تقييم الشبكة شبكية الكالسيوم إزالة الكالسيوم االنبساطي الاحتياطي وداخل الخلايا في Cardiomyocytes البطين المعزولة

Summary

إعادة تدوير الكالسيوم داخل الخلية يلعب دوراً حاسما في تنظيم وظيفة الانقباضي والانبساطي في cardiomyocytes. هنا، نحن تصف وضع بروتوكول لتقييم الشبكة شبكية Ca^{2 +} الاحتياطي ووظيفة إزالة الكالسيوم الانبساطي في cardiomyocytes كالسيوم نظام التصوير.

Abstract

إعادة تدوير الكالسيوم داخل الخلية يلعب دوراً حاسما في تنظيم وظيفة الانقباضي والانبساطي في cardiomyocytes. بمثابة القلب شبكية الشبكة (SR) Ca^{2 +} خزان للانكماش، الذي ريوبتاكيس داخل الخلايا Ca^{2 +} أثناء الاسترخاء. المتاحة لفوز ريال Ca^{2 +} الاحتياطي بعوض للقلب كونتراكتيبيليتي، وإزالة المرجع المصدق داخل الخلية^{2 +} حاسمة بالنسبة لوظيفة القلب الانبساطي. إزالة الكالسيوم البصر وريال Ca^{2 +} مخزن في cardiomyocytes تحت بعض الظروف الفيزيولوجية المرضية، مثل داء السكري والقلب، قد تكون ضالعة في التقدم من اختلال وظيفي في القلب. هنا، يمكننا وصف بروتوكول تقييم سركا^{2 +} الاحتياطي والانبساطي Ca^{2 +} إزالة. بإيجاز، كارديوميوسيتي واحد انزيماتيكالي معزولة، وسجلت داخل الخلية Ca^{2 +} fluorescence المؤشرة Fura-2 بنظام تصوير كالسيوم. استخدام الكافيين لحفز مجموع ريال Ca^{2 +} الإصدار، نحن مسبقاً برنامج تبديل تلقائي التروية بالربط بين نظام التحفيز ونظام التروية. ثم استخدمت تركيب منحنى أسي مونو لتحليل الثوابت وقت تسوس من العابرين الكالسيوم والحبوب الكالسيوم الناجم عن الكافيين. وبناء على ذلك، المساهمة من ريال Ca^{2 +}-ATPase (سيركا) و Na⁺-Ca^{2 +} مبادل (نك) لإزالة الكالسيوم االنبساطي قيمت.

Introduction

الكالسيوم داخل الخلايا ([Ca^{2 +}]_أنا) إعادة التدوير يلعب دوراً حاسما في تنظيم وظيفة الانقباضي والانبساطي في cardiomyocytes¹. كما نعلم، يبدأ المستحثة بالكالسيوم Ca^{2 +} الإفراج عن الإثارة-تقلص اقتران، الذي ترجمة الإشارة الكهربائية إلى الانكماش. ينشط ديبولاريزيشن غشاء ساركوليمال لتر من نوع Ca^{2 +} قنوات، مما يدفع Ca^{2 +} الإصدار من ريال إلى السيتوبلازم عن طريق مستقبلات ريانوديني 2 (RyR2). عابر مرتفعة هيولى Ca^{2 +} يبدأ انكماش ميوفيبريلس. أثناء االنبساط، كاليفورنيا هيولى^{2 +} ريوبتاكين إلى ريال عن طريق ريال Ca^{2 +}-ATPase 2 (SERCA2) ويتم ضخها من كارديوميوسيتي عن طريق ال غ⁺-Ca^{2 +} مبادل (نك)². هذه العملية تؤدي إلى انكماش-الاسترخاء إعادة التدوير في كارديوميوسيتي.

ريال القلب هو شبكة غشاء داخل الخلايا التي تحيط بالآلية الهوس. هو بمثابة Ca^{2 +} خزان للانكماش، وأنها ريبسوربس Ca داخل الخلية^{2 +} أثناء الاسترخاء. المتاحة لفوز ريال Ca^{2 +} الاحتياطي بعوض للقلب كونتراكتيليتي. وفي الوقت نفسه، إزالة المرجع المصدق داخل الخلية^{2 +} أمر بالغ الأهمية للقلب االنبساط. تحت بعض الظروف الفيزيولوجية المرضية، مثل السكري والقلب والبصر Ca^{2 +} التخليص وكاليفورنيا ريال الاكتئاب^{2 +} مخزن في cardiomyocytes يمكن أن يشارك في عملية الخلل في القلب^{2،3 ،4}.

لقياس ريال Ca^{2 +} الإصدار و Ca^{2 +} إزالة الانبساطي في cardiomyocytes، هناك نهجان المستخدمة على نطاق واسع: سلامة الحالي نك استناداً إلى التصحيح-المشبك^5،6، والمرجع المصدق الناجم عن الكافيين ^{2 +} نبض استناداً إلى Ca^{2 +} fluorescence التصوير^7،،من⁸⁹. النهج السابق الذي يعتمد على حقيقة أن Ca^{2 +} صدر من ريال إلى حد كبير تضخ الخروج من الزنزانة التي نك. ومع ذلك، يقتصر هذا النهج باحتياجاتها من المعدات المتطورة والعملية ماهراً. في الدراسة الحالية، ويصف لنا نهجاً ملائماً لتقييم ريال Ca^{2 +} الاحتياطي و Ca^{2 +} إزالة في ميوسيتيس عن طريق قياس الناجم عن الكافيين Ca^{2 +} نبض استناداً Ca^{2 +} fluorescence نظام تصوير. باختصار، يتم الإشارة إلى Ca^{2 +} الأسفار داخل الخلايا Fura-2. بالربط بين نظام التحفيز ونظام التروية، فإننا نعرض برنامجا للتحول نضح وسرعة النظام تلقائياً. واستخدمت 10 ملم من الكافيين للحث على سرعة مجموع Ca^{2 +} الإصدار في ريال. الثوابت وقت تحلل أسي (تاو) من العابرين الكالسيوم والحبوب الكالسيوم الناجم عن الكافيين انتزعت من منحنى أسي مونو والمناسب، والتي تعكس مساهمة سيركا ونككس إلى Ca^{2 +} إزالة االنبساطي تبعاً لذلك.

Protocol

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة الاستخدام في مركز البحوث التجريبية والصين الأكاديمية الصينية العلوم الطبية وجامعة تشجيانغ ورعاية الحيوان المؤسسية.

1-"إعداد الحل"

1. إعداد جميع الحلول كما هو موضح في الجدول 1.

2. العزلة من اليسار بطيني (LV) كارديوميوسيتيس

ملاحظة: LV كارديوميوسيتيس يتم عزل انزيماتيكالي باستخدام نظام التروية لانجيندروف كما هو موضح سابقا ^{7 ، 8 ، ،} من ^{9 10 ، 11}-

1. على إعداد نظام التروية لانجيندروف. تعبئة نظام التروية بالحل الطبيعي تيرودي (NT) وضبط درجة الحرارة عند 36.5 درجة مئوية، وإزالة أي فقاعات الهواء في الأنبوب.
2. زن وتخدير الفئران سبراغ داولي بالحقن داخل (ip) من كلورال هيدرات (400 مغ/كغ). تأكيد حالة مخدر بتقييم استجابة قرصه الذيل أو أخمص القدمين بعد دقيقة 5
3. فتح تجويف البطن بموجب عملية الرهابه مع مقص جراحية ورفع عملية الرهابه وفتح الصدر مع مقص. إزالة تامور قليلاً رفع القلب مع منحنى ملقط، تحديد القوس الاورطي وقطع القلب بالمقص من جذر الاورطي.
4. نقل القلب بطبق 60 ملم وغسله مع الحل NT. عقد الشريان الاورطي مع اثنين ملقط تشريح الصغرى، وتحميله على قنية نضح لانجيندورف ثم إيمانا راسخا سد الشريان الاورطي على قنية استخدام خيوط الجراحة-
   ملاحظة: عامل مهرة يمكن الانتهاء من هذه العملية ضمن 15 س.
نتخلل
5. القلب بمحلول 30 مل NT لاستعادة الدورة الدموية للشرايين التاجية. ثم التبديل بيرفوساتي إلى 30 مل Ca ^{2 +}-مجاناً الحل تيرودي (10 مم توراين، 1 ملغ/مل جيش صرب البوسنة) لوقف نبضات القلب. بعد ذلك، التبديل في بيرفوساتي إلى كولاجيناز بالعزلة الحل (0.6 مغ/مل) لأنزيم الهضم.
   ملاحظة: استخدم A كولاجيناز للتجارب مع الفئران السكري، أو "الثاني كولاجيناز" للتجارب دون الفئران السكري.
6. بعد الهضم لمدة 20-25 دقيقة، بسرعة تغيير الحل التروية إلى Ca ^{2 +}-الحرة تيرودي حل لوقف المزيد من الهضم. ثم عقد القلب مع الملقط وقطع من القنية ومكان القلب في طبق 35 ملم تحتوي على الحل كيلو بايت (انظر الجدول 1).
7. تشريح الجدار LV مع مقص وملقط. قطع الاذين والبطين الأيمن ومنطقة مفرق بي. الأنسجة المتبقية هي الوقف؛ تحويلها إلى طبق 35 ملم جديدة مع الحل كيلو بايت. فرم الأنسجة LV إلى قطع صغيرة-
8. بلطف "الماصة؛" القطع مع بقطاره بلاستيك التي تمت تصفيتها، وإعادة تعليق في حل مل 10 كيلو بايت-
9. تصفية الخلايا مع 150 ميكرومتر الفتحة تصفية الفولاذ المقاوم للصدأ، ونقل إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل. الطرد المركزي في 150 ز x 30 ثانية وتجاهل المادة طافية. تعليق إعادة تسوية myocytes في الحل مل 10 كيلو بايت, مجاناً لمدة 6 دقائق، تجاهل المادة طافية، وإعادة تعليق بيليه في حل مل 10 كيلو بايت-
   ملاحظة: تم تنفيذ كافة الخطوات في 36 درجة مئوية في حلول الغاز مع 100% O ₂-

3. إعادة الكالسيوم

1. بعد تسوية لمدة 20 دقيقة في حل كيلو بايت, تجاهل المادة طافية، وإعادة تعليق myocytes مع الكالسيوم إعادة حل A (0.3 مم Ca ^{2 +}, Ca 4.5 مل ^{2 +}-حل تيرودي الحرة، حل 1.5 مل NT) للحد الأدنى 10
2. تكرار الإجراء أعلاه مع الكالسيوم إعادة حل ب (0.3 مم Ca ^{2 +}، 3 مل Ca ^{2 +}-الحرة تيرودي الحل، الحل 3 مل NT).
3. تكرار الإجراء أعلاه مع الحل NT (1.2 مم Ca ^{2 +}) لتنقية ميوسيتيس المتاحة. تخزين myocytes LV معزولة في هذا الحل ودراستها ضمن حاء – 4-6

4. تعيين أعلى من نضح نظام

1. ربط أنبوب تدفق مع الحل NT لنضح الدائرة ( الشكل 1A).
2. لنضح إبرة من ميوسيتي المستهدفة، صل تلميح متشعبة متعددة (مثلاً، نضح القلم الرصاص، المشار إليها كقلم رصاص من الآن فصاعدا)، ثابتة في ميكرومانيبولاتور، إلى الصمام التحكم في نظام التروية. إضافة NT الحل والحل الكافيين 10 ملم لكل عمود في قلم الرصاص ( الشكل 1A).
3. إجلاء أي فقاعات الهواء في الأنابيب لتجنب انسداد الهواء.
4. عد بالتنقيط من طرف ميكرون من قلم الرصاص عن 10 ق، وضبط منظم تدفق للحفاظ على سرعة تدفق سرعة تقريبي 3 بالتنقيط/10 س.

5. القياسات من داخل الخلية Ca ^{2 +} عابرة وتقصير ساركومير ^{7 ، ،} من ^{8 9}

1. ماصة 10 ميليلتر خلية تعليق على الشريحة، حساب الأرقام الخلية بعداد خلية تحت المجهر، وحساب الكثافة. تمييع myocytes إلى بتركيز تقريبي 50,000 خلية/مل.
2. إضافة Fura-2 أسيتوكسيميثيل (ص) الأسهم (صبغة حساسة كالسيوم) إلى تعليق 1 مل من ميوسيتيس إحضار التركيز النهائي إلى 2 ميكرومتر. تبقى في الظلام لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
3. الطرد المركزي 30 s، وإعادة تعليق كارديوميوسيتيس مع الحل NT 2 مرات في 150 غ.
4. بدوره قبالة الضوء وإبقاء الخلايا في الظلام. مكان ميوسيتيس في قاعة نضح لمدة 15 دقيقة. ثم يبدأ نضح الدائرة (1.5 مل/دقيقة) مع الحل NT. مواكبة ميوسيتيس تنشيط الحقل 1 هرتز استخدام مشجعا (مدة موجه ms 4.0، النبض السعة 8.0 V) للحد الأدنى 5
حدد
5. من ميوسيتي بشكل جيد (شكل قضيب، حافة حادة وواضحة عبر التصدعات) ونشل حفز مستقرة (لا انكماش عفوية) تحت 10 x عدسة الهدف مجهرية. بعد ذلك، تغيير التكبير المجهري إلى 40 س، وتدوير اتجاه الكاميرا CCD للحفاظ ميوسيتي في وضع أفقي.
6. الإطار ميوسيتي واحد عن طريق ضبط المحول تأطير الخلية. تأكد من أن الخلفية واضحة.
7. كشف ميوسيتيس للضوء المنبعث من مصباح زينون، مع 340 أو 380 عوامل الإثارة الطول الموجي نانومتر، والصورة ميوسيتيس من خلال هدف 40 x. الكشف عن إشارة fluorescence في 510 نانومتر. وفي الوقت نفسه، ملاحظة تغيرات طول ساركومير myocytes وسجل استخدام الوحدة النمطية للحافة الناعمة في نفس الوقت.
8. سجل الأسفار بنظام ضوئي fluorescence المزدوج-الإثارة. قم بتشغيل برنامج تسجيل للكالسيوم نظام التصوير، انقر فوق " ملف ملف/جديد " لإنشاء ملف تسجيل جديد، انقر فوق " ابدأ " الزر بشكل متزامن سجل طول الأسفار وساركومير.

6. تقييم ريال Ca ^{2 +} الاحتياطي والانبساطي Ca ^{2 +} "وظيفة إزالة" ^{7 ، ،} من ^{8 9}

1. انترلينك " خارج Aux " الميناء في مشجعا مع " "التناظرية في" " الميناء في نظام التحكم بصمام (مثلاً، قائد صمام، انظر الجدول للمواد) بكبل BNC (لمزامنة الإشارات TTL).
2. مسبقاً برنامج لتبديل الصمامات نضح تلقائياً كما هو موضح سابقا ^{8 ، 9}؛ يتم سرد الخطوات التفصيلية للعملية كما يلي.
   1. مسبقاً المعلمات في الصمام التحكم في البرنامج وفقا الجدول 2، وانقر فوق " تحميل " زر لتحميل التسلسل الذي تم تحميله في البرنامج. انقر فوق " Triggأية " زر لتمكين وظيفة الزناد.
      ملاحظة: يمكن تنفيذ نظام مراقبة صمام التسلسل بعد تلقي إشارة TTL.
   2. مسبقاً مشجعا لوضع تسلسل، وتعيين المعلمات وفقا الجدول 3-
3. تعيين مشجعا في " خطوة S1 " لوتيرة الوقف ابدأ ميوسيتيس في 1 هرتز. نضح الإبرة بسرعة من 1.5 مل/دقيقة مع الحل NT.
   ملاحظة: نظراً لسرعة تيار الإبرة بشكل أسرع من نضح الدائرة، إنكسار الضوء من تيار الإبرة يختلف عن إنكسار الضوء من نضح الدائرة. الفرق بين إنكسار الضوء يشير إلى مجموعة نضح إبرة الفعال، الذي يحيط هدف ميوسيتي.
حدد
4. ميوسيتي مستهدفة ضمن عرض المجهري طاقة منخفضة (في التسلسل من المصب إلى المنبع)، وتأكد أنه يمكن الوصول بتلميح قلم الرصاص الصغير. تغيير تكبير المجهر إلى 400 x. قم بتدوير اتجاه الكاميرا CCD للحفاظ ميوسيتي في الموضع الأفقي. ضبط الفتحة المستطيلة تحت المحول تأطير الخلية إلى إطار مناسب أن يملأ مع ميوسيتيس. تأكد من وجود خلفية الحد الأدنى؛ لا تسمح ميوسيتيس أو الحطام خلية ميتة في هذه النافذة الأخرى.
5. ضبط موضع القلم الثابتة على ميكرومانيبولاتور، بعناية وضع تلميح الصغرى على مسافة نصف قطرها من حقل الرؤية إلى ميوسيتي المستهدفة تحت 400 x تكبير المجهر.
6. ضبط نطاق تيار إبرة معظمها تغطية ميوسيتي الهدف والتأكد من أن ميوسيتي لا تعصف بتدفق إبرة.
7. s بعد 60 الأساسية سرعة، لفة المؤشر مشجعا " الخطوة D2 ".
   ملاحظة: سينفذ بقية البروتوكول تلقائياً مشجعا وصمام التحكم النظام. استناداً إلى إعداد أعلاه، البروتوكول يمكن أن ينفذ تلقائياً كما هو الحال في الشكل 2 أ، 1 هرتز الأساسية سرعة مع الحل NT ل 60 ثانية. ثم توقف سرعة وتأخير 2 s، سرعة التبديل إلى 10 ملم الكافيين نضح 15 s (وظيفيا وإطلاق سراح Ca ^{2 +} مخزن في ريال)، ثم قم بالتبديل مرة أخرى إلى حل NT.
8. في نهاية التسجيل، كشف fluorescence الخلفية ل myocytes الفردية. انقر فوق " وقفه " الزر إلى إيقاف ملف تسجيل، نقل عرض المجهري لمنطقة فارغة قريبة. انقر " سجل " زر لاستئناف التسجيل لمدة ثانية، وسجل العددية 340 و 380 نانومتر قيم الكثافة لتصحيح الخلفية.
9. مفتوحة " العملية/ثابت " مربع الحوار وتعبئة القيم في " الخلفية " تشكل، على التوالي؛ ويمكن تصحيح البرنامج Fura 2 نسبة القيم بطرح الخلفية.

7. تحليل بيانات ⁹

1. لقياسات العابرين الكالسيوم وتقصير في المرحلة الأساسية سرعة ساركومير، متوسط نبضات نشل، وثم تحليل المعاملات الحيوية، مثل الكالسيوم العابرين، وقت ثابت من الكالسيوم تسوس عابرة (تاو-1 هرتز)، باستخدام البرمجيات تلقائياً.
   ملاحظة: إذا كان البرنامج لا يصلح الجزء تسوس جيدا، تصدير التتبع الانخفاض لملائمة منحنى أسي مونو اليدوي.
2. بالنسبة للحبوب الكالسيوم الناجم عن الكافيين، حدد فقط النبض مع موجه شديدة انحدار لتحليل وظيفة إزالة الكالسيوم. استبعاد الخلايا التي تحتوي على إشارة الاضطراب، نبض غير طبيعي، أو تلك التي تدفقت بعيداً في منتصف الطريق-
3. قياس السعة لنبض الناجم عن الكافيين الكالسيوم (Ca-الكافيين، فهرس سركا ^{2 +} الاحتياطي)-
4. الحصول على تسوس وقت ثابت لنبض الكالسيوم الناجم عن الكافيين (تاو-الكافيين) باحتواء المنحنى الأسى مونو (المدة s 10) يدوياً من البرمجيات ( الشكل 2).

النتائج

نحن هنا، لتوضيح بالستريبتوزوتوسين (STZ)-التي يسببها السكري الفئران (مارك ألماني) والعمر-مطابقة سبراغ-داولي (SD) الجرذان على سبيل المثال. تلقي عمرها 8 الأسبوع ذكور الفئران SD (200 ± 20 غ) حقنه داخل واحدة من STZ (70 مغ/كغ، والملكية الفكرية) لمارك ألماني المجموعة أو سترات المخزن المؤقت ل...

Discussion

تدفق الكالسيوم من ريال هو Ca^{2 +} المصدر الرئيسي االنقباض في القلب. لحد والسعة لريال Ca^{2 +} المحتوى Ca كسرية^{2 +} صدر من ريال تعكس متاح لتقلص القلب ريال Ca^{2 +} الاحتياطي. من ناحية أخرى، Ca^{2 +} احتياطي ريال يعتمد على قدرة ريال Ca^{2 +} امتصاص Ca^{2 +} تسرب من ريال وتوازنها عبر ري...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Alfa Aesar	E31K43
MgCl2	Alfa Aesar	I02T070
KCl	Alfa Aesar	G22u018
HEPEs	Sigma	SLBM 7880V
D-Glucose	Alfa Aesar	10189341
NaOH	Alfa Aesar	10154048
KOH	Alfa Aesar	10144B17
KH2PO4	Alfa Aesar	F21S033
MgSO4	Alfa Aesar	C31U038
L-Glutamic	Alfa Aesar	10149849
Taurine	Alfa Aesar	J5407a
EGTA	Sigma	SLBM6826V
Collagenase A	Roche	10103586001
Collagenase Type II	Worthington	45k16005
BSA	Roche	735094
caffeine	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscope	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff system	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 links
Perfusion chamber	IonOptix	FHD
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA	VC 3-8
valve commander software	ALA	VC 3 1.0.1.2
Precision flow regulator	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Removable Tip	AutoMate Scientific	360um i.d.
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems	IonOptix	Hyperswitch
Recording software	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436