Evaluación del retiro de reserva e intracelular calcio diastólico calcio de retículo sarcoplásmico en cardiomiocitos ventriculares aisladas

Resumen

Calcio intracelular reciclaje desempeña un papel crítico en la regulación de la función sistólica y diastólica en los cardiomiocitos. Aquí, describimos un protocolo para evaluar el Ca^{2 +} reserva de retículo sarcoplásmico y función para eliminar calcio diastólico en los cardiomiocitos por un sistema de imagen de calcio.

Resumen

Calcio intracelular reciclaje desempeña un papel crítico en la regulación de la función sistólica y diastólica en los cardiomiocitos. Cardiaco retículo sarcoplásmico (SR) sirve como un depósito de Ca^{2 +} para la contracción, que reuptakes intracelular Ca^{2 +} durante la relajación. El SR Ca^{2 +} reserva disponible para golpes es determinada para contractibility cardiaca, y la eliminación de Ca intracelular^{2 +} es crítica para la función diastólica cardíaca. Bajo ciertas condiciones fisiopatológicas, como la diabetes y la insuficiencia cardíaca, remoción de calcio deteriorada y SR Ca^{2 +} tienda en cardiomiocitos pueden implicar en el progreso de la disfunción cardiaca. Aquí, describimos un protocolo para evaluar SRCa^{2 +} reserva y diastólica Ca^{2 +} extracción. Brevemente, un cardiomiocito solo fue enzimático aislado, y la intracelular Ca^{2 +} fluorescencia indicada con Fura-2 se registró por un sistema de proyección de imagen del calcio. Para emplear cafeína para inducir total SR Ca^{2 +} liberación, preselección de un programa de interruptor automático de la perfusión por la interconexión del sistema de estimulación y el sistema de perfusión. Entonces, la guarnición de curva exponencial mono fue utilizada para analizar las constantes de tiempo de decaimiento de calcio transitorios y pulsos de calcio inducida por la cafeína. En consecuencia, la contribución de la SR Ca^{2 +}-ATPasa (SERCA) y Na⁺-Ca^{2 +} cambiador (NCX) a quitar calcio diastólico se evaluó.

Introducción

Calcio intracelular ([Ca^{2 +}]) reciclaje desempeña un papel crítico en la regulación de la función sistólica y diastólica en cardiomiocitos¹. Como sabemos, inducida por el calcio Ca^{2 +} lanzamiento inicia la excitación-contracción de acoplamiento, que traducen la señal eléctrica a la contracción. Despolarización de la membrana activa lo sarcolemales Ca tipo L^{2 +} canales, que inducen Ca^{2 +} lanzamiento de SR en el citoplasma a través de receptores de Ryanodina (RyR2) de 2. La transitoria elevada citoplásmicas Ca^{2 +} inicia la contracción de las miofibrillas. Durante el diástole, citoplásmicas Ca^{2 +} es reuptaken en el SR con el SR Ca^{2 +}-ATPasa 2 (SERCA2) y bombeado en el cardiomiocito a través de la Na⁺-Ca^{2 +} cambiador (NCX)². Este proceso conduce a la contracción y relajación de los cardiomiocitos.

El SR cardiaco es una red intracelular de la membrana que rodea la maquinaria contráctil. Sirve como un depósito de Ca^{2 +} para la contracción, y reabsorbe Ca intracelular^{2 +} durante la relajación. El SR Ca^{2 +} reserva disponible para beats es determinada para la contractilidad cardiaca. Mientras tanto, la eliminación de Ca intracelular^{2 +} es crítica para la diástole cardiaca. Bajo ciertas condiciones fisiopatológicas, como la diabetes e insuficiencia cardíaca, alteración Ca^{2 +} despacho y deprimido SR Ca^{2 +} tienda en cardiomiocitos puede estar involucrado en el proceso de disfunción cardiaca^{2,3 ,4}.

Para medir Ca SR^{2 +} liberación y diastólica Ca^{2 +} retiro en cardiomiocitos, hay dos métodos ampliamente utilizados: la integridad de la corriente NCX basado en abrazadera del remiendo^5,6y el Ca inducida por la cafeína ^{2 +} pulso basado en Ca^{2 +} fluorescencia imagen^7,8,9. Lo anterior depende el hecho de que el Ca^{2 +} de la SR es en gran medida bombeada fuera de la célula por NCX. Sin embargo, este enfoque está limitado por sus requerimientos de equipo avanzado y experto. En el presente estudio, describimos un método conveniente para evaluar reserva de SR Ca^{2 +} y Ca^{2 +} retiro en miocitos mediante la medición de un inducido por cafeína Ca^{2 +} pulso basado en un Ca^{2 +} fluorescencia sistema de imagen. Brevemente, intracelular Ca^{2 +} fluorescencia indica Fura-2. Por la interconexión del sistema de estimulación y sistema de perfusión, presentamos un programa para la perfusión y el sistema de estimulación automáticamente. cafeína 10 mM fue empleada para inducir rápidamente la total liberación de Ca^{2 +} en el SR. Las constantes de tiempo de decaimiento exponencial (Tau) de calcio transitorios y pulsos de calcio inducida por la cafeína se obtuvieron de mono exponencial curva de ajuste, que reflejan la contribución de SERCA y NCX para diastólica Ca^{2 +} retiro en consecuencia.

Protocolo

animal todos los experimentos fueron realizados según protocolos de actuación aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso en el centro de Investigación Experimental, Academia China de ciencias médicas chinas y la Universidad de Zhejiang.

1. preparación de la solución

1. preparar todas las soluciones como se describe en la tabla 1.

2. aislamiento de izquierda Ventricular (LV) cardiomiocitos

Nota: LV cardiomiocitos son aisladas enzimáticamente mediante un sistema de perfusión de Langendroff como se describió anteriormente ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11}.

1. Instalar el sistema de perfusión Langendroff. Llene el sistema de perfusión con solución Tyrode Normal (NT), temperatura 36,5 ° c y eliminar cualquier burbuja de aire en el tubo de.
2. Pesan y anestesiar una rata Sprague-Dawley por inyección intraperitoneal (ip) de hidrato de cloral (400 mg/kg). Confirme el estado anestésico evaluando respuesta pizca de cola o dedo del pie después de 5 minutos
3. Abrir la cavidad abdominal debajo del proceso xifoides con una tijera quirúrgica, levante el proceso xifoides y abre el cofre con la tijera. Quitar el pericardio, levante levemente el corazón con fórceps curvado, identificar el arco aórtico y cortar el corazón de tijeras de la raíz de la aorta.
4. Transferir el corazón a un plato de 60 mm y lavarlo con solución de NT. Mantener la aorta con dos pinzas de disección micro y móntelo en la cánula de perfusión de Langendorff y luego ligar firmemente la aorta en la cánula utilizando suturas quirúrgicas.
   Nota: Un operador experto puede terminar este proceso dentro de los 15 s.
5. Inundar el corazón con solución 30 mL NT para recuperar la circulación de las arterias coronarias. Luego, cambiar la solución 30 ml Ca ^{2 +}-libre solución de Tyrode (taurina, 1 mg/mL BSA de 10 mM) para detener los latidos del corazón. A continuación, cambie la solución a la solución de aislamiento de colagenasa A (0,6 mg/mL) para la digestión de la enzima.
   Nota: Uso colagenasa para experimentos con ratas diabéticas o colagenasa II para experimentos sin ratas diabéticas.
6. Después de la digestión para 20-25 minutos, cambiar rápidamente la solución de perfusión para el Ca ^{2 +}-libre solución Tyrode para detener aún más la digestión. Luego, mantenga el corazón con unas pinzas, cortado de la cánula y coloque el corazón en un plato de 35 mm que contenga solución KB (ver tabla 1).
7. Disecan la pared del LV con tijeras y pinzas. Corte la aurícula, ventrículo derecho y zona de la ensambladura auriculoventricular. El tejido restante es LV; traslado a una nueva placa de 35 mm con solución KB. Pique el tejido del LV en pedazos pequeños.
8. Pipetear las piezas con un gotero plástico filtrada y resuspender en solución de 10 mL KB.
9. Filtro de las células con 150 μm filtro de acero inoxidable de abertura y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugue a 150 x g por 30 s y descartar el sobrenadante. Vuelva a suspender los miocitos en solución de 10 mL KB, reposar 6 minutos, descartar el sobrenadante y Resuspenda el sedimento en solución de 10 mL KB.
   Nota: Todas las medidas se realizaron a 36 ° C en soluciones de gaseado con 100% O ₂.

3. Reintroducción de calcio

1. después de colocar por 20 min en solución KB, deseche el sobrenadante y resuspender los miocitos con solución de calcio reintroducción A (0.3m m Ca ^{2 +}, 4,5 mL Ca ^{2 +}-solución de Tyrode gratuita, NT de 1,5 mL de solución) durante 10 minutos
2. Repita el procedimiento anterior con solución de reintroducción de calcio B (0,3 mM Ca ^{2 +}, 3 mL Ca ^{2 +}-solución de Tyrode gratuita, NT de 3 mL de solución).
3. Repita el procedimiento anterior con solución de NT (1.2m m Ca ^{2 +}) para purificar los miocitos disponibles. Los miocitos aislados de LV en esta solución y estudiar dentro de 4-6 h.

4. Set Up de perfusión sistema

1. Conecte el tubo de entrada con la solución de NT para la perfusión de la cámara ( figura 1A).
2. Para perfusión de aguja de la blanco del miocito, conecte la punta múltiple multi-cañón (p. ej., lápiz de perfusión, conocido en adelante como lápiz), fijo en el instrumental quirúrgico, a la válvula de control sistema de perfusión. Añadir solución de NT y cafeína 10 mM a cada columna del lápiz ( figura 1A).
3. Evacuar cualquier burbuja de aire en los tubos para evitar la obstrucción de aire.
4. Cuenta el número de goteo desde la punta del micrón del lápiz de 10 s y ajustar manualmente el regulador de flujo para mantener la velocidad del flujo a una velocidad aproximada de 3 s. de goteo/10

5. Las mediciones de Ca intracelular ^{2 +} transitorio y el acortamiento del sarcómero ^{7 , 8 , 9}

1. suspensión pipeta 10 μL en la diapositiva, contar el número de células por un contador de células bajo el microscopio y calcular la densidad. Diluir los miocitos a una concentración aproximada de 50.000 células/mL.
2. Añadir el Fura-2 acetoxymethyl (AM) stock (un colorante sensible de calcio) en una suspensión de 1 mL de miocitos para llevar la concentración final de 2 μm. mantener en la oscuridad por 20 min a temperatura ambiente.
3. Centrifugar a 150 g durante 30 s y volver a suspender los cardiomiocitos con solución de NT 2 veces.
4. Giro de la luz y mantener las células en la oscuridad. Colocar los miocitos en la cámara de perfusión durante 15 minutos. Luego iniciar la perfusión de cámara (1.5 mL/min) con solución de NT. Ritmo de los miocitos con estimulación de campo de 1 Hz usando un estimulador (duración de onda ms de 4,0, amplitud de pulso 8.0 V) durante 5 minutos
5. Seleccione un miocito con buena forma (forma de varilla, filo y claro estriaciones cruzadas) y contracción estimulada estable (sin contracción espontánea) debajo de los 10 x objetivo microscopio. A continuación, cambiar la ampliación microscópica a 40 x y girar la orientación de la cámara CCD para mantener el miocito en posición horizontal.
6. Marco el miocito solo ajustando el adaptador de estructura celular. Asegúrese de que el fondo es claro.
7. Exponer los miocitos a la luz emitida por una lámpara de xenón, con 340 380 nm longitud de onda excitación filtros o y la imagen de los miocitos a través de un objetivo de 40 x. Detectar la señal de fluorescencia a 510 nm. Mientras tanto, tenga en cuenta los cambios de longitud de sarcómera de los miocitos y grabar utilizando el módulo de borde suave al mismo tiempo.
8. Registro de la fluorescencia por un sistema de fotomultiplicador doble excitación de fluorescencia. Ejecute el programa de grabación para el calcio en el sistema de imagen, haga clic en " archivo/nuevo archivo " para crear un nuevo archivo de registro y haga clic en la " Inicio " botón para longitud de sarcómero y fluorescencia síncrono registro.

6. Evaluación de la Ca de SR ^{2 +} reserva y diastólica Ca ^{2 +} función eliminar ^{7 , 8 , 9}

1. Interlink el " Aux Out " puerto de el estimulador con el " análogo en " puerto en el sistema de control de válvula (p. ej., comandante de la válvula, véase Tabla de materiales) por un cable BNC (para sincronizar la señal de la TTL).
2. Preset un programa para cambiar las válvulas de perfusión automáticamente como se describió anteriormente ^{8 , 9}; Pasos detallados para la operación se enumeran como sigue.
   1. Predefinidos los parámetros de la válvula de controlan de software según la tabla 2 y haga clic en el " descargar " el botón para descargar la secuencia de cargado en el programa. Haga clic en el " TriggER " botón para activar la función de trigger.
      Nota: El sistema de control de la válvula puede ejecutar la secuencia después de recibir la señal de la TTL.
   2. Preset el estimulador a modo de secuencia y definir los parámetros según la tabla 3.
3. Set estimulador en " S1 paso " a paso LV miocitos a 1 Hz. iniciar la perfusión de la aguja a la velocidad de 1,5 mL/min con solución NT.
   Nota: Debido a la velocidad de la corriente de la aguja es más rápido que la perfusión de la cámara, la refracción de la luz de la secuencia de la aguja es diferente de la refracción de la luz de la perfusión de la cámara. La diferencia de refracción de la luz indica el rango de perfusión aguja eficaz, que rodea el destino del miocito.
4. Seleccione un destino del miocito bajo visión microscópica de baja potencia (en la secuencia de abajo a arriba), y asegúrese de que se puede llegar por la micro punta del lápiz. Cambiar la ampliación del microscopio a 400 x. Girar la orientación de la cámara CCD para mantener el miocito en posición horizontal. Ajuste la abertura rectangular en el adaptador de estructura celular a una ventana conveniente que llena de los miocitos. Asegurar que exista un mínimo fondo; No permita que otros miocitos o restos de células muertas en esta ventana.
5. Ajustar la posición del lápiz en el instrumental quirúrgico y cuidadosamente coloque la punta de la micro a la distancia del radio del campo de visión para el miocito blanco bajo 400 x aumentos de microscopio.
6. Ajustar el rango de corriente de aguja para sobre todo cubrir el objetivo del miocito y asegúrese de que el miocito no puede ser arrastrado por el flujo aguja.
7. Después de 60 s básicos de estimulación, rodar el cursor estimulador para el " paso D2 ".
   Nota: El resto del Protocolo se ejecutarán automáticamente por el estimulador y el sistema de control de la válvula. Basado en el ajuste anterior, el protocolo podría ser ejecutado automáticamente como en la figura 2A, básica de estimulación con solución de NT para 60 1 Hz s. Luego pausa estimulación y demora de 2 s, rápidamente cambiar a perfusión de cafeína de 10 mM de 15 s (funcionalmente libera Ca ^{2 +} almacenamiento en SR) y luego cambiar a solución NT.
8. Al final de la grabación, detectar la fluorescencia de fondo para miocitos individuales. Haga clic en el " pausa " botón para pausar el archivo de registro, mover el punto de vista microscópico a una zona en blanco. Haga clic en el " registro " botón para reanudar la grabación durante segundos y grabar numérico 340 y 380 nm intensidad los valores de corrección de fondo.
9. Abierto el " operación, constante " cuadro de diálogo y llenar los valores en el " fondo " forman, respectivamente, el software puede corregir Fura 2 valores del cociente restando el fondo.

7. Análisis de datos ⁹

1. para la medición de calcio transitorios y sarcómeras acortamiento en la fase de establecimiento del paso básica, promedio de los impulsos de contracción y luego analizar parámetros dinámicos, como oscilaciones de calcio, la constante de tiempo de deterioro transitorio del calcio (Tau-1 Hz), utilizando el software automáticamente.
   Nota: Si el software no entra bien el segmento de decaimiento, exportar el rastro de decadencia para la guarnición de curva exponencial mono manual.
2. Pulsos de calcio inducida por la cafeína, seleccione sólo el pulso con una onda escarpada para el análisis de la función de eliminación de calcio. Excluir las células con alteración de la señal, pulso anormal o que fluyó a mitad del camino centraa.
3. Medir la amplitud del pulso de calcio inducida por la cafeína (Ca-cafeína, un índice de SRCa ^{2 +} reserva).
4. Obtener la constante de tiempo de decaimiento del pulso de calcio inducida por la cafeína (Tau-cafeína) instalando mono exponencial curva (duración de 10 s) manualmente desde el software ( figura 2).

Resultados

Aquí ilustramos streptozotocin (STZ) - indujo ratas diabéticas (DM) y pareados por edad Sprague - Dawley (SD) las ratas por ejemplo. las ratas macho SD 8 semanas de edad (200 ± 20 g) recibieron una inyección intraperitoneal de STZ (70 mg/kg, ip) para el búfer de grupo o citrato de DM en el grupo control. Una semana después de la administración de STZ, ratas con glucosa en la sangre > 16,7 mmol/L se considera diabético. Después de 8 semanas, los miocitos del LV se aislaron enz...

Discusión

Flujo de calcio liberado de lo SR es el Ca^{2 +} fuente principal para la sístole en el corazón. A cierto punto, la amplitud del SR Ca^{2 +} contenido y el fraccionario Ca^{2 +} de la SR reflejan el SR Ca^{2 +} reserva disponible para la contracción cardiaca. Por otra parte, la Ca^{2 +} reserva de SR depende de la capacidad de la recaptación de Ca SR^{2 +} , Ca^{2 +} fuga de SR y su equilibrio a través del SR durante diástole^12,

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Alfa Aesar	E31K43
MgCl2	Alfa Aesar	I02T070
KCl	Alfa Aesar	G22u018
HEPEs	Sigma	SLBM 7880V
D-Glucose	Alfa Aesar	10189341
NaOH	Alfa Aesar	10154048
KOH	Alfa Aesar	10144B17
KH2PO4	Alfa Aesar	F21S033
MgSO4	Alfa Aesar	C31U038
L-Glutamic	Alfa Aesar	10149849
Taurine	Alfa Aesar	J5407a
EGTA	Sigma	SLBM6826V
Collagenase A	Roche	10103586001
Collagenase Type II	Worthington	45k16005
BSA	Roche	735094
caffeine	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscope	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff system	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 links
Perfusion chamber	IonOptix	FHD
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA	VC 3-8
valve commander software	ALA	VC 3 1.0.1.2
Precision flow regulator	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Removable Tip	AutoMate Scientific	360um i.d.
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems	IonOptix	Hyperswitch
Recording software	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436