Évaluation de réticulum sarcoplasmique Calcium réserve et intracellulaires de Calcium diastolique enlèvement dans les Cardiomyocytes ventriculaires isolées

Résumé

Recyclage de calcium intracellulaire joue un rôle essentiel dans la régulation de la fonction systolique et diastolique dans les cardiomyocytes. Nous décrivons ici un protocole pour évaluer le réticulum sarcoplasmique Ca^{2 +} réserve et fonction de suppression de calcium diastolique dans les cardiomyocytes en un système d’imagerie de calcium.

Résumé

Recyclage de calcium intracellulaire joue un rôle essentiel dans la régulation de la fonction systolique et diastolique dans les cardiomyocytes. Réticulum sarcoplasmique cardiaque (SR) sert d’un Ca^{2 +} réservoir de contraction, qui reuptakes intracellulaire Ca^{2 +} lors du relâchement. La SR Ca^{2 +} réserve disponible pour bat est déterminée pour la contractilité cardiaque, et la suppression du Ca intracellulaire^{2 +} est critique pour la fonction cardiaque diastolique. Dans certaines conditions physiopathologiques, comme le diabète et l’insuffisance cardiaque, le dégagement de calcium ayant une déficience et SR Ca^{2 +} store dans les cardiomyocytes peuvent être impliqués dans la progression du dysfonctionnement cardiaque. Nous décrivons ici un protocole pour évaluer SRCa^{2 +} réserve et diastolique Ca^{2 +} suppression. En bref, un cardiomyocyte unique a été isolée par voie enzymatique, et la fluorescence^{2 +} Ca intracellulaire indiquée par Fura-2 a été enregistrée par un système d’imagerie calcique. Pour utiliser une caféine pour induire la libération totale de SR Ca^{2 +} , nous prédéfinir un assorties de perfusion automatique interconnexion la stimulation et le système de perfusion. Ensuite, l’ajustement de la courbe exponentielle mono a été utilisé pour analyser les constantes de temps de désintégration des transitoires de calcium et des légumineuses de calcium induit par la caféine. En conséquence, la contribution de la SR Ca^{2 +}-ATPase (SERCA) et Na⁺-Ca^{2 +} échangeur (NCX) à l’élimination du calcium diastolique a été évaluée.

Introduction

Calcium intracellulaire ([Ca^{2 +}]_i) recyclage joue un rôle essentiel dans la régulation de la fonction systolique et diastolique dans les cardiomyocytes¹. Comme nous le savons, la calcium Ca^{2 +} libération induite initie l’excitation-contraction de couplage, qui traduisent le signal électrique à la contraction. Dépolarisation de la membrane active le sarcolemme Ca L-type canaux^{2 +} , qui induisent la Ca^{2 +} libèrent de SR dans le cytoplasme par l’intermédiaire de récepteurs de la ryanodine (RyR2) de 2. Les transitoires élevées cytoplasmique Ca^{2 +} initie la contraction des myofibrilles. Au cours de la diastole, cytoplasmique Ca^{2 +} est reuptaken dans la SR au moyen de la SR Ca^{2 +}-ATPase 2 (SERCA2) et pompé hors du cardiomyocyte via la Na⁺-Ca^{2 +} échangeur (NCX)². Ce processus conduit à la contraction-relaxation recyclage dans le cardiomyocyte.

Le SR cardiaque est un réseau de membrane intracellulaire qui entoure la machinerie contractile. Il sert un Ca^{2 +} réservoir pour contraction et il réabsorbe intracellulaire Ca^{2 +} lors du relâchement. La SR Ca^{2 +} réserve disponible pour bat est déterminée pour la contractilité cardiaque. Pendant ce temps, la suppression du Ca intracellulaire^{2 +} est critique pour la diastole cardiaque. Sous certaines conditions physiopathologiques, comme le diabète et une insuffisance cardiaque, ayant une déficience Ca^{2 +} dégagement et déprimé SR Ca^{2 +} magasin dans les cardiomyocytes peut être impliqué dans le processus de la dysfonction cardiaque^{2,3 ,4}.

Pour mesurer la libération de SR Ca^{2 +} et diastolique Ca^{2 +} enlèvement dans les cardiomyocytes, il y a deux approches couramment : l’intégrité du NCX courant issu des patch clamp^5,6et l’autorité de certification induit par la caféine ^{2 +} pulse issu de^{Ca 2 +} fluorescence d’imagerie^7,8,9. La première approche repose sur le fait que le Ca^{2 +} libéré de la SR est largement pompé hors de la cellule par NCX. Toutefois, cette approche est limitée par son exigence d’équipements de pointe et l’exploitation habile. Dans la présente étude, nous décrivons une approche pratique pour évaluer le SR Ca^{2 +} réserve et Ca^{2 +} enlèvement dans les myocytes en mesurant un induit par la caféine Ca^{2 +} pulse basé sur un Ca^{2 +} fluorescence système d’imagerie. En bref, fluorescence intracellulaire de Ca^{2 +} est indiqué par Fura-2. Par interconnexion du système de perfusion et un système de stimulation, nous présentons un programme pour passer la perfusion et le rythme de système automatiquement. 10 mM de caféine a été employé pour induire rapidement la libération totale de Ca^{2 +} dans le SR. Les constantes de temps de décroissance exponentielle (Tau) des transitoires de calcium et des légumineuses de calcium induit par la caféine proviennent de la courbe exponentielle mono, qui reflètent la contribution de SERCA et NCX diastolique Ca^{2 +} retrait en conséquence.

Protocole

toutes les expérimentations animales ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité de l’urbanisme au centre de recherche expérimentale, Académie chinoise des Sciences médicales chinoises et Université de Zhejiang et d’institutionnels animalier.

1. préparation de la solution

1. préparer toutes les solutions tel que décrit dans le tableau 1.

2. isolement de gauche ventricule (LV) Cardiomyocytes

Remarque : LV cardiomyocytes sont isolés par voie enzymatique en utilisant un système de perfusion de Langendroff comme décrit précédemment ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11}.

1. Mis en place le système de perfusion Langendroff. Remplir le système de perfusion avec une solution normale Tyrode (NT), réglez la température à 36,5 ° C et éliminer les bulles d’air dans le tube.
2. , Peser et anesthésier un rat Sprague-Dawley par injection intrapéritonéale (ip) de l’hydrate de chloral (400 mg/kg). Confirmer l’État anesthésique en évaluant la réponse de pincée de queue ou de l’orteil après 5 min.
3. Ouvrir la cavité abdominale sous le processus xiphoïde avec ciseaux chirurgicaux, soulever le processus xiphoïde et ouvrir le coffre avec le ciseaux. Retirez le péricarde, légèrement soulever le cœur avec une pince courbée, identifier la crosse aortique et coupez le cœur par les ciseaux de la racine de l’aorte.
4. Transférer le coeur dans un plat de 60 mm et lavez-le avec une solution NT. Tenez l’aorte avec deux micro-dissection forceps, montez-la sur la canule de perfusion de Langendorff et puis fermement ligaturer l’aorte sur la canule à l’aide de sutures chirurgicales.
   Remarque : Un opérateur habile peut finir ce processus au sein de 15 s.
5. Perfuse le cœur avec une solution de 30 mL NT pour récupérer la circulation des artères coronaires. Mettez ensuite le perfusat à 30 mL Ca ^{2 +}-gratuit solution Tyrode (Taurine, 1 mg/mL de BSA de 10 mM) pour arrêter les battements du cœur. Ensuite, basculez le perfusat solution d’isolation de collagénase A (0,6 mg/mL) pour une digestion enzymatique.
   NOTE : Utilisez de collagénase A des expériences avec des rats diabétiques ou collagénase II pour les expériences sans rats diabétiques.
6. Après digestion pendant 20-25 min, passer rapidement la solution de perfusion à la Ca ^{2 +}-gratuit solution Tyrode pour arrêter plus de digestion. Puis, maintenez le cœur avec une pince, coupe-la de la canule et placer le cœur dans un plat de 35 mm contenant une solution KB (voir tableau 1).
7. De disséquer le mur LV avec ciseaux et pinces. Couper l’oreillette, le ventricule droit et le quartier de la jonction auriculo-ventriculaire. Le tissu restant est le LV ; transférer dans une autre boite de 35 mm avec solution KB. Émincer le tissu LV en petits morceaux.
8. Doucement, déposer les morceaux avec un compte-gouttes en plastique filtré et remettre en suspension dans une solution de 10 mL KB.
9. Filtrer les cellules avec 150 µm ouverture inox filtre et transfert dans un tube à centrifuger 15 mL. Centrifuger à 150 g pendant 30 s et jeter le surnageant. Remettre en suspension les myocytes dans une solution de 10 mL KB, sans se contenter de 6 min, jeter le surnageant et remettre en suspension l’extrait concentré dans une solution de 10 mL KB.
   Remarque : Toutes les mesures ont été effectuées à 36 ° C dans des solutions gazées avec 100 % O ₂.

3. Réintroduction de calcium

1. après s’être installé pendant 20 min dans une solution KB, éliminer le surnageant et remettre en suspension les myocytes avec solution de réintroduction de calcium A (0. 3 mM Ca ^{2 +}, 4,5 mL Ca ^{2 +}-solution Tyrode libre, solution de 1,5 mL NT) pour 10 min.
2. Répéter la procédure ci-dessus avec solution de réintroduction de calcium B (0,3 mM Ca ^{2 +}, 3 mL Ca ^{2 +}-solution gratuite de Tyrode, solution 3 mL NT).
3. Répéter la procédure ci-dessus avec une solution de NT (1,2 mM Ca ^{2 +}) pour purifier les myocytes disponibles. Stocker les LV des myocytes isolés dans cette solution et observe-les dans 4-6 h.

4. Set Up du système de Perfusion

1. connecter le tube d’entrée avec la solution pour perfusion ( Figure 1 a) de la chambre de NT.
2. Pour la perfusion de l’aiguille de la cible de myocyte, branchez la fiche multi baril collecteur (p. ex., crayon de la perfusion, dénommé crayon désormais), fixe le micromanipulateur, au robinet commandé par perfusion. Ajouter la solution de NT et solution de caféine de 10 mM à chaque colonne du crayon ( Figure 1 a).
3. Évacuer les bulles d’air dans les tubes pour éviter le blocage de l’air.
4. Compter le nombre de goutte à goutte de la pointe de micron du crayon pour 10 s et de régler manuellement le régulateur de débit pour maintenir la vitesse d’écoulement à une vitesse approximative de 3 goutte à goutte/10 s.

5. Mesures de Ca intracellulaire ^{2 +} transitoire et le raccourcissement du sarcomère ^{7 , 8 , 9}

1. Pipette 10 µL de la suspension cellulaire dans la diapositive, compter le nombre de cellules par un compteur de cellules au microscope et calculer la masse volumique. Diluer les myocytes à une concentration approximative de 50 000 cellules/mL.
2. Ajouter la Fura-2 acétoxyméthyl (AM) stock (un colorant photosensible de calcium) dans une suspension de 1 mL de myocytes pour abaisser la concentration finale de 2 µM. maintenir dans l’ignorance pendant 20 min à température ambiante.
3. Centrifuger à 150 g pour 30 s et remettre en suspension les cardiomyocytes avec solution NT 2 fois.
4. Tour hors de la lumière et de garder les cellules dans l’obscurité. Placer les myocytes dans la chambre de perfusion pendant 15 min. Ensuite, démarrez la perfusion de chambre (1,5 mL/min) avec solution de NT. Les myocytes de pair avec une stimulation de champ de 1 Hz à l’aide d’un stimulateur (durée d’onde 4,0 ms, amplitude d’impulsion 8,0 V) pendant 5 min.
5. Sélectionner un myocyte avec bonne forme (forme de la tige, arête vive et effacer les stries croisées) et contraction stimulée stable (pas de contraction spontanée) sous les 10 x objectif microscopique. Ensuite, changer le grossissement microscopique à 40 x et faire pivoter l’orientation de la caméra CCD pour garder le myocyte en position horizontale.
6. Cadre du myocyte unique en ajustant l’adaptateur de cadrage de cellule. Assurez-vous que le fond est clair.
7. Exposer les myocytes de la lumière émise par une lampe au xénon, avec 340 ou 380 nm longueur d’onde excitation des filtres et image les myocytes à travers un objectif 40 x. Détecter le signal de fluorescence à 510 nm. En attendant, notez les changements de longueur du sarcomère des myocytes et enregistrer à l’aide du module de soft-edge simultanément.
8. Record de fluorescence par un système de double excitation fluorescence photomultiplicateur. Exécuter le programme d’enregistrement pour le calcium, système d’imagerie, cliquez sur " fichier/nouveau fichier " pour créer un nouveau fichier d’enregistrement, cliquez sur le " début " bouton à enregistrer de façon synchrone fluorescence et sarcomère longueur.

6. Évaluation de SR Ca ^{2 +} réserve et diastolique Ca ^{2 +} fonction de suppression de ^{8 , 7 , 9}

1. Interlink le " Aux Out " port en le stimulateur avec le " analogue à " port sur le système de contrôle de valve (p. ex., commandant de la vanne, voir Table des matières) par un câble BNC (pour synchroniser le signal TTL).
2. Preset un programme pour les robinets de perfusion de commutation automatiquement comme décrit précédemment ^{8 , 9} ; La procédure détaillée pour l’opération est répertoriée comme suit.
   1. Preset les paramètres dans la valve de contrôlent de logiciel selon le tableau 2, puis cliquez sur le " téléchargement " le bouton pour télécharger la séquence chargés dans le programme. Cliquez sur le " Trigger " bouton pour activer la fonction déclencheur.
      Remarque : Le système de contrôle de valve peut exécuter la séquence après avoir reçu le signal TTL.
   2. Prédéfinir le stimulateur dans mode de séquence et réglez les paramètres selon le tableau 3.
3. Définir le stimulateur à " S1 étape " pour rythmer le LV myocytes à 1 Hz. démarrer la perfusion de l’aiguille à la vitesse de 1,5 mL/min avec une solution NT.
   NOTE : Parce que la vitesse du flux de l’aiguille est plus rapide que la perfusion de la chambre, la réfraction de lumière du flux de l’aiguille est différente de la réfraction de la perfusion de la chambre. La différence de réfraction indique la plage de perfusion efficace de l’aiguille, qui entoure la cible myocyte.
4. Sélectionner une cible myocyte sous la vue microscopique de faible puissance (dans l’ordre de l’aval vers l’amont), et assurez-vous qu’il peut être atteint par la micro pointe du crayon. Changer le grossissement du microscope à x 400. Faites pivoter l’orientation de la caméra CCD pour garder le myocyte en position horizontale. Régler l’ouverture rectangulaire dans l’adaptateur de cadrage de cellules vers une fenêtre adaptée qui emplit les myocytes. S’assurer qu’il n’y a fond minime ; ne permettent pas les autres myocytes ou des débris de cellules mortes dans cette fenêtre.
5. Régler la position du crayon fixé sur le micromanipulateur et placer soigneusement la pointe micro à la distance du rayon du champ de vision pour le myocyte cible moins de 400 x grossissement du microscope.
6. Régler la gamme des flux aiguille pour surtout couvrir le myocyte cible et assurez-vous que les myocytes ne peuvent être écartée par l’écoulement de l’aiguille.
7. Après 60 s base arpentant, rouler le curseur de stimulateur de la " étape de D2 ".
   NOTE : Le reste du protocole sera exécuté automatiquement par le stimulateur et le système de contrôle de valve. Selon la configuration ci-dessus, le protocole pourrait être exécuté automatiquement comme dans la Figure 2 a, 1Hz base stimulation avec solution NT pendant 60 s. Puis mettez en pause la stimulation et le délai de 2 s, rapidement passer à la perfusion de caféine de 10 mM pour 15 s (pour fonctionnellement libérer Ca ^{2 +} stockage en RS) et puis rebasculer vers la solution NT.
8. à la fin de l’enregistrement, détecter la fluorescence de fond pour des myocytes. Cliquez sur le " pause " bouton pour mettre en pause le fichier d’enregistrement, déplacer la vue microscopique sur une zone vide à proximité. Cliquez sur le " dossier " bouton pour reprendre l’enregistrement pour les secondes et enregistrement numérique 340 et 380 nm intensité des valeurs pour une correction de fond.
9. Ouvert le " opération/Constant " boîte de dialogue et de remplir les valeurs dans le " fond " forment, respectivement, le logiciel permet de corriger les valeurs de ratio Fura 2 en soustrayant l’arrière-plan.

7. Analyse de données ⁹

1. pour les mesures transitoires du calcium et du sarcomère raccourcissement au stade de la stimulation base, en moyenne les impulsions de la secousse et ensuite analyser les paramètres dynamiques, tels que les transitoires de calcium, la constante de temps décomposition du calcium transitoire (Tau-1 Hz), en utilisant le logiciel automatiquement.
   Remarque : Si le logiciel ne tient pas bien le segment de la carie, exporter la trace de déclin pour l’ajustement de courbe exponentielle mono manuel.
2. Pour des impulsions de calcium induit par la caféine, sélectionnez uniquement le pouls avec une vague raide pour l’analyse de la fonction de suppression de calcium. Exclure les cellules avec perturbation de signal, pouls anormal ou ceux qui s’écoulait à mi-chemin away.
3. Mesurer l’amplitude de l’impulsion de calcium induit par la caféine (Ca-caféine, un index de SRCa ^{2 +} réserve).
4. Obtenir la constante de temps de désintégration d’impulsion de calcium induit par la caféine (Tau-caféine) par une courbe exponentielle-mono raccord (durée de 10 s) manuellement depuis le logiciel ( Figure 2).

Résultats

Ici, nous illustrons la streptozotocine (STZ) - induced rats diabétiques (DM) et appariés selon l’âge Sprague - Dawley (SD) les rats par exemple. des rats SD mâles âgés de 8 semaines (200 ± 20 g) a reçu une injection intrapéritonéale de STZ (70 mg/kg, ip) pour le tampon de groupe ou citrate de DM pour le groupe témoin. Une semaine après l’administration de STZ, rats avec glycémie > 16,7 mmol/L ont été considérés comme diabétique. Après 8 semaines, les myocytes L...

Discussion

Le flux de calcium libéré de la SR est la Ca^{2 +} source principale pour la systole au cœur. Dans une certaine mesure, l’amplitude de la SR Ca^{2 +} contenu et fractionnaire Ca^{2 +} libéré de la SR reflètent la SR Ca^{2 +} réserve disponible pour la contraction cardiaque. En revanche, la Ca^{2 +} réserve de SR dépend de la capacité du SR Ca^{2 +} recaptage, Ca^{2 +} fuite de SR et leur équilibre dans l’ensemble de la SR au cours de la diastole

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Alfa Aesar	E31K43
MgCl2	Alfa Aesar	I02T070
KCl	Alfa Aesar	G22u018
HEPEs	Sigma	SLBM 7880V
D-Glucose	Alfa Aesar	10189341
NaOH	Alfa Aesar	10154048
KOH	Alfa Aesar	10144B17
KH2PO4	Alfa Aesar	F21S033
MgSO4	Alfa Aesar	C31U038
L-Glutamic	Alfa Aesar	10149849
Taurine	Alfa Aesar	J5407a
EGTA	Sigma	SLBM6826V
Collagenase A	Roche	10103586001
Collagenase Type II	Worthington	45k16005
BSA	Roche	735094
caffeine	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscope	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff system	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 links
Perfusion chamber	IonOptix	FHD
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA	VC 3-8
valve commander software	ALA	VC 3 1.0.1.2
Precision flow regulator	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Removable Tip	AutoMate Scientific	360um i.d.
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems	IonOptix	Hyperswitch
Recording software	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436