Valutazione del reticolo sarcoplasmico calcio intracellulare e riserva diastolica calcio rimozione nei cardiomiociti ventricolari isolati

Riepilogo

Riciclaggio di calcio intracellulare svolge un ruolo critico nella regolazione della funzione sistolica e diastolica in cardiomiociti. Qui, descriviamo un protocollo per la valutazione del reticolo sarcoplasmico Ca^{2 +} riserva e funzione di rimozione del calcio diastolica in cardiomiociti da un sistema di imaging di calcio.

Abstract

Riciclaggio di calcio intracellulare svolge un ruolo critico nella regolazione della funzione sistolica e diastolica in cardiomiociti. Cardiaco reticolo sarcoplasmatico (SR) funge da Ca^{2 +} serbatoio per contrazione, che reuptakes intracellulare Ca^{2 +} durante il rilassamento. La SR Ca^{2 +} riserva disponibile per beats è determinata per contractibility cardiaco, e la rimozione di intracellulare di Ca^{2 +} è critica per la funzione cardiaca diastolica. In alcune condizioni fisiopatologiche, come il diabete e infarto, alterato del calcio liquidazione e SR Ca^{2 +} store nei cardiomyocytes possono essere coinvolti nel progresso della disfunzione cardiaca. Qui, descriviamo un protocollo per la valutazione SRCa^{2 +} riserva e diastolica Ca^{2 +} rimozione. Brevemente, un singolo dei cardiomiociti era enzimaticamente isolato, e l'intracellulare Ca^{2 +} fluorescenza indicata da Fura-2 è stata registrata da un sistema di imaging del calcio. Per assumere caffeina per indurre il rilascio totale di SR Ca^{2 +} , abbiamo preimpostato un programma di interruttore automatico di aspersione di interconnessione del sistema di stimolazione e il sistema di perfusione. Quindi, l'adattamento delle curve mono-esponenziale è stato utilizzato per analizzare le costanti di tempo di decadimento di calcio transitori e impulsi di calcio indotta da caffeina. Di conseguenza, il contributo del SR Ca^{2 +}-ATPasi (SERCA) e Na⁺-Ca^{2 +} scambiatore (NCX) alla rimozione del calcio diastolica è stato valutato.

Introduzione

Calcio intracellulare ([Ca^{2 +}]_i) riciclaggio svolge un ruolo critico nella regolazione della funzione sistolica e diastolica in cardiomiociti¹. Come sappiamo, il calcio Ca^{2 +} rilascio indotto avvia l'accoppiamento, di eccitazione-contrazione che traducono il segnale elettrico alla contrazione. La depolarizzazione della membrana attiva il sarcolemma Ca L-tipo^{2 +} canali, che inducono il Ca^{2 +} rilasciano da SR nel citoplasma attraverso recettori della rianodina 2 (RyR2). I transitori elevati citoplasmico Ca^{2 +} avvia la contrazione delle miofibrille. Durante la diastole, citoplasmici Ca^{2 +} è reuptaken nel SR per mezzo di SR Ca^{2 +}-ATPase 2 (SERCA2) e pompato fuori del cardiomyocyte via Na⁺-Ca^{2 +} scambiatore (NCX)². Questo processo conduce alla contrazione-rilassamento riciclaggio nei cardiomiociti.

Il SR cardiaco è una rete di intracellulare della membrana che circonda il macchinario contrattile. Esso funge da Ca^{2 +} serbatoio per la contrazione, e riassorbe intracellulare di Ca^{2 +} durante il rilassamento. La SR Ca^{2 +} riserva disponibile per beats è determinata per la contrattilità cardiaca. Nel frattempo, la rimozione di intracellulare di Ca^{2 +} è critica per la diastole cardiaca. In alcune condizioni fisiopatologiche, come diabete e infarto, distanza^{2 +} Ca alterata e depresso SR Ca^{2 +} negozio in cardiomiociti può essere coinvolti nel processo di disfunzione cardiaca^{2,3 ,4}.

Per misurare il rilascio di SR Ca^{2 +} e Ca^{2 +} rimozione diastolica in cardiomiociti, esistono due approcci ampiamente usati: l'integrità della corrente NCX basato su patch clamp^5,6e la Ca indotta da caffeina ^{2 +} pulse basato su Ca^{2 +} fluorescenza imaging^7,8,9. Il primo approccio dipende dal fatto che il Ca^{2 +} rilasciato dal SR è in gran parte pompato fuori dalla cella di NCX. Tuttavia, questo approccio è limitato dalla sua esigenza di attrezzature avanzate e abile operazione. Nello studio presente, descriviamo un metodo conveniente per valutare la riserva di SR Ca^{2 +} e Ca^{2 +} rimozione nei miociti misurando un indotta da caffeina Ca^{2 +} impulso basato su un Ca^{2 +} fluorescenza sistema di imaging. Brevemente,^{intracellulare Ca 2 +} la fluorescenza è indicata da Fura-2. Di interconnessione del sistema di stimolazione e il sistema di perfusione, vi presentiamo un programma per la perfusione di commutazione e automaticamente il sistema di stimolazione. 10 millimetri di caffeina è stata impiegata per indurre rapidamente il totale Ca^{2 +} rilascio in SR. Le costanti di tempo di decadimento esponenziale (Tau) di calcio transitori e impulsi di calcio indotta da caffeina sono state ottenute da mono-esponenziale curva di raccordo, che riflettono la contribuiscono di SERCA e NCX alla diastolica Ca^{2 +} rimozione di conseguenza.

Protocollo

tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dal comitato di uso presso centro di ricerca sperimentale, Accademia delle scienze mediche cinese Cina e Università di Zhejiang e istituzionali Animal Care.

1. preparazione della soluzione

1. preparare tutte le soluzioni, come descritto nella tabella 1.

2. isolamento di sinistra ventricolare (LV) cardiomiociti

Nota: LV cardiomiociti sono isolati enzimaticamente utilizzando un sistema di perfusione Langendroff come descritto in precedenza ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11}.

1. Ha istituito il sistema di perfusione Langendroff. Riempire il sistema di perfusione con soluzione di Tyrode normale (NT), impostare la temperatura a 36,5 ° C ed eliminare eventuali bolle d'aria nel tubo.
2. Pesare e anestetizzare un ratto Sprague-Dawley tramite l'iniezione intraperitoneale (ip) di cloralio idrato (400 mg/kg). Confermare lo stato anestetico valutando la risposta di pizzico di punta o coda dopo 5 min
3. Aprire la cavità addominale sotto il processo xifoideo con una forbice chirurgica, sollevare il processo xifoideo e aprite la cassa con la forbice. Rimuovere il pericardio, sollevare leggermente il cuore con pinzetta, identificare l'arco aortico e tagliare il cuore di forbici dalla radice dell'aorta.
4. Trasferire il cuore a un piatto di 60 mm e lavare con soluzione di NT. Mantenere premuto l'aorta con due pinze di micro-dissezione e montarla sulla cannula di perfusione di Langendorff, poi legare saldamente l'aorta sulla cannula utilizzando suture chirurgiche.
   Nota: Un operatore esperto può terminare questo processo entro 15 s.
5. Irrorare il cuore con una soluzione di 30 mL NT per ripristinare la circolazione delle arterie coronarie. Passare quindi il perfusato 30 mL Ca ^{2 +}-libera soluzione di Tyrode (10mm taurina, 1 mg/mL BSA) per arrestare il battito cardiaco. Successivamente, passare il perfusato alla soluzione di isolamento di collagenasi A (0,6 mg/mL) per digestione degli enzimi di.
   Nota: Uso della collagenosi A per esperimenti con ratti diabetici, o collagenasi II per esperimenti senza ratti diabetici.
6. Dopo la digestione per 20-25 min, cambiare rapidamente la soluzione di perfusione per il Ca ^{2 +}-soluzione di Tyrode per arrestare ulteriore digestione libera. Quindi, tenere il cuore con il forcipe, tagliarlo dalla cannula e mettere il cuore in un piatto di 35 mm contenente soluzione KB (Vedi tabella 1).
7. Sezionare la parete di LV con forbici e pinze. Tagliare l'atrio, ventricolo destro e la zona di giunzione atrioventricolare. Il tessuto restante è il LV; trasferirlo in un piatto nuovo 35mm con soluzione KB. Tritare il tessuto LV in piccoli pezzi.
8. Delicatamente pipettare i pezzi con un contagocce di plastica filtrato e risospendere in soluzione 10 mL KB.
9. Filtrare le cellule con 150 µm filtro di apertura in acciaio inox e trasferimento in una provetta da centrifuga da 15 mL. Centrifugare a 150 x g per 30 s e scartare il surnatante. Risospendere i miociti in soluzione 10 mL KB, libero accontentarsi di 6 min, eliminare il supernatante e risospendere il pellet in soluzione 10 mL KB.
   Nota: Tutti i passaggi sono stati eseguiti a 36 ° C nelle soluzioni gassati con 100% O ₂.

3. Reintroduzione del calcio

1. dopo assestamento per 20 min in soluzione KB, scartare il surnatante e risospendere i miociti con soluzione di reintroduzione di calcio A (0,3 mM Ca ^{2 +}, 4,5 mL Ca ^{2 +}-soluzione gratuita Tyrode, NT di 1,5 mL di soluzione) per 10 min.
2. Ripetere la procedura con soluzione di reintroduzione del calcio B (0,3 mM Ca ^{2 +}, 3 mL Ca ^{2 +}-soluzione gratuita Tyrode, NT di 3 mL di soluzione).
3. Ripetere la procedura con soluzione di NT (1,2 mM Ca ^{2 +}) per purificare i miociti disponibili. Memorizzare i miociti isolati di LV in questa soluzione e studiarli entro 4-6 h.

4. Set Up di aspersione System

1. collegare il tubo di afflusso con la soluzione di NT per aspersione di alloggiamento ( Figura 1A).
2. Per la perfusione dell'ago del miocita destinazione, collegare la punta collettore multi-canna (ad es., matita aspersione, indicato come matita d'ora in poi), risolto nel micromanipolatore, alla valvola controllato sistema di perfusione. Aggiungere la soluzione di NT e soluzione di caffeina 10 mM per ogni colonna della matita ( Figura 1A).
3. Evacuare eventuali bolle d'aria nei tubi per evitare il blocco aria.
4. Contare il numero di goccia dalla punta micron della matita per 10 s e di regolare manualmente il regolatore di flusso per mantenere la velocità di flusso alla velocità approssimativa di 3 flebo/10 s.

5. Misure di Ca intracellulare ^{2 +} transitori e accorciamento del sarcomero ^{7 , 8 , 9}

1. sospensione di cellule di pipetta 10 µ l della diapositiva, contare i numeri delle cellule di un contatore di cellule sotto il microscopio e calcolare la densità. Diluire i miociti una concentrazione approssimativa di 50.000 cellule/mL.
2. Aggiungi il Fura-2 acetossimetil (AM) magazzino (un colorante sensibile di calcio) in 1 mL di sospensione dei miociti per portare la concentrazione finale di 2 µM. tenere al buio per 20 min a temperatura ambiente.
3. Centrifuga a 150 g per 30 s e risospendere i cardiomiociti con soluzione NT 2 volte.
4. Disabilita spegne la luce e mantenere le cellule nel buio. Posto i miociti nella camera di perfusione per 15 min. Poi iniziare la perfusione di camera (1,5 mL/min) con soluzione di NT. Passo i miociti con stimolazione di campo 1 Hz utilizzando uno stimolatore (onda durata 4,0 ms, ampiezza di impulso 8.0 V) per 5 min.
5. Selezionare un miocita con buona forma (forma di asta, spigoli vivi e deselezionare striature trasversali) e twitch stimolato stabile (nessuna contrazione spontanea) sotto i 10 x lente microscopica di obiettivo. Successivamente, modificare l'ingrandimento al microscopio a 40x e ruotare l'orientamento della telecamera CCD per mantenere miocita in posizione orizzontale.
6. Telaio singolo miocita regolando l'adattatore di inquadratura delle cellule. Garantire che lo sfondo è chiaro.
7. Esporre i miociti alla luce emessa da una lampada allo xeno, con 340 380 nm lunghezza d'onda di eccitazione filtri o e l'immagine i miociti attraverso un obiettivo 40x. Rilevare il segnale di fluorescenza a 510 nm. Nel frattempo, notare i cambiamenti di lunghezza del sarcomero dei miociti e registrare utilizzando il modulo del soft-bordo contemporaneamente.
8. Record di fluorescenza da un sistema di fotomoltiplicatore dual-eccitazione fluorescenza. Eseguire il programma di registrazione per il calcio sistema di imaging, fare clic " File/Nuovo File " per creare un nuovo file di registrazione, scegliere il " inizio " pulsante per lunghezza in modo sincrono record di fluorescenza e sarcomero.

6. Valutazione di SR Ca ^{2 +} riserva e diastolica Ca ^{2 +} rimozione funzione ^{7 , 8 , 9}

1. Interlink la " Aux Out " porta in lo stimolatore con la " In analogici " porta sul sistema di controllo della valvola (ad es., comandante della valvola, vedere Tabella materiali) da un cavo BNC (per sincronizzare il segnale TTL).
2. Preset un programma per le valvole di aspersione di commutazione automaticamente come descritto in precedenza ^{8 , 9}; Procedura dettagliata per il funzionamento è elencata come segue.
   1. Preset i parametri della valvola di controllano software secondo la tabella 2 e scegliere il " Download " pulsante per scaricare la sequenza caricati nel programma. Fare clic sul " Trigger " pulsante per attivare la funzione trigger.
      Nota: Il sistema di controllo della valvola possa eseguire la sequenza dopo la ricezione del segnale TTL.
   2. Preset lo stimolatore alla modalità di sequenza e impostare i parametri come da tabella 3.
3. Impostare lo stimolatore a " S1 passo " di ritmo LV miociti a 1 Hz. iniziare la perfusione dell'ago alla velocità di 1,5 mL/min con soluzione NT.
   Nota: Perché la velocità del flusso dell'ago è più veloce di aspersione di camera, la rifrazione della luce del flusso dell'ago è diversa dalla rifrazione della luce di aspersione di camera. La differenza di rifrazione della luce indica la gamma di aspersione efficace dell'ago, che circonda il bersaglio del miocita.
4. Selezionare un destinazione del miocita sotto la visualizzazione microscopica di bassa potenza (nella sequenza di a valle verso Monte), e assicurarsi che si raggiunge dalla micro punta della matita. Modificare l'ingrandimento del microscopio 400x. Ruotare l'orientamento della telecamera CCD per mantenere miocita in posizione orizzontale. Regolare l'apertura rettangolare sotto la scheda di inquadratura delle cellule a una finestra adatta che riempie con i miociti. Assicurarsi che vi sia un fondo minimo; non consentire altri miociti o detriti cellulari morti in questa finestra.
5. Regolare la posizione della matita fissata sul micromanipolatore e posizionare con cura la micro punta alla distanza del raggio del campo di visione per il destinazione del miocita sotto 400 x ingrandimento del microscopio.
6. Regolare l'intervallo di flusso dell'ago per gran parte coprire il bersaglio del miocita e assicurarsi che miocita non può essere spazzato via dal flusso dell'ago.
7. Dopo 60 s base stimolazione, rotolare il cursore di stimolatore per il " passo D2 ".
   Nota: Il resto del protocollo verrà eseguito automaticamente dal sistema di controllo di valvola e stimolatore. In base all'impostazione di cui sopra, il protocollo potrebbe essere eseguito automaticamente come in Figura 2A, 1 Hz base stimolazione con soluzione di NT per 60 s. Quindi mettere in pausa la cadenza e ritardo per 2 s, passare rapidamente alla perfusione di caffeina di 10 mM per 15 s (per funzionalmente rilasciare Ca ^{2 +} archiviazione nella Repubblica slovacca) e quindi passare nuovamente alla soluzione NT.
8. Alla fine della registrazione, rilevare la fluorescenza di fondo per singoli miociti. Fare clic sul " pausa " pulsante per mettere in pausa il file di registrazione, spostare la vista al microscopio in una vicina area vuota. Fare clic sul " record " pulsante per riprendere la registrazione per secondi e registrare valori numerici 340 e 380 nm intensità per la correzione di fondo.
9. Aperto il " operazione/costante " nella finestra di dialogo e riempire i valori nel " sfondo " formano, rispettivamente; il software può correggere i valori di rapporto di Fura 2 sottraendo background.

7. Dati analisi ⁹

1. per misure di transienti di calcio e sarcomero accorciamento nella fase di stimolazione base, media gli impulsi di contrazione e quindi analizzare parametri dinamici, ad esempio transienti di calcio, la costante di tempo di decadimento transitoria di calcio (Tau-1 Hz), utilizzando il software automaticamente.
   Nota: Se il software non si adatta bene il segmento di decadimento, esportare la traccia di declino per il montaggio manuale mono-esponenziale curva.
2. Per gli impulsi di calcio indotta da caffeina, selezionare solo il polso con un'onda ripida per l'analisi della funzione di rimozione del calcio. Escludere le celle con dispersione di segnale, impulso anormale o quelli che scorreva via midway.
3. Misurare l'ampiezza dell'impulso indotta da caffeina calcio (Ca-caffeina, un indice di SRCa ^{2 +} riserva).
4. Per ottenere la costante di tempo di decadimento dell'impulso di calcio indotta da caffeina (Tau-caffeina) mono-esponenziale curva raccordo (durata 10 s) manualmente da software ( Figura 2).

Risultati

Qui, vi illustriamo streptozotocin (STZ) - ratti diabetici (DM) indotti e pari età Sprague - Dawley (SD) ad esempio i ratti. 8-settimana-vecchio maschio SD ratti (200 ± 20 g) hanno ricevuto una singola iniezione intraperitoneale di STZ (70 mg/kg, ip) per il buffer di gruppo o citrato di DM per il gruppo di controllo. Una settimana dopo amministrazione di STZ, ratti con glicemia > 16.7 mmol/L sono stati considerati diabetici. Dopo 8 settimane, i miociti di LV sono stati enzimaticamen...

Discussione

Flusso di calcio rilasciato dal SR è il Ca^{2 +} fonte principale per sistole nel cuore. A una certa misura, l'ampiezza del SR Ca^{2 +} contenuto e frazionario Ca^{2 +} rilasciato dal SR riflettono la SR Ca^{2 +} riserva disponibile per la contrazione cardiaca. D'altra parte, il Ca^{2 +} riserva di SR dipende dalla capacità del loro equilibrio, Ca^{2 +} perdita di SR e SR Ca^{2 +} reuptake attraverso la SR durante la diastole^12,<...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Alfa Aesar	E31K43
MgCl2	Alfa Aesar	I02T070
KCl	Alfa Aesar	G22u018
HEPEs	Sigma	SLBM 7880V
D-Glucose	Alfa Aesar	10189341
NaOH	Alfa Aesar	10154048
KOH	Alfa Aesar	10144B17
KH2PO4	Alfa Aesar	F21S033
MgSO4	Alfa Aesar	C31U038
L-Glutamic	Alfa Aesar	10149849
Taurine	Alfa Aesar	J5407a
EGTA	Sigma	SLBM6826V
Collagenase A	Roche	10103586001
Collagenase Type II	Worthington	45k16005
BSA	Roche	735094
caffeine	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscope	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff system	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 links
Perfusion chamber	IonOptix	FHD
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA	VC 3-8
valve commander software	ALA	VC 3 1.0.1.2
Precision flow regulator	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Removable Tip	AutoMate Scientific	360um i.d.
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems	IonOptix	Hyperswitch
Recording software	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436