠切除回肠致胆汁吸收不良，积滞，和毒性小鼠肠道中的小鼠模型。

摘要

肠段切除术是常见的治疗方法，为人类的疾病，如肥胖、 炎症性肠病、 克罗恩病和结肠癌，往往导致严重的短肠综合征样不良反应包括胆汁酸腹泻脱水、 电解质紊乱、 营养吸收不良。在这里我们介绍一种小鼠回肠切除模型，称为回肠，评价组织通信和系统稳态的维持。回肠切除术后血液循环是永久没有回肠特定内分泌激素成纤维细胞生长因子 15 (FGF15)，释放出肝脏的胆汁酸合成及其内分泌抑制。与增加的生产和胆汁酸后删除回肠的废除的吸收相结合，接受手术的老鼠患胆盐积滞在肠和相关性的腹泻、 发病率和死亡率。小说使用的这项研究中引入的手术模型可能洞察机械和功能回肠控制的系统性代谢调控的生理和疾病。

引言

在现代生物医学研究中，基因操纵的动物模型被广泛的应用，以收集洞察人类疾病。尤其是，组织或细胞特异性基因的增益损失功能已被用于研究分子调控，以及诱发的生物学效应。尽管操纵目标基因在体内的进步，有挥之不去的限制。第一，许多细胞或组织的特定缺失会影响多个器官。例如上, 皮基因缺失将消除多种组织中上皮细胞的表达。此外，即使删除仅限于为特定的组织，空间的控制是很少可行的。例如，在像肠组织，不同的部分进行十分具体的职能不能操纵与精度的体内。在这些情况下，基因包含组织切除术被认为是更有效的学习方法，以确定组织传播的机械和功能意义。

回肠是克罗恩病的主要是用于的患者和涉及回肠^1，，23的炎症性疾病。回肠通常会产生几个能量存储激素样成纤维细胞生长因子 15/19 (FGF15/19)、 肽 (PYY) 和胰高血糖素样肽-1/2 (GLP1/2);这些激素许多生物学功能^4，，56中发挥了重要的地方和内分泌作用。这些激素间 FGF15 已被确定为肝脏的胆汁酸合成鲁棒内分泌抑制剂。一旦进入回肠肠吸收，胆汁酸激活核受体法尼酯 X 受体 (FXR) 来刺激Fgf15的表达，随后导致的肝胆汁酸合成⁷反馈抑制。在最近的一项研究中，我们介绍了小鼠回肠模型为研究回肠 kruppel 样因子 (KLF15) 15-Fgf15信号调节昼夜节律的胆汁酸生产中肝⁸的轴。最重要的是，我们新的家庭，kruppel 样因子，特别是 KLF15，引入胆汁酸生物学。我们决定通过一种间接的非肝机制，KLF15 上调胆汁酸合成包括回肠手术的功能研究的基础。最后，回肠 KLF15 也被称为Fgf15第一内源性负性调节。

从近端到远端区域降序的肠段是负责吸收不同的营养。回肠是负责胆汁酸和维生素 B₁₂ (V_B12) 吸收⁹的主要部分。早先的研究中采用小鼠模型的近端肠切除术研究短肠综合征;提出了各种切除长度、 饮食和缝合类型，以保持最佳的手术后生存率¹⁰。此外，最近的审查表明，回肠切除通常会导致更严重的疾病比其他胃肠道 (GI) 段切除术由于剩余道¹¹的自适应能力下降。本主题获得了集约化利益的基础和临床研究群体，而复苏和有效的治疗方法的了解仍然很有限。

胆汁酸腹泻结果从胆汁酸肝肠循环^12，13稳态失衡。它可以是回肠切除术、 胃肠道疾病，或结果特发性胆汁酸吸收不良的后果。已发现了超过 80%的患者，切除回肠切除¹⁴后提出与腹泻。回肠有潜力成为重要手术模型为胆汁酸腹泻的调查。在此研究中，回肠切除一系列提供梯度评估 FGF15 不足以及肠胆盐吸收不良、 积滞和毒性损害。

研究方案

动物议定书 》 进行了审查和批准机构动物护理和使用委员会在凯斯西储大学医学院和按照国家卫生研究院 (NIH) 指南进行维护和使用的实验室动物 （2011 年第 8 版）。小鼠处死的方法符合美国兽医医疗协会 (AVMA) 准则为动物安乐死 （2013年版）。在本议定书中使用 C57BL/6J，男，8-16 周老小鼠。老鼠被安置在 12 h 黑暗/光照周期环境。

1.手术前准备

1. 转移小鼠到干净的笼子在手术前 24 小时。让动物免费的水。周食物替换软食物 （凝胶膳食补充剂） 4-6 小时前手术，以减少的小肠手术内容。
2. 消毒所有的外科手术器械、 一次性使用无菌手术材料准备。清洁手术范围和麻醉的鼻锥，用 70%乙醇。
3. 成立于解剖显微镜、 异氟醚麻醉汽化、 文书和温度控制小动物外科表体温度的保养。在手术期间组织文书、 缝线和注射器中自由访问的位置。
4. 设置光源为外科领域提供足够的光线。
5. 准备在 5 毫升注射器的肠道和腹部清洁无菌 0.9%的生理盐水。

2。回肠和吻合

1. Anesthetize 小鼠与异氟醚 （2-3%) 在小动物的孵化室。确定适当的麻醉用脚趾夹点技术，虽然这种动物是对异氟醚。
2. 采用脱毛产品脱毛腹部和擦干头发去维持麻醉时使用外科纱布。温度控制小动物在手术台上 ( 图 1) 以维持体温 鼠标置于 37 ° C.维持麻醉与异氟醚 （1-2%) 通过面罩。治疗老鼠的眼睛，用眼药膏。
3. 清洁皮肤使用聚维酮碘和 70%的酒精和覆盖与无菌手术纱布 ( 图 1 B) 腹部手术区域。
4. 使使用外科手术刀，一旦麻醉实际上是正中腹部切口。使用棉签来保护肠道和拉鼠标腹直肌与牵开器完全打开并公开 ( 图 1 C) 腹腔。
5. 定位盲肠。从盲肠，开始小心翼翼地连接的回肠和空肠的一部分从腹腔内 ( 图 1 D).
   注: 盲肠容易被人识别由于规模庞大禁食后甚至。
6. 结扎肠系膜上动脉与 7-0 丝线以阻塞血供是切除回肠段上面的分支。回肠颜色变化从粉色到深紫色结扎后。( 图 1 E-F)。
7. 根据不同目的的实验中，利用剪刀，消费税和删除 50%或 90%的回肠。
   注: 为假手术，不执行肠系膜上动脉结扎并不删除回肠。
8. 冲洗的 0.9%生理盐水回肠两端管腔.
   注: 由于其余完好回肠仍在收集血液供应正常从肠系膜上动脉，极少量的血将会刷新过程。这也表明回肠末端的血液供应是正常的并确保没有缺血过程中吻合 ( 图 1 G)。
9. 定位在回肠两端直肠系膜。对齐的肠系膜和缝合在一起使用 8-0 缝合 ( 图 1 G-H) 回肠末端。
10. 缝合回肠保持回肠的对侧侧吻合以自然的方式 ( 图 1 我)。
11. 缝合上部和下部的双方之间两个原始缝合到彻底联接两个回肠末端在一起 ( 图 1 J)。
12. 确认是完成三个步骤的缝合后有无渗漏吻合部位 ( 图 1 G-我)。回盲肠和小肠入腹腔的原始的解剖位置。使用钝针的温暖 0.9%生理盐水清洗手术的地方。( 图 1 K)。
13. 关闭腹部肌肉层与 6-0 缝合的切口。对齐使用产钳的腹部皮肤切口和缝合腹部的皮肤，以便优化伤口愈合 ( 图 1 L)。

3。术后护理

1. 转移手术后小鼠对重症监护病房的恢复。他们房子温控加热垫，一夜之间继续手术后恢复的纸-床上用品笼子里。供应小鼠软的食物，除了常规的食物和水。
2. 管理丁丙诺啡 (0.05-0.1 mg/kg) 与皮下注射每 8-12 h 为镇痛。
   注: 安乐死老鼠的 CO ₂，如果严重生病。
3. 在终点处，牺牲小鼠使用超剂量异氟醚和收获的样本，根据需要 （第 4 节）。

4。评价的回肠致胆汁积滞

1. 权衡和解剖小鼠的 0%(sham)、 50%或 90%的回肠切除术后的一天。
2. 删除胃肠道和衡量它。计算 GI 重量和身体重量比例来评估的严重性胆盐吸收不良和积滞。
3. 将消化道转移到 15 毫升锥形管和把它们切成小段，用剪刀。切割后，10 分钟在 3,000 x g 离心机转移 （GI 液含胆汁酸盐） 上清液到清洁管。
4. 测量的总体积和重量的 GI 流体和计算胃肠道重量比，以便进一步评估胆积滞在胃肠道中的流体的重量。
5. 确定总胆汁量上清液中的胆汁酸测定在参考 ⁸ 所述。

结果

回肠的程序如图 1所示。第一步包括制备小鼠腹部皮肤，使腹部的切口，并利用牵开器充分暴露肠 (图 1A C)。接下来，鼠标盲肠是位于 (图 1D);给出了它的大小和形状使其很容易辨认的一个里程碑。盲肠、 回肠与远端空肠的一部分被曝光并移除从腹腔内 (图 1

讨论

为了执行成功的回肠，必须预先结扎肠系膜上动脉来阻止对切除部分的血液供应。缺血性回肠段结扎后会变成暗紫色。然后必须完全切除回肠段。保留的两端必须保证正常的血液供应。这是必须避免出血和不当的去除，这可以很容易地导致手术失败由于缺血性坏死后缝合。期间吻合，它是重要的回肠末端一起加入他们自然的解剖位置。肠系膜被认为是为初始的缝合线，以避免可能发生的扭曲两端?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection microscope	Olympus	SZ61	For surgery
Animal temperature controller	Physitemp Instruments, Inc.	TCAT-2LV	For body temperature control
Isoflurane anesthetic vaporizer	VetEquip	911104	For anesthesia
Dissection forceps	Fine Science Tools, Inc.	11274-20	For surgery
Scissors	Fine Science Tools, Inc.	14084-08	For surgery
Needle holder	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7882	For surgery
Micro knives-needle blade	Fisher Scientific	10318-14	For surgery
6-0 monofilament suture	Ethicon	1698G	For abdominal skin closure
7-0 silk suture	Ethicon	766G	For ligation
8-0 monofilament suture	Ethicon	1714G	For anastomosis
Surgical sponges	Dynarex Corp.	3333	For surgery
Small cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-118	For surgery
Isoflurane	Piramal Healthcare Limited	66794-013-25	For anasthesia
Buprenorphine hydrochloride	Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals	12496-0757-1	For analgesia
0.9% sodium chloride Injection	B. Braun Medical Inc.	0264-7800-10	For washing/injection
Povidone iodine prep solution	Dynarex Corp.	1413	For skin preparation
Puralube vet ointment	Dechra Veterinary Products	17033-211-38	For eye pretection
Hair remover lotion	Church & Dwight Co., Inc.		For skin preparation
Intensive care unit	ThermoCare	FW-1	For post-surgery recovery
DietGel recovery	ClearH2O	72-06-5022	For post-surgery recovery
Aurum total RNA fatty and fibrous tissue kit	Bio-Rad	7326830	For RNA isolation
iScript reverse transcription supermix for RT-qPCR	Bio-Rad	1708841	For reverse transcription assay
TaqMan fast advanced master mix	Applied Biosystems/Life Technologies	4444965	For QPCR analysis
Total bile acid assay kit	Genzyme Diagnostic	DZ042A-K01	For bile acid assay
C57BL/6J	The Jackson Laboratory