Ileectomy-induced מרה Overaccumulation במעי העכבר

Summary

חומצות מרה תלויי-המעי הדק התחדשות וניגוד משוב של סינתזה של חומצות מרה הכבד חשוב הומאוסטזיס מערכתית ובריאות. במחקר זה, נתאר מודל העכבר עבור כריתה ileal להעריך malabsorption מרה הנוצרות על-ידי ileectomy, overaccumulation, ורעילות במעי העכבר.

Abstract

כריתה מעי היא גישה טיפולית משותפת עבור מחלות אנושיות כגון השמנת יתר, מחלות מעי דלקתיות, קרוהן, סרטן המעי הגס, כי לעתים קרובות התוצאות תופעות לוואי של כמו תסמונת המעי הקצר חמורות כולל חומצות מרה שלשולים, התייבשות הפרעות אלקטרוליט, תת ספיגה של מזון. כאן אנו מציגים מודל כריתה ileal מאתר, הנקרא ileectomy, כדי להעריך את רקמת תקשורת ותחזוקה של הומאוסטזיס מערכתית. לאחר כריתה ileal, כלי-דם נטול לצמיתות מעי ספציפיות הורמון האנדוקרינית פיברובלסט גורם גידול 15 (FGF15), אשר משחרר את עיכוב endocrinal של סינתזה של חומצות מרה בכבד. בשילוב עם ייצור מוגבר, ביטל התחדשות של חומצות מרה לאחר הסרת מעי, עכברים נותח סובלים מלח מרה overaccumulation של המעי, משויכת שלשול, התחלואה והתמותה. השימוש הרומן של המודל לניתוח הציגה מחקר זה עשוי לספק תובנות מכניסטית ופונקציונליים ileal שליטה מערכתית רגולציה חילוף החומרים בפיזיולוגיה ומחלות.

Introduction

במחקר ביו-רפואי מודרני, חייתיים גנטי מנוצלים נרחב כדי ללקט תובנות מחלות אנושיות. בפרט, רקמות או פונקציות ייחודיות תא רווח-הפסד של גנים שימשו ללמוד תקנה מולקולרית, כמו גם השפעות ביולוגיות המושרה. למרות החידושים מניפולציה היעד גנים ויוו, קיימות מגבלות מתמשכת. ראשון, הרבה תאים או רקמות ספציפיות מחיקות ישפיעו על איברים מרובים. לדוגמה, מחיקת הגן אפיתל יבטל ביטוי epithelia של רקמות מרובים. עוד יותר, גם אם המחיקה היא מוגבלת לרקמות ספציפיות, השליטה במרחב הוא לעיתים רחוקות ריאלי. לדוגמה, בטישו כמו המעי, מקטעים נפרדים לבצע פונקציות ספציפיות מאוד זה לא יכול להיות מניפולציות עם דיוק ויוו. במצבים אלה, נחשב כריתה של הרקמות המכילות ג'ין בגישה לימוד יעיל יותר כדי לקבוע את המשמעות מכניסטית ופונקציונליים של רקמות תקשורת.

Ileectomy היא בעיקר בשימוש חולי קרוהן ומחלות דלקתיות המערבים את^{2, 1,}מעי דיסטלי³. מעי בדרך כלל מייצר מספר הורמונים אחסון אנרגיה כמו פיברובלסט גורם גידול 15/19 (FGF15/19), פפטיד YY (PYY) ופפטיד דמוי גלוקגון 1/2 (GLP1/2); הורמונים אלה תפקיד חשוב האנדוקרינית ומקומיים רבים תפקודים ביולוגיים^4,5,6. בין אלה ההורמונים, זוהה FGF15 מעכב האנדוקרינית חזקים של סינתזה של חומצות מרה בכבד. ברגע נספג מחדש לתוך ileal enterocytes חומצות מרה להפעיל את הקולטן farnesoid X קולטן הגרעין (FXR) כדי לעורר את הביטוי Fgf15 , אשר מוביל לאחר מכן משוב עיכוב של סינתזה של חומצות מרה בכבד ⁷. במחקר שנערך לאחרונה, הצגנו את המודל ileectomy העכבר ללימוד הגורם kruppel דמוי ileal 15 (KLF15) -Fgf15 איתות ציר המסדירה ייצור חומצות מרה היממה הכבד ⁸. והכי חשוב, הצגנו משפחה הרומן, הגורמים כמו kruppel, במיוחד KLF15, חומצות מרה לביולוגיה. על סמך מחקרים תפקודית כולל ניתוח ileectomy, קבענו את סינתזה חומצות מרה upregulates KLF15 באמצעות מנגנון שאינו ולשננו עקיף. לבסוף, ileal KLF15 גם מזוהה המתקן הראשון שלילי אנדוגני של Fgf15.

הקטעים המעי היורד proximal לאזורים דיסטלי אחראים ספיגת חומרים מזינים שונים. מעי היא קטע מרכזי אחראי חומצות מרה וויטמין B₁₂ (V_B12) הקליטה ⁹. מחקר קודם המועסקים דגם העכבר של הבטן proximal כריתה ללמוד תסמונת המעי הקצר; שונים באורכים כריתה, דיאטות וסוגי תפירה הוצעו כדי לשמור על קצב של האופטימלית הישרדות לאחר הניתוח ¹⁰. יתר על כן, סקירה עדכנית יותר מציין שכי כריתה ileal בדרך כלל מתבטא במחלות חמורות יותר מאשר שאר כריתות קטע במערכת העיכול (GI) בגלל יכולת אדפטיבית ירד מ בדרכי הנותרים ¹¹. נושא זה צבר אינטנסיבית האינטרסים של קבוצות מחקר בסיסי וקליני, ואילו ההבנה של שחזור וגישות טיפוליות יעיל הן עדיין מוגבל.

שלשול חומצות מרה היא תוצאה של חוסר איזון של חומצות מרה הומאוסטזיס enterohepatic ^12,של מחזור¹³. זה יכול להיות תוצאה של כריתה ileal, מחלות במערכת העיכול או תוצאה של תת ספיגה של חומצות מרה אידיופטית. יותר מ- 80% מהחולים נמצאו להציג עם שלשול לאחר שעברו כריתה ileal ¹⁴. Ileectomy יש את הפוטנציאל להיות מודל ניתוח חשוב עבור החקירה של חומצות מרה שלשול. במחקר זה, סדרה של כריתות ileal לספק הערכה הדרגתי של מחסור FGF15, כמו גם תת ספיגה של מלח מרה מעיים, overaccumulation נזקים רעילים.

Protocol

בעלי חיים פרוטוקול נבדקה, אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועד שימוש Case Western Reserve הספר לרפואה של אוניברסיטת, נערך על פי המדריך הלאומית המכונים לבריאות (NIH) טיפול ושימוש של חיות מעבדה (המהדורה השמינית, 2011). עכברים היו מורדמים על ידי שיטות תואם ההנחיות אמריקאי וטרינרי רפואי האגודה (AVMA) המתת חסד של בעלי חיים (2013 מהדורה). עכברים בשבוע 8-16 בן זכר, C57BL/6J, שימשו פרוטוקול זה. עכברים שוכנו בסביבה כהה/אור מחזור 12 h.

1. הכנה מראש פעיל

1. עכברים העברת לכלוב נקי 24 שעות לפני ההליך. לאפשר חיות גישה חופשית למים. החלף צ'או מזון מזון רך (תוסף תזונה ג'ל) 4-6 שעות לפני הניתוח כדי להפחית את התוכן של המעי הדק לניתוח.
2. לעקר כל מכשירי ניתוח והכן החומרים כירורגי סטרילי חד-פעמיים. לנקות את אזור הניתוח והחרוט האף הרדמה עם אתנול 70%-
3. להגדיר מיקרוסקופ לנתיחה, מאדה הרדמה איזופלוריין, כלי נגינה, מבוקרי טמפרטורה בעלי חיים כירורגי שולחן קטן לתחזוקה טמפרטורת הגוף. לארגן כלי נגינה, תפרים, מזרקים במיקום עבור גישה חופשית במהלך הניתוח.
4. להגדיר את מקור אור כדי לספק מספיק אור עבור האזור כירורגי.
5. הכנת מלח סטרילית 0.9% במזרק מ לניקוי המעיים והבטן.

2. Ileectomy והשקה

1. Anesthetize עכברים עם איזופלוריין (2-3%) בחדר דגירה בעלי חיים קטנים. לקבוע ההרדמה נאותה בטכניקה הבוהן קמצוץ בעוד החיה נמצאת באיזופלוריין.
2. להסיר שיער בטן על-ידי החלת מוצרים להסרת שיער, לנגב את השיער משם באמצעות ניתוח ספוגים תוך שמירה על הרדמה. הצב את העכבר על טמפרטורה מבוקרת בעלי חיים כירורגי שולחן קטן ( איור 1 א') כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ב- 37 מעלות צלזיוס. שמור על הרדמה עם איזופלוריין (1-2%) דרך facemask. לטיפול בעיניים עכבר עם משחה עינית.
3. לנקות את העור באמצעות povidone יוד ו- 70% אלכוהול ולכסות את האזור הכירורגי של הבטן עם גזה סטרילית כירורגי ( איור 1 B).
4. עושים חתך בבטן קו האמצע באמצעות אזמל כירורגי לאחר הרדמה בתוקף. להשתמש המוליך שקצהו כותנה כדי להגן על המעי ולמשוך העכבר שריר הבטן עם רטרקטורים מלא לפתוח ולחשוף את חלל הבטן ( איור 1 ג).
5. אתר המעי. החל מהמעי, הזז בזהירות את מעי מחוברים וחלק מעי צם מתוך חלל הבטן ( איור 1 D).
   הערה: המעי האטום ניתן לזהות בקלות בגלל הגודל שלה גדול גם לאחר צום.
6. מאתרים ומפסיקים את הענף העליון של עורק מצע המעי העליון סופריור 7-0 בתפר משי כדי occlude ויישם על קטע ileal כדי להוציא את הדם. צבע ileal משתנה מורוד כהה לאחר מצדו. (E - F איור 1).
7. בהתאם מטרת הניסוי, באמצעות מספריים, בלו ולהסיר את 50% או 90% של מעי.
   הערה: עבור ניתוח דמה, אל תבצע את מצדו סופריור עורק מצע המעי העליון ואל תסיר מעי.
8. סומק לומן שני הקצוות ileal עם סליין 0.9%.
   הערה: כמו מעי ללא פגע הנותרים עדיין מקבל הספקת דם נורמלי של עורק מצע המעי העליון מעולה, כמות קטנה של דם יבוצע ריקון בתהליך. זה גם מציין כי אספקת הדם הקצוות ileal נורמלי ומבטיחה אין איסכמיה במהלך ההליך השקה ( איור 1 G)-
9. לאתר את mesenteries בצד שני הקצוות ileal. יישר את mesenteries, תפר את הקצוות ileal יחד באמצעות 8-0 בתפר ( איור 1 G - H).
10. תפר הצד contralateral של מעי לשמור מעי anastomosed באופן טבעי ( איור 1 אני).
11. תפר הצד העליון והתחתון בין התפרים המקורי שני ביסודיות צירוף השני ileal הקצוות יחד ( איור 1 J).
12. מאשרים כי קיים אין נזילה מתוך אתר השקה לאחר סיום ההליך הפתולוגיים שלושה שלבים ( איור 1 G-אני). להחזיר את המעי האטום של המעי הדק לתוך חלל הבטן למיקום האנטומי המקורי. לשטוף את אזור הניתוח עם מלחית 0.9% באמצעות מחט בוטה. ( איור 1 K).
13. לסגור את החתך של השכבה שריר הבטן 6-0 בתפר. יישר את החתך בעור בטן באמצעות מלקחיים, תפר בעור בטן כדי להקל על ריפוי הפצע אופטימלית ( איור 1 L).

3. טיפול לאחר הניתוח

1. העברת הניתוח שלאחר עכברים נמרץ להתאוששות. בית אותם בתוך כלוב נייר-מצעים על כרית החימום טמפרטורה מבוקרת כדי להמשיך את ההתאוששות לאחר הניתוח בן לילה. מספקים עכברים עם מזון רך בנוסף מקבלים מזון ומים.
2. לנהל הבופרנורפין (0.05 - 0.1 מ"ג/ק"ג) עם הזרקה תת-עוריים כל ה 8-12 עבור כאבים.
   הערה: המתת חסד עכברים ב- CO ₂ אם חולה קשות.
3. -מובילים, להקריב עכברים באמצעות מנת יתר איזופלוריין ו הקציר דגימות לפי הצורך (סעיף 4).

4. הערכה של Ileectomy-induced מרה Overaccumulation

1. שוקל ומנתחים את העכברים יום אחד לאחר כריתה של 0% (דמה), 50% או 90% של מעי.
2. להסיר GI בדרכי, שוקל אותה. לחשב את המשקל GI ליחס משקל הגוף כדי להעריך את חומרת תת ספיגה של מלח מרה, overaccumulation.
3. להעביר את ספינלי GI לתוך צינורות חרוט 15 מ"ל וחותכים אותם למקטעים קצרים באמצעות מספריים. לאחר חיתוך, צנטריפוגה ב 3000 g x עבור 10 דקות להעביר את תגובת שיקוע (GI נוזל המכיל מלחי מרה) צינור נקי.
4. למדוד את הנפח הכולל ומשקל של נוזל GI ולחשב את משקל נוזל GI בדרכי יחס המשקל להעריך עוד יותר overaccumulation מרה ב- GI בדרכי.
5. לקבוע את הסכום הכולל מרה ב תגובת שיקוע על ידי חומצות מרה assay כפי שמתואר הפניה ⁸.

תוצאות

נהלי ileectomy מוצגים באיור1. השלב הראשון כולל הכנת בעור בטן העכבר, ביצוע חתך בבטן ושימוש רטרקטורים לחשוף באופן מלא את המעי (איור 1A-C). בשלב הבא, המעי העכבר היה ממוקם (איור 1D); נתון כי הגודל והצורה שלה לעשות את זה ?...

Discussion

על מנת לבצע ileectomy מוצלח, עורק מצע המעי העליון מעולה חייב להיות מאתרים מראש כדי לחסום את אספקת הדם קטע resecting. קטע ileal איסכמי יהפוך סגול כהה לאחר מצדו. בטח קטע ileal תור הודעות ' ואז resected לחלוטין. הספקת דם נורמלי והקפדה על יתרת הקצוות. זה חיוני כדי למנוע דימום והסרת פסולים, אשר יכול בקלות לגרום כשל כ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection microscope	Olympus	SZ61	For surgery
Animal temperature controller	Physitemp Instruments, Inc.	TCAT-2LV	For body temperature control
Isoflurane anesthetic vaporizer	VetEquip	911104	For anesthesia
Dissection forceps	Fine Science Tools, Inc.	11274-20	For surgery
Scissors	Fine Science Tools, Inc.	14084-08	For surgery
Needle holder	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7882	For surgery
Micro knives-needle blade	Fisher Scientific	10318-14	For surgery
6-0 monofilament suture	Ethicon	1698G	For abdominal skin closure
7-0 silk suture	Ethicon	766G	For ligation
8-0 monofilament suture	Ethicon	1714G	For anastomosis
Surgical sponges	Dynarex Corp.	3333	For surgery
Small cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-118	For surgery
Isoflurane	Piramal Healthcare Limited	66794-013-25	For anasthesia
Buprenorphine hydrochloride	Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals	12496-0757-1	For analgesia
0.9% sodium chloride Injection	B. Braun Medical Inc.	0264-7800-10	For washing/injection
Povidone iodine prep solution	Dynarex Corp.	1413	For skin preparation
Puralube vet ointment	Dechra Veterinary Products	17033-211-38	For eye pretection
Hair remover lotion	Church & Dwight Co., Inc.		For skin preparation
Intensive care unit	ThermoCare	FW-1	For post-surgery recovery
DietGel recovery	ClearH2O	72-06-5022	For post-surgery recovery
Aurum total RNA fatty and fibrous tissue kit	Bio-Rad	7326830	For RNA isolation
iScript reverse transcription supermix for RT-qPCR	Bio-Rad	1708841	For reverse transcription assay
TaqMan fast advanced master mix	Applied Biosystems/Life Technologies	4444965	For QPCR analysis
Total bile acid assay kit	Genzyme Diagnostic	DZ042A-K01	For bile acid assay
C57BL/6J	The Jackson Laboratory