Bewertung der sarkoplasmatischen Retikulum Calcium Reserve und intrazellulären diastolische Calcium Entfernung in isolierten ventrikulären Kardiomyozyten

Zusammenfassung

Recycling von intrazellulären Calcium spielt eine entscheidende Rolle bei Regulierung der systolischen und diastolischen Funktion in Herzmuskelzellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur sarkoplasmatischen Retikulum Ca^{2 +} Reserve und diastolische Kalzium-Removal-Funktion in Herzmuskelzellen durch ein Calcium imaging-System zu bewerten.

Zusammenfassung

Recycling von intrazellulären Calcium spielt eine entscheidende Rolle bei Regulierung der systolischen und diastolischen Funktion in Herzmuskelzellen. Kardiale sarkoplasmatischen Retikulum (SR) dient als Ca^{2 +} Reservoir für Kontraktion, welche Reuptakes intrazellulären Ca^{2 +} während der Entspannung. Die SR Ca^{2 +} Reserve für Beats ist determinate für kardiale Kontraktilität, und die Entfernung von intrazellulären Ca^{2 +} ist entscheidend für die diastolische Herzfunktion. Unter bestimmten pathophysiologischen Bedingungen wie Diabetes und Herzinsuffizienz können den Fortschritt der kardialen Dysfunktion beeinträchtigt Kalzium Clearance und SR Ca^{2 +} Shop in Kardiomyozyten beteiligt werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur SRCa^{2 +} Reserve und diastolische Ca^{2 +} Entfernung zu bewerten. Kurz, eine einzelne Cardiomyocyte wurde enzymatisch isoliert, und die intrazelluläre Ca^{2 +} Fluoreszenz von Fura-2 angegeben wurde von einem Kalzium-imaging-System aufgezeichnet. Um Koffein zur Induktion SR Ca^{2 +} Gesamtfreigabe beschäftigen, preset wir eine automatische Perfusion Schalter Programm durch Vernetzung der Stimulation und die Perfusion System. Dann wurde die Mono-exponentielle Kurvenanpassung für die Analyse von Verfall Zeitkonstanten von Kalzium Transienten und Koffein-induzierte Kalzium Impulse verwendet. Entsprechend der Beitrag des SR Ca^{2 +}-ATPase (SERCA) und Na⁺-Ca^{2 +} Wärmetauscher (NCX) diastolischen Kalzium Entfernung wurde ausgewertet.

Einleitung

Intrazellulären Calcium recycling ([Ca^{2 +}]_ich) spielt eine entscheidende Rolle bei Regulierung der systolischen und diastolischen Funktion in Kardiomyozyten¹. Wie wir wissen, initiiert die Kalzium-induzierte Ca^{2 +} Freigabe der Erregung-Kontraktion Kupplung, die übersetzen des elektrischen Signals zur Kontraktion. Membran-Depolarisation aktiviert die sarcolemmal L-Typ Ca^{2 +} -Kanäle, die Ca^{2 +} induzieren von SR in das Zytoplasma über Ryanodin-Rezeptoren 2 (RyR2) zu befreien. Die vorübergehende erhöhte zytoplasmatischen Ca^{2 +} initiiert Kontraktion der Myofibrillen. Während der Diastole zytoplasmatischen Ca^{2 +} ist Reuptaken in der SR durch die SR Ca^{2 +}-ATPase 2 (SERCA2) und pumpte aus der Cardiomyocyte über die Na⁺-Ca^{2 +} Wärmetauscher (NCX)². Dieser Prozess führt zur Kontraktion-Entspannung-recycling in der Cardiomyocyte.

Die kardiale SR ist ein intrazellulären Membran-Netzwerk, die die kontraktile Maschinen umgibt. Es dient als Ca^{2 +} Reservoir für Kontraktion, und es nimmt intrazellulären Ca^{2 +} während der Entspannung. Die SR Ca^{2 +} Reserve für Beats ist bestimmt für kardiale Kontraktilität. Unterdessen ist die Entfernung der intrazellulären Ca^{2 +} für kardiale Diastole von entscheidender Bedeutung. Unter bestimmten pathophysiologischen Bedingungen kann wie Diabetes und Herzinsuffizienz, eingeschränkter Ca^{2 +} Abstand und deprimiert SR Ca^{2 +} Shop in Herzmuskelzellen in den Prozess der kardialen Dysfunktion^{2,3 mit einbezogen werden ,4}.

Zur Messung der SR Ca^{2 +} Release und diastolische Ca^{2 +} Entfernung in Kardiomyozyten, gibt es zwei weit verbreitete Ansätze: die Integrität des aktuellen NCX basierend auf Patch-Clamp^5,6, und die Koffein-induzierte Ca ^{2 +} Puls basierend auf Ca^{2 +} Fluoreszenz imaging^7,8,9. Das erste Verfahren hängt davon ab, dass die Ca^{2 +} SR befreit weitgehend aus der Zelle durch NCX gepumpt wird. Allerdings ist dieser Ansatz von seiner Forderung nach vorgerückte Ausrüstung und geschickte Betrieb begrenzt. In der vorliegenden Studie beschreiben wir eine bequeme Herangehensweise zur SR Ca^{2 +} Reserve und Ca^{2 +} Entfernung in Myozyten Beurteilung durch die Messung eines Koffein-induzierte Ca^{2 +} Puls basiert auf einem Ca^{2 +} Fluoreszenz imaging System. Kurz, wird die intrazelluläre Ca^{2 +} Fluoreszenz durch Fura-2. Durch Vernetzung der Stimulation und Durchblutung System, präsentieren wir Ihnen ein Programm zur Umstellung der Perfusion und Tempo System automatisch. 10 mM Koffein wurde eingesetzt, um schnell total Ca^{2 +} Release in der SR induzieren Der exponentiellen Zerfall Zeitkonstante (Tau) von Kalzium Transienten und Koffein-induzierte Kalzium Impulse wurden von Mono-exponentielle Kurvenanpassung, erhalten, die den Beitrag der SERCA und NCX, diastolische Ca^{2 +} Entfernung entsprechend widerspiegeln.

Protokoll

alle Tierversuche durchgeführt gemäß Protokollen durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an Experimental Research Center, China Academy of Chinese Medical Sciences und Zhejiang University genehmigt.

1. Vorbereitung der Lösung

1. bereiten Sie alle Lösungen, wie in Tabelle 1 beschrieben.

2. Isolation des linken Ventricular (LV) Kardiomyozyten

Hinweis: LV Kardiomyozyten sind isoliert enzymatisch mit einem Langendroff Perfusion System wie oben beschrieben ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11}.

1. Stellen Sie das Langendroff Perfusion System. Füllen Sie die Perfusion System mit normalen Tyrode (NT) Lösung, stellen Sie die Temperatur bei 36,5 ° C und beseitigen Sie eventuelle Luftblasen in der Röhre.
2. Wiegen und eine Sprague-Dawley Ratten durch intraperitoneale Injektion (Ip) von Chloral Hydrate (400 mg/kg) zu betäuben. Bestätigen Sie die Narkose Status durch Auswertung von Rute oder Zehe Prise Reaktion nach 5 min.
3. Die Bauchhöhle unter dem Xiphoid Prozeß mit einer chirurgischen Schere öffnen, heben das Xiphoid Prozeß und öffne die Truhe mit der Schere. Entfernen Sie das Perikard, leicht heben das Herz mit der gebogenen Pinzette identifizieren den Aortenbogen und Herzen durch Scheren aus der Wurzel der Aorta abgeschnitten.
4. Übertragen die Herzen zu einem 60-mm-Gericht und waschen Sie es mit NT-Lösung. Halten die Aorta mit zwei Mikro-sezieren Pinzetten, und montieren Sie ihn auf die Langendorff Perfusion Kanüle und dann fest verbinden die Aorta auf die Kanüle mit chirurgischem Nahtmaterial.
   Hinweis: Ein erfahrener Bediener kann beenden dieses Prozesses innerhalb 15 s.
5. Perfundieren Herzen mit 30 mL NT-Lösung für die Durchblutung der Herzkranzgefäße zu erholen. Dann wechseln die Perfusat zu 30 mL Ca ^{2 +}-freie Tyrode-Lösung (10 mM Taurin, 1 mg/mL BSA) um den Herzschlag zu stoppen. Wechseln Sie als nächstes die Perfusat zu Collagenase A Isolierungslösung (0,6 mg/mL) für Enzym Verdauung.
   Hinweis: Mit Collagenase A für Experimente mit diabetischen Ratten oder Kollagenase II für Experimente ohne diabetischen Ratten.
6. Nach der Verdauung für 20-25 min, schnell ändern die Perfusion-Lösung, die Ca ^{2 +}-freie Tyrode-Lösung um weitere Verdauung zu stoppen. Halten Sie dann, das Herz mit der Pinzette, abgeschnitten von der Kanüle und legen Sie das Herz in eine 35-mm-Schale mit KB-Lösung (siehe Tabelle 1).
7. Sezieren die LV-Wand mit Schere und Pinzette. Schneiden Sie den Vorhof, rechte Herzkammer und ventrikulären Kreuzung Bereich. Das restliche Gewebe ist der LV; übertragen sie in ein neues 35-mm-Gericht mit KB-Lösung. Das LV-Gewebe in kleine Stücke hacken.
8. Sanft pipette die Stücke mit einem gefilterten Kunststoff Dropper und neu in 10 mL KB Lösung auszusetzen.
9. Filtern die Zellen mit 150 µm Blende Edelstahl Filter und Transfer in ein Zentrifugenröhrchen 15 mL. Zentrifugieren Sie bei 150 X g für 30 s und entsorgen der Überstand. Wieder aussetzen der Myozyten in 10 mL KB Lösung, frei für 6 min zu begleichen überstand verwerfen und erneut aussetzen das Pellet in 10 mL KB Lösung.
   Hinweis: Alle Schritte durchgeführt wurden, bei 36 ° C in Lösungen mit 100 % O ₂ vergast.

3. Kalzium-Wiedereinführung

1. nach dem Absetzen für 20 min in KB-Lösung, den Überstand verwerfen und erneut aussetzen der Myozyten mit Kalzium Wiedereinführung Lösung A (0,3 mM Ca ^{2 +}, 4,5 mL Ca ^{2 +}-kostenlose Tyrode-Lösung, 1,5 mL NT-Lösung) für 10 min.
2. Wiederholen Sie das oben beschriebene Verfahren mit Kalzium Wiedereinführung Lösung B (0,3 mM Ca ^{2 +}, 3 mL Ca ^{2 +}-kostenlose Tyrode-Lösung, 3 mL NT-Lösung).
3. Wiederholen Sie das oben beschriebene Verfahren mit NT-Lösung (1,2 mM Ca ^{2 +}), die verfügbaren Myozyten zu reinigen. Die isolierten LV Myozyten in dieser Lösung zu lagern und studieren Sie sie innerhalb von ca. 4-6 h.

4. Set Up der Perfusion System

1. Schließen Sie den Zulauf-Schlauch mit der NT-Lösung für Kammer Perfusion ( Abbildung 1A).
2. Für Nadel-Perfusion der Ziel Myozyten, verbinden die Multi-barrel vielfältigen Spitze (z. B. Perfusion Bleistift, fortan als Bleistift bezeichnet), in dem Mikromanipulator fixiert, am Ventil Perfusion System gesteuert. Jede Spalte des Bleistifts ( Abbildung 1A) NT und 10 mM Koffein Lösung hinzufügen.
3. Evakuieren Luftblasen in den Röhren Luft Blockade zu vermeiden.
4. Die Tropf Anzahl von Mikron-Spitze des Bleistifts für 10 s, und stellen Sie manuell die Durchflussregler zu halten die Strömungsgeschwindigkeit in einer ungefähren Geschwindigkeit von 3 Tropfen/10 s.

5. Messungen der intrazellulären Ca ^{2 +} Transienten- und Verkürzung des Sarkomers ^{7 , 8 , 9}

1. Pipette 10 µL Zellsuspension auf der Folie Zellzahlen durch einen Zähler der Zelle unter dem Mikroskop zählen, und die Dichte zu berechnen. Verdünnen Sie Myozyten eine ungefähre Konzentration von 50.000 Zellen/mL.
2. In der Dunkelheit für 20 min bei Raumtemperatur halten Add Fura-2 Acetoxymethyl (AM) Lager (Kalzium sensibler Farbstoff) in einer 1 mL Suspension der Myozyten bringen die Endkonzentration bis 2 µM..
3. Zentrifuge bei 150 g für 30 s und wieder auszusetzen die Herzzellen mit NT-Lösung 2 x.
4. Drehen das Licht aus und halten die Zellen im Dunkeln. Ort der Myozyten in der Perfusion Kammer für 15 Minuten. Starten Sie dann die Kammer Perfusion (1,5 mL/min) mit NT-Lösung. Tempo der Myozyten mit 1 Hz Feld Stimulation mit einem Stimulator (Welle Dauer 4,0 ms Pulse Amplitude 8,0 V) für 5 min.
5. Wählen Sie eine Myozyten mit guter Form (Stab Form, scharfe Kante, und klar Kreuz Streifung) und stabile stimuliert Twitch (keine spontane Kontraktion) unter die 10 x mikroskopischen Objektivlinse. Ändern Sie die mikroskopische Vergrößerung 40 x, und drehen Sie die CCD Kameraausrichtung um die Myozyten in horizontaler Position zu halten.
6. Rahmen der einzelnen Myozyten durch Anpassung des Zelle Rahmung Adapters. Sicherzustellen, dass der Hintergrund klar ist.
7. Der Myozyten, das Licht von einer Xenon-Lampe mit 340 und 380 nm Wellenlänge Erregung Filter, entlarven und Bild der Myozyten durch ein Objektiv 40 X. Erkennen Fluoreszenzsignal bei 510 nm. In der Zwischenzeit beachten Sie die Sarkomers Längenänderungen der der Myozyten und Aufzeichnen der Softedge-Modul gleichzeitig zu verwenden.
8. Datensatz Fluoreszenz durch ein Dual-Erregung Fluoreszenz-Photomultiplier-System. Das Aufnahmeprogramm für das Kalzium imaging-System ausführen, klicken Sie " Datei/neue Datei " erstellen Sie eine neue Aufnahmedatei, und klicken Sie auf die " Start "-Taste, um synchron Datensatzlänge Fluoreszenz und Sarkomers.

6. Bewertung der SR Ca ^{2 +} Reserve und diastolische Ca ^{2 +} Removal-Funktion ^{7 , 8 , 9}

1. Interlink der " Aux Out " Seehafen der Stimulator mit den " Analog In " Port auf der Ventilsteuerung (z. B. Ventil Kommandant, siehe Tabelle der Materialien) über ein BNC-Kabel (mit TTL-Signal synchronisiert).
2. Voreingestellte ein Programm für die Perfusion Schaltventile automatisch als zuvor beschriebenen ^{8 , 9}; Ausführliche Anleitung zum Betrieb sind wie folgt aufgeführt.
   1. Vorgabe der Parameter in das Ventil Steuerungs-Software gemäß Tabelle 2, und klicken Sie auf die " Download " Button zum download der Sequenzablaufs in das Programm geladen. Klicken Sie auf die " Triggäh "-Taste, um den Trigger aktivieren.
      Hinweis: Die Ventilsteuerung die Sequenz nach Erhalt TTL-Signal ausführen kann.
   2. Den Stimulator zu Sequenzmodus voreingestellt, und legen Sie die Parameter gemäß Tabelle 3.
3. Legen Sie den Stimulator am " S1 Schritt ", die LV Tempo Myozyten bei 1 Hz. beginnen die Nadel Perfusion mit der Geschwindigkeit von 1,5 mL/min mit NT Lösung.
   Hinweis: Da die Geschwindigkeit des Wildbaches Nadel schneller als Kammer Perfusion ist, unterscheidet die Lichtbrechung des Wildbaches Nadel die Lichtbrechung der Kammer Perfusion. Der Unterschied der Lichtbrechung zeigt den Bereich der effektiven Nadel Perfusion, umgibt das Ziel Myozyten.
4. Wählen Sie ein Ziel Myozyten unter den low-Power mikroskopische Ansicht (in der Reihenfolge der downstream, upstream), und stellen Sie sicher kann erreicht werden durch das micro Spitze des Bleistifts. Ändern Sie die Mikroskop-Vergrößerung auf 400 X. Drehen Sie die CCD Kameraausrichtung um die Myozyten in die horizontale Position zu halten. Stellen Sie die rechteckige Blende unter der Zelle Rahmung Adapter zu einem geeigneten Fenster, das mit der Myozyten erfüllt. Sicherstellen Sie, dass es minimaler Hintergrund; lassen Sie nicht andere Myozyten oder tote Zellenrückstand in diesem Fenster.
5. Passen Sie die Position des Stifts auf dem Mikromanipulator fixiert, und setzen Sie sorgfältig die Mikro Spitze in der Entfernung des Radius des Gesichtsfeld um Ziel Myozyten unter 400 x Mikroskop-Vergrößerung.
6. Stellen Sie die Nadel Stream Bereich meist das Ziel Myozyten und stellen Sie sicher, dass die Myozyten durch die Nadel Strömung weggespült werden kann nicht.
7. Nach 60 s grundlegende Tempo, Rollen Sie den Stimulator-Cursor, um die " D2 Schritt ".
   Hinweis: Der Rest des Protokolls wird automatisch von der Stimulator und Ventilsteuerung ausgeführt werden. Basierend auf der oben genannten Einstellung, das Protokoll ausgeführt werden konnte automatisch wie in Abbildung 2A, 1 Hz grundlegende Tempo mit NT-Lösung für 60 s. Dann pause, Tempo und Verzögerung für 2 s, wechseln Sie schnell in 10 mM Koffein Perfusion für 15 s (freizugebende funktional Ca ^{2 +}-Lager in der SR), und wechseln Sie dann zurück zur NT-Lösung.
8. Am Ende der Aufnahme erkennen die Hintergrundfluoreszenz für einzelne Myozyten. Klicken Sie auf die " Pause " Taste, um die Datei aufnehmen, Anhalten der mikroskopische Blick auf einen nahe gelegenen leeren Bereich bewegen. Klicken Sie auf die " Platte " Taste, um die Aufzeichnung für Sekunden fortzusetzen, und notieren Sie numerische 340 und 380 nm Intensitätswerte für Untergrundkorrektur.
9. Offen die " Betrieb/konstante " des Dialogfeldes "" und füllen Sie die Werte in den " Hintergrund " bilden, beziehungsweise; die Software korrigiert Fura-2 Verhältniswerte durch Subtraktion Hintergrund.

7. Daten-Analyse- ⁹

1. für Messungen von Kalzium Transienten und Sarkomers Verkürzung auf die grundlegende Tempo Etappe, durchschnittliche zucken Hülsenfrüchte, zu analysieren und dann dynamische Parameter, wie z. B. Kalzium Transienten, die Zeitkonstante des Calcium transiente Zerfall (Tau-1 Hz), mit Hilfe der Software automatisch.
   Hinweis: Wenn die Software Segment Verfall nicht gut passt, exportieren die Abnahme-Ablaufverfolgung für manuelle Mono-exponentielle Kurvenanpassung.
2. Für Koffein-induzierte Kalzium Impulse, wählen Sie nur den Puls mit einer steilen Welle für die Analyse von Kalzium-Removal-Funktion. Zellen mit Signalstörungen, abnorme Puls oder diejenigen, die Weg in der Mitte floss ausschließen.
3. Messen die Amplitude des Impulses Koffein-induzierte Kalzium (Ca-Koffein, einen Index der SRCa ^{2 +} Reserve).
4. Erhalten die Zeitkonstante Verfall der Koffein-induzierte Kalzium Puls (Tau-Koffein) durch den Mono-exponentielle Kurve Einbau (10 s Dauer) manuell aus Software ( Abbildung 2).

Ergebnisse

Wir zeigen hier, Streptozocin (STZ) - induzierte diabetische Ratten (DM) und Alter abgestimmten Sprague - Dawley (SD) Ratten zum Beispiel. 8 Wochen alten männliche SD-Ratten (200 ± 20 g) erhielt eine einmalige intraperitoneale Injektion von STZ (70 mg/kg, Ip) für den DM-Gruppe oder Citrat-Puffer für die Kontrollgruppe. Eine Woche nach STZ Verwaltung, Ratten mit Blutzucker > 16,7 Mmol/L wurden als Diabetiker. Nach 8 Wochen wurden die LV Myozyten enzymatisch isoliert. Nach Kalzium W...

Diskussion

Kalzium-Flussmittel befreit die SR ist Ca^{2 +} Hauptquelle für Systole im Herzen. Teilweise, die Amplitude der SR Ca^{2 +} Content und die gebrochene Ca reflektieren^{2 +} SR befreit die SR Ca^{2 +} Reserve für kardiale Kontraktion zur Verfügung. Auf der anderen Seite hängt die Ca^{2 +} Reserve von SR von der Fähigkeit der SR Ca^{2 +} Reuptake, Ca^{2 +} Leck von SR und ihr Gleichgewicht über die SR während der Diastole^12,

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Alfa Aesar	E31K43
MgCl2	Alfa Aesar	I02T070
KCl	Alfa Aesar	G22u018
HEPEs	Sigma	SLBM 7880V
D-Glucose	Alfa Aesar	10189341
NaOH	Alfa Aesar	10154048
KOH	Alfa Aesar	10144B17
KH2PO4	Alfa Aesar	F21S033
MgSO4	Alfa Aesar	C31U038
L-Glutamic	Alfa Aesar	10149849
Taurine	Alfa Aesar	J5407a
EGTA	Sigma	SLBM6826V
Collagenase A	Roche	10103586001
Collagenase Type II	Worthington	45k16005
BSA	Roche	735094
caffeine	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscope	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff system	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 links
Perfusion chamber	IonOptix	FHD
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA	VC 3-8
valve commander software	ALA	VC 3 1.0.1.2
Precision flow regulator	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Removable Tip	AutoMate Scientific	360um i.d.
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems	IonOptix	Hyperswitch
Recording software	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436