Перенакопления Ileectomy индуцированной желчи в кишечнике мыши

Резюме

Тонкой кишки зависимых желчные кислоты реабсорбции и обратной связи торможение синтеза печени желчных кислот имеет важное значение для системного гомеостаза и здравоохранения. В этом исследовании мы описываем модель мыши для подвздошной резекции для оценки ileectomy индуцированной желчь мальабсорбции, перенакопления и токсичности в кишечнике мыши.

Аннотация

Кишечные резекции является общий терапевтический подход для человека заболеваний, как ожирение, воспалительные заболевания кишечника, болезнь Крона и рака толстой кишки, что часто приводит к тяжелой короткого кишечника синдром как неблагоприятные последствия, включая диарею желчных кислот, обезвоживание, помехи электролита и всасывания питательных веществ. Здесь мы представляем модель мышиных ИЛЕАЛ резекции, называют ileectomy, оценить ткани коммуникации и поддержания системных гомеостаза. После ИЛЕАЛ резекции циркулирующей крови лишена постоянно фактор роста фибробластов подвздошной кишки конкретных эндокринных гормонов 15 (FGF15), который выпускает его эндокринными ингибиция синтеза желчных кислот в печени. В сочетании с ростом производства и отменено реабсорбции после удаления подвздошной кишки желчных кислот мышей, которые перенес операцию страдают от перенакопления соли желчи в кишечнике и связанных понос, заболеваемости и смертности. Роман использование модели хирургии, введенной в этом исследовании может обеспечить механистическим и функциональных понимание ИЛЕАЛ контроль системных метаболических регулирования в физиологии и патологии.

Введение

В современных биомедицинских исследований генетически модифицированных животных модели широко используются подбирать понимание заболеваний человека. В частности для изучения молекулярных регулирования, а также индуцированной биологические эффекты были использованы ткани или клетки конкретные выгоды и потери функции генов. Несмотря на успехи в манипулировании целевых генов в естественных условияхявляются сохраняющиеся ограничения. Первый, многие клетки или ткани конкретные изъятия будет влиять на несколько органов. Например эпителиальные гена удаления устранит выражение в эпителия нескольких тканей. Кроме того даже если исключить ограничивается конкретной ткани, пространственного управления редко осуществимо. Например в ткани как кишечник, разных сегментов выполнения весьма конкретных функций, которые нельзя манипулировать с точностью в естественных условиях. В таких ситуациях резекции тканей ген содержащих считается более эффективным изучение подход для определения механистическим и функциональной значимости ткани коммуникации.

Ileectomy является главным образом используется в больных Крона и воспалительных заболеваниях, сопровождающихся дистальной части подвздошной кишки ^1,2,3. Подвздошной кишки обычно производит несколько гормонов, хранения энергии как фактор роста фибробластов 15/19 (FGF15/19), пептид YY (PYY) и глюкагон как пептид 1/2 (GLP1/2); Эти гормоны играют важную роль местных и эндокринной многих биологических функций^4,5,6. Среди этих гормонов была обнаружена FGF15 как надежный эндокринной ингибитор синтеза желчных кислот в печени. После реабсорбируется в подвздошной enterocytes, желчных кислот активировать ядерных рецепторов farnesoid X рецептор (FXR) для стимулирования Fgf15 выражение, которое впоследствии приводит к обратной связи торможение синтеза печени желчных кислот ⁷. В недавнем исследовании, мы ввели мыши ileectomy модель для изучения ИЛЕАЛ kruppel подобный фактор 15 (KLF15) -Fgf15 сигнализации оси, который регулирует производство суточного желчных кислот в печени ⁸. Самое главное мы ввели новые семьи, kruppel как факторы, особенно KLF15, в биологии желчных кислот. На основе функциональных исследований, включая ileectomy хирургии, мы определили что upregulates KLF15 синтез желчных кислот через косвенные механизм не печени. Наконец подвздошной KLF15 также идентифицируется как первый эндогенного негативный регулятор Fgf15.

Кишечные сегментов, спуская от проксимальнее дистальной регионы отвечают за поглощение различных питательных веществ. Подвздошной кишки является основной сегмент ответственных за желчные кислоты и витамин B₁₂ (_B12V) поглощения ⁹. Более ранние исследования работают мыши модель резекции проксимального отдела кишки для изучения синдром укороченной тонкой кишки; для поддержания оптимального послеоперационный выживание ставки ¹⁰были предложены различные длины резекции, диеты и типы швов. Кроме того более недавний обзор указывает, что что ИЛЕАЛ резекции обычно приводит к более тяжелой болезни, чем другие желудочно-кишечные резекции сегмента (GI) благодаря снижению адаптационного потенциала остальных тракта ¹¹. Эта тема приобрела интенсивные интересы групп фундаментальных и клинических исследований, тогда как понимание восстановления и эффективные терапевтические подходы по-прежнему ограничены.

Желчные кислоты понос является результатом диспропорции в желчные кислоты гомеостаза в энтерогепатической циркуляции ^12,13. Это может быть следствием ИЛЕАЛ резекции, желудочно-кишечные заболевания или результат идиопатическая желчные кислоты мальабсорбции. Более чем 80% пациентов были найдены представить с понос после прохождения ИЛЕАЛ резекции ¹⁴. Ileectomy имеет потенциал, чтобы быть важным хирургии модель для расследования случаев диареи желчных кислот. В этом исследовании серия ИЛЕАЛ резекций предоставляют градиента оценки FGF15 дефицит, а также кишечной соли желчных мальабсорбции, перенакопления и токсичных ущерба.

протокол

животных протокол был рассмотрен и одобрен институциональный уход животных и использования Комитетом на случай Western Reserve University School of Medicine и был проведен в соответствии с руководством национальных институтов здравоохранения (НИЗ) для Уход и использование лабораторных животных (8-е издание, 2011). Мышей были умерщвлены методами, совместимый с американской ветеринарной медицинской ассоциации (AVMA) руководящие принципы для эвтаназии животных (издание 2013). Мужчина, 8-16 неделя старый мышей C57Bl/6J, были использованы в настоящем Протоколе. Мышей были размещены в среде темно/свет цикла 12 ч.

1. Предварительная Оперативная подготовка

1. передачи мышей к чистой клетке 24 часа до процедуры. Разрешить животных свободный доступ к воде. Заменить Чоу пищи мягкой пищи (гель добавка) 4-6 ч до операции, чтобы уменьшить содержимое тонкой кишки для хирургии.
2. Стерилизации всех хирургических инструментов и подготовить одноразовые стерильные хирургические материалы. Чистота области операции и анестезии носовой конус с 70% этанол.
3. Настройка микроскопом рассечение, изофлюрановая обезболивающий спрей, инструментов и контролем температуры животных хирургические столик для поддержания температуры тела. Организовать инструменты, швы и шприцы в месте для свободного доступа во время операции.
4. Настроить источник света для обеспечения достаточно света для области хирургической.
5. Подготовить стерильного 0,9% физиологического раствора в 5 мл шприц для очистки кишечника и брюшной.

2. Ileectomy и анастомоза

1. Anesthetize мышей с изофлюрановая (2-3%) в камере мелких животных инкубации. Определить адекватной анестезии, с использованием метода щепотку мыс, в то время как животное находится на изофлюрановая.
2. Удалить живота волос, применяя продукт удаления волос и удаление волос с помощью хирургического губки при поддержании анестезии. Поместите курсор мыши на контролируемой температурой животных хирургические столик ( рис. 1 A) для поддержания температуры тела на 37 ° C. поддержания анестезии с изофлюрановая (1-2%) через маску. Лечить глаза мыши глазной мазью.
3. Очистить кожу, используя повидон йода и 70% спирта и охватывают хирургические области живота с хирургические стерильные марлевые ( рис. 1 Б).
4. Сделать срединной брюшной разрез с помощью хирургического скальпеля после анестезии в силу. Использовать хлопок наконечником аппликатором для защиты кишечника и тянуть мышь брюшной мышцы с ретракторы полностью открывать и разоблачить брюшной полости ( рис. 1 C).
5. Найти слепой кишки. Начиная от слепой кишки, тщательно перемещать подключенных подвздошной кишки и частью тощей кишки из брюшной полости ( рис. 1 D).
   Примечание: Слепой кишки могут быть легко идентифицированы из-за ее большого размера даже после голодания.
6. Перевязать верхней ветке превосходной верхней брыжеечной артерии с Шелковый шов 7-0 чтобы загородить крови поставки Илеал сегмент, который должен быть вырезан. Подвздошной цвет меняется от розового до темно-фиолетового после перевязки. (E - F рис. 1).
7. В зависимости от цели эксперимента, используя ножницы, акцизов и удаление 50% или 90% подвздошной кишки.
   Примечание: Для Шам хирургии, не выполняют лигирование превосходной верхней брыжеечной артерии и не удаляйте подвздошной кишки.
8. Потолочные люмен эндз ИЛЕАЛ с 0,9% физиологического раствора.
   Примечание: как оставшихся нетронутыми подвздошной кишки продолжает получать нормальное кровоснабжение от превосходной верхней брыжеечной артерии, небольшое количество крови будет промыть во время процесса. Это также означает, что кровоснабжение ИЛЕАЛ концы нормально и обеспечивает не ишемии при процедуре анастомоза ( рис. 1 G).
9. Найти мезентерии на стороне обеих ИЛЕАЛ заканчивается. Совместите мезентерии и шовные ИЛЕАЛ концы вместе, используя шов ( рис. 1 G - H) 8-0.
10. Шов контралатеральную сторону подвздошной кишки сохранить подвздошной кишки анастамозные естественным образом ( Рисунок 1 я).
11. Шов верхняя и нижняя стороны между двумя оригинальные швы тщательно соединения двух ИЛЕАЛ концы вместе ( рис. 1 J).
12. Подтверждают, что нет никакой утечки из сайта анастомоза после завершения процедуры сшивающие три шага ( рис. 1 G-я). Возвращение слепой кишки и тонкого кишечника в брюшную полость в исходное расположение анатомических. Промойте области хирургии с теплой 0,9% физиологического раствора, тупой иглой. ( рис. 1 K).
13. Закройте разрез брюшной мышцы слоя шва 6-0. Совместите брюшной Кожный разрез с помощью щипцов и шовные брюшной кожи для содействия оптимального заживление ран ( рис. 1 L).

3. Послеоперационный уход

1. передачи после операции мышей в отделении интенсивной терапии для восстановления. Дом их в клетке бумаги-постельные принадлежности на контролируемой температурой грелку для продолжения восстановления после операции на ночь. Поставки мышей с мягкой пищи помимо обычных продуктов питания и воды.
2. Администрировать бупренорфин (0,05 - 0,1 мг/кг) с подкожной инъекции каждые 8-12 ч для анальгезии.
   Примечание: Усыпить мышей на CO ₂, если серьезно больны.
3. В конечной точке, пожертвуйте мышей с использованием передозировка изофлюрановая и урожай образцов при необходимости (раздел 4).

4. Оценка Ileectomy индуцированной желчь перенакопления

1. весят и вскрыть мышей один день после резекции 0% (фиктивный), 50% или 90% подвздошную.
2. Удаление желудочно-Кишечного тракта и взвесить его. Рассчитать вес GI соотношение веса тела для оценки тяжести соли желчных мальабсорбции и перенакопления.
3. Перевести GI участки в 15 мл конические трубы и порежьте их на короткие сегменты с помощью ножниц. После резки, центрифуги на 3000 x g для 10 минут передать чистой труба супернатант (GI жидкости содержащие желчных солей).
4. Измерить общий объем и вес GI жидкости и рассчитать жидкости вес в удельная тракта GI для дальнейшей оценки перенакопления желчи в Желудочно-кишечном тракте.
5. Определить сумму всего желчь в надосадке пробирного желчные кислоты как описано в ссылка ⁸.

Результаты

Процедуры для ileectomy показано на рисунке 1. Первый этап включает в себя подготовку мыши брюшной кожи, делая разрез брюшной и полностью разоблачить кишечника (рис. 1A-C) с помощью ретракторы. Далее, слепой кишки мыши был расположен (

Обсуждение

Для выполнения успешной ileectomy, превосходной верхней брыжеечной артерии должны быть лигируют заранее блокировать приток крови к resecting сегмента. Ишемические сегмент подвздошной станет темно-фиолетовый после перевязки. Необходимо затем полностью резецируется ИЛЕАЛ сегмента. Нормальное...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection microscope	Olympus	SZ61	For surgery
Animal temperature controller	Physitemp Instruments, Inc.	TCAT-2LV	For body temperature control
Isoflurane anesthetic vaporizer	VetEquip	911104	For anesthesia
Dissection forceps	Fine Science Tools, Inc.	11274-20	For surgery
Scissors	Fine Science Tools, Inc.	14084-08	For surgery
Needle holder	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7882	For surgery
Micro knives-needle blade	Fisher Scientific	10318-14	For surgery
6-0 monofilament suture	Ethicon	1698G	For abdominal skin closure
7-0 silk suture	Ethicon	766G	For ligation
8-0 monofilament suture	Ethicon	1714G	For anastomosis
Surgical sponges	Dynarex Corp.	3333	For surgery
Small cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-118	For surgery
Isoflurane	Piramal Healthcare Limited	66794-013-25	For anasthesia
Buprenorphine hydrochloride	Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals	12496-0757-1	For analgesia
0.9% sodium chloride Injection	B. Braun Medical Inc.	0264-7800-10	For washing/injection
Povidone iodine prep solution	Dynarex Corp.	1413	For skin preparation
Puralube vet ointment	Dechra Veterinary Products	17033-211-38	For eye pretection
Hair remover lotion	Church & Dwight Co., Inc.		For skin preparation
Intensive care unit	ThermoCare	FW-1	For post-surgery recovery
DietGel recovery	ClearH2O	72-06-5022	For post-surgery recovery
Aurum total RNA fatty and fibrous tissue kit	Bio-Rad	7326830	For RNA isolation
iScript reverse transcription supermix for RT-qPCR	Bio-Rad	1708841	For reverse transcription assay
TaqMan fast advanced master mix	Applied Biosystems/Life Technologies	4444965	For QPCR analysis
Total bile acid assay kit	Genzyme Diagnostic	DZ042A-K01	For bile acid assay
C57BL/6J	The Jackson Laboratory