Sarcoplasmic retikulum kalsiyum koruma ve hücre içi diyastolik kalsiyum kaldırma izole Ventriküler Cardiomyocytes olarak değerlendirilmesi

Özet

Hücre içi kalsiyum geri dönüşüm cardiomyocytes sistolik ve diyastolik fonksiyon yönetmelikte kritik bir rol oynamaktadır. Burada, sarcoplasmic retikulum Ca^{2 +} rezerv ve diyastolik kalsiyum kaldırma cardiomyocytes işlevinde bir kalsiyum görüntüleme sistemi tarafından değerlendirmek için bir protokol açıklayın.

Özet

Hücre içi kalsiyum geri dönüşüm cardiomyocytes sistolik ve diyastolik fonksiyon yönetmelikte kritik bir rol oynamaktadır. Kardiyak sarcoplasmic retikulum (SR) kasılma, hangi reuptakes intrasellüler Ca^{2 +} dinlenme sırasında için bir Ca^{2 +} rezervuar olarak hizmet vermektedir. SR Ca^{2 +} rezerv tempolar için kullanılabilir için kardiyak contractibility belirli ve intrasellüler Ca^{2 +} kaldırılması kardiyak diyastolik fonksiyonları için önemlidir. Şeker hastalığı ve kalp yetmezliği gibi patofizyolojik bazı koşullar altında Engelli kalsiyum Gümrükleme ve SR Ca^{2 +} cardiomyocytes deposunda kardiyak Disfonksiyonun sürüyor tutulabilir. Burada, SRCa^{2 +} rezerv ve diyastolik Ca^{2 +} kaldırma değerlendirmek için bir protokol açıklayın. Kısaca, bir tek cardiomyocyte enzimatik izole edildi ve Fura-2 tarafından belirtilen hücre içi Ca^{2 +} floresan bir kalsiyum görüntüleme sistemi tarafından kaydedildi. Kafein toplam SR Ca^{2 +} yayın inducing için istihdam için biz stimülasyon ve perfüzyon sistemleri bağlantı tarafından bir otomatik perfüzyon geçiş programı önceden. O zaman, mono-üstel eğri uydurma çürüme zamanı sabitleri kalsiyum geçişler ve kafein kaynaklı kalsiyum bakliyat analiz etmek için kullanıldı. Buna göre katkısını SR Ca^{2 +}-ATPaz (SERCA) ve Na⁺-Ca^{2 +} Eşanjör (NCX) diyastolik kalsiyum kaldırma için değerlendirilir.

Giriş

Hücre içi kalsiyum ([Ca^{2 +}]_ben) geri dönüşüm cardiomyocytes¹sistolik ve diyastolik fonksiyon yönetmelikte kritik bir rol oynamaktadır. Bildiğimiz gibi kalsiyum kaynaklı Ca^{2 +} yayın hangi kasılma için elektrik sinyali çevirmek kaplin, uyarma daralma başlatır. Membran depolarizasyon neden Ca^{2 + 2 +} kanal SR ryanodine reseptörleri 2 (RyR2) yolu ile sitoplazma içine serbest bırakmak sarcolemmal L tipi Ca etkinleştirir. Geçici yükseltilmiş sitoplazmik Ca^{2 +} myofibrils daralma başlatır. Diastole sırasında olduğunu sitoplazmik Ca^{2 +} reuptaken içine aracılığıyla SR Ca^{2 +}SR-ATPaz 2 (SERCA2) ve cardiomyocyte^{Na+-Ca 2 +} Eşanjör (NCX)²üzerinden dışarı pompalanır. Bu işlem kasılma-gevşeme içinde cardiomyocyte geri dönüşüm yol açar.

Kardiyak SR contractile makine çevreleyen bir hücre içi membran ağıdır. Bu kasılma için bir Ca^{2 +} rezervuar olarak hizmet vermektedir ve intrasellüler Ca^{2 +} dinlenme sırasında reabsorbs. SR Ca^{2 +} rezerv tempolar için kullanılabilir için kardiyak contractility belirli. Bu arada, intrasellüler Ca^{2 +} kaldırılması için kardiyak diastole önemlidir. Patofizyolojik bazı koşullarda, şeker hastalığı ve kalp yetmezliği, Engelli Ca^{2 +} izni ve depresif SR Ca^{2 +} gibi cardiomyocytes deposunda kardiyak Disfonksiyonun²sürecinde^{,3 tutulabilir ,4}.

SR Ca^{2 +} yayın ve diyastolik Ca^{2 +} kaldırılmasına cardiomyocytes ölçmek için yaygın olarak kullanılan iki yaklaşım vardır: NCX geçerli bütünlüğünü dayalı yama-kelepçe^5,6ve kafein kaynaklı Ca CA^{2 +} Floresans görüntüleme^7,8,9tarihinde dayalı ^{2 +} darbe. Eski yaklaşım SR yayımlanan Ca^{2 +} büyük ölçüde hücreden NCX tarafından pompalanır ki aslında bağlıdır. Ancak, bu yaklaşım onun şartı gelişmiş ekipman ve usta işlemi tarafından sınırlıdır. Bu da çalışmanın, SR Ca^{2 +} rezerv ve Ca^{2 +} miyositler kaldırılmasına bir Ca^{2 +} Floresans görüntüleme sistemine dayalı bir kafein kaynaklı Ca^{2 +} darbe ölçerek değerlendirmek için uygun bir yaklaşım açıklar. Kısaca, intrasellüler Ca^{2 +} Floresans Fura-2 tarafından belirtilir. Stimülasyon sistemi ve perfüzyon sistemi tarafından ilişkilendirerek, perfüzyon anahtarlama ve sistem otomatik olarak pacing için bir program mevcut. 10 mM kafein hızla toplam Ca^{2 +} sürümde SR. ikna etmek için istihdam edildi Kalsiyum geçişler ve kafein kaynaklı kalsiyum bakliyat üstel çürüme zamanı sabitleri (Tau) mono üstel eğri uydurma, diyastolik Ca^{2 +} kaldırma SERCA ve NCX katkısı uygun şekilde yansıtan elde edilmiştir.

Protokol

tüm hayvan deneyleri kurumsal hayvan bakım ve deneysel Araştırma Merkezi, Çin Çince tıbbi bilim ve Zhejiang Üniversitesi'nde kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokoller uyarınca gerçekleştirilmiştir.

1. çözüm hazırlık

1. tüm çözümler Tablo 1 ' de açıklandığı şekilde hazırlayın.

2. yalıtım, sol ventrikül (LV) Cardiomyocytes

Not: LV cardiomyocytes enzimatik Langendroff perfüzyon sistemi yukarıda açıklanan ⁷ olarak kullanarak izole ^{, 8 , 9 , 10 , 11}.

1. Langendroff perfüzyon sistemi ayarlarsınız. Perfüzyon sistemi Normal Tyrode (NT) çözüm ile doldurmak, 36.5 ° C'de sıcaklığı ayarlamak ve tüp herhangi bir hava kabarcıkları ortadan kaldırmak.
2. Tartmak ve Sprague-Dawley rat mayi enjeksiyonu (IP) kloral hidrat (400 mg/kg) ile anestezi. 5 dk. sonra kuyruk ya da ayak çimdik yanıt değerlendirerek anestezik durum teyit
3. Xiphoid işleminin altında karın boşluğu ile Cerrahi makas açın, xiphoid işlemi kaldırın ve göğüs makas ile açın. Kalp zarını kaldırmak, biraz kalbi eğri Forseps ile kaldırın, aort tanımlamak ve makas aort kök kalp kekemelik.
4. 60 mm çanak kalp transfer ve NT çözüm ile yıkayın. Aort iki mikro-anatomi Forseps ile tutun ve Langendorff perfüzyon kanül monte ve sıkıca cerrahi dikişler kullanarak kanül üstüne aort ligate.
   Not: Bu işlem 15 içinde yetenekli bir operatör bitirebilir miyim s.
5. Kalp koroner arter dolaşımını kurtarmak için 30 mL NT solüsyonu ile sıvı. Sonra perfusate 30 mL için Ca ^{2 +} geçiş-kalp atışı durdurmak için Tyrode çözüm (10 mM taurin, 1 mg/mL BSA) ücretsiz. Daha sonra perfusate Collagenase A yalıtım çözüm (0.6 mg/mL) enzim sindirim için geçiş.
   Not: Kullanım Collagenase deneyler için diyabetik sıçan veya Collagenase II ile deneyler için diyabetik sıçan olmadan.
6. 20-25 dk sindirim sonra hızlı bir şekilde perfüzyon çözüm Ca ^{2 +} için değiştirmek-Tyrode çözüm daha fazla sindirim durdurmak için ücretsiz. Sonra kalp Forseps ile tutun, kanül--dan kesmek ve kalp KB solüsyon içeren bir 35mm tabak yerleştirin (bkz. Tablo 1).
7. Makas ve Forseps ile LV duvar incelemek. Atrium, sağ ventrikül ve Atriyoventriküler birleşim alanı kesti. LV kalan dokudur; KB çözüm ile yeni bir 35 mm çanak içine aktarın. LV doku küçük parçalar halinde kıyma.
8. Yavaşça filtre uygulanmış bir plastik damlalık taşlarla pipette ve 10 mL KB çözümde yeniden askıya alma.
9. 150 µm diyafram paslanmaz çelik filtre ve 15 mL santrifüj tüpü aktarmak hücrelerle filtre. 150 x g 30 s ve atma süpernatant için de santrifüj kapasitesi. 10 mL KB çözümünde, ücretsiz miyositler yerleşmek için 6 dk, yeniden askıya süpernatant atmak ve Pelet 10 mL KB çözümde yeniden askıya alma.
   Not: %100 O ₂ ile benzin çözümlerinde 36 ° C'de tüm adımları gerçekleştirilmiştir.

3. Kalsiyum tekrar rifampisin

1. 20 dk KB çözüm için yerleşme sonra süpernatant atmak ve kalsiyum tekrar rifampisin çözüm A ile miyositler yeniden askıya alma (0.3 mM Ca ^{2 +}, 4.5 mL Ca ^{2 +}-ücretsiz Tyrode çözüm, 1,5 mL NT çözüm) 10 dakika süreyle
2. Kalsiyum tekrar rifampisin çözüm B ile yukarıdaki yordamı yineleyin (0.3 mM Ca ^{2 +}, 3 mL Ca ^{2 +}-ücretsiz Tyrode çözümü, 3 mL NT solüsyon).
3. Kullanılabilir miyositler arındırmak için NT solüsyonu (1,2 mM Ca ^{2 +}) ile yukarıdaki yordamı yineleyin. Bu çözümde izole LV miyositler depolamak ve onları 4-6 h. içinde çalışma

4. Set Up perfüzyon sistemi

1. odası perfüzyon ( şekil 1A) için NT çözüm ile giriş akımı tüp bağlamak.
2. Çok namlu manifold ipucu (örneğin, perfüzyon kalem, bundan böyle kalem anılacaktır) için iğne perfüzyon hedef myocyte, bağlanmak, micromanipulator sabit, Vana perfüzyon sistemi kontrol. NT çözüm ve 10 mM kafein çözüm kalem ( şekil 1A) her sütun için eklemek.
3. Hava engellenmesini önlemek için tüpler herhangi bir hava kabarcıkları tahliye.
4. Kalem 10 mikron ucundan damla sayısını saymak s ve akış hızı 3 damla/10 s. yaklaşık bir hızda tutmak için akım regülatörü değerini el ile ayarlamak

5. İntrasellüler Ca ^{2 +} Darbe Gerilimlerinden ve Sarcomere kısalma ^{7 , 8 , 9} ölçümleri

1. pipet 10 µL hücre süspansiyon slayt mikroskop altında bir hücre sayaç tarafından hücre sayıları saymak ve yoğunluğu hesaplayın. 50. 000 hücre/mL yaklaşık bir konsantrasyon için miyositler sulandırmak.
2. Ekle Fura-2 acetoxymethyl (AM) hisse senedi (bir kalsiyum hassas boya) miyositler için 2 µM. nihai toplama getirmek için 1 mL süspansiyon halinde tutmak içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 20 dk için.
3. 30 s ve yeniden askıya NT çözüm ile cardiomyocytes 2 kez 150 g, santrifüj.
4. Dönüş ışık kapalı ve hücreleri karanlıkta bırakın. Miyositler perfüzyon odası 15 dakika yerleştirin. O zaman odası perfüzyon (1,5 mL/dk) NT çözüm ile başlatın. Hızı miyositler için 5 dk. bir uyarıcı (dalga süre 4.0 ms, darbe genlik 8.0 V) kullanarak 1 Hz alan stimülasyon ile
5. Bir myocyte iyi şeklinde seçin (çubuk şekli, keskin kenar ve çapraz yivler net) ve istikrarlı uyarılmış seğirme (hiçbir kendiliğinden kasılma) 10 x mikroskobik objektif mercek altında. Ardından, mikroskobik büyütme oranını değiştirmek için 40 x ve myocyte yatay bir konumda tutmak için CCD kamera yönünü döndürmek.
6. Çerçeve hücre çerçeveleme bağdaştırıcısı ayarlayarak tek myocyte. Arka plan açık olduğundan emin olun.
7. Miyositler 340 veya 380 nm dalga boyu uyarma filtreleriyle, ksenon lamba tarafından yayılan ışığa maruz ve 40 x objektif aracılığıyla miyositler görüntü. Floresans sinyali, 510 nm. Bu arada, sarcomere uzunluğu değişiklikler miyositler, Not ve yumuşak kenar modülü aynı anda kullanarak kayıt.
8. Kayıt floresan bir çift-uyarma Floresans photomultiplier sistem tarafından. Görüntüleme sistemi kalsiyum için kayıt programını çalıştırın,'ı tıklatın " dosya/yeni dosya " yeni bir kayıt oluşturarak ve'ı tıklatın " başlangıç " düğmesini zaman uyumlu olarak kayıt Floresans ve sarcomere uzunluğu için.

6. Değerlendirilmesi SR Ca ^{2 +} rezerv ve diyastolik Ca ^{2 +} kaldırma işlev ^{7 , 8 , 9}

1. InterLink " Aux Out " içinde bağlantı noktası uyarıcı ile " Analog içinde " Vana kontrol sistemi üzerinde bağlantı noktası (örneğin, Vana Komutan, bkz: Malzemeler tablo) (TTL sinyal eşitlemek için) bir BNC kablo ile.
2. Perfüzyon vanalar yukarıda açıklanan ^{8 , 9} olarak otomatik olarak geçiş yapmak için bir program hazır ayarı; İşlem için ayrıntılı adımlar olarak aşağıda listelenmiştir.
   1. Kapak parametrelerinde kontrol yazılım Tablo 2 başına ve tıklatın hazır ayar " Download " sırası karşıdan yüklemek için düğmesini program yüklü. ' I tıklatın " TriggEr " düğme-e doğru olanaklı kılmak tetikleyici görev.
      Not: Sıra TTL sinyal aldıktan sonra supap kontrol sistemi yürütebilirsiniz.
   2. Stimülatörü sıra moduna önceden ve küme parametreleri göre Tablo 3.
3. Uyarıcı, ayarla " S1 adım " miyositler 1 Hz., LV hızı ile NT çözüm 1.5 mL/dk hızında iğne perfüzyon başlatın.
   Not: iğne akış hızını odası perfüzyon daha hızlı olduğundan, iğne Stream ışık kırılma odası perfüzyon ışık kırılma farklıdır. Işık kırılma fark hedef myocyte çevreleyen etkili iğne perfüzyon aralığını gösterir.
Bir hedef myocyte (dizisindeki için ters yönde aşağı akım) düşük güç mikroskobik görünümü altında
4. seçin ve emin olun bu mikro kalem ucunu tarafından ulaşılabilir. Mikroskop büyütme 400 x için değiştirin. CCD kamera yönlendirmeyi myocyte yatay konumda tutun olarak döndürün. Dikdörtgen diyafram altında hücre çerçeveleme bağdaştırıcı ile miyositler doldurur uygun bir pencere için ayarlayın. En az arka plan olduğundan emin olun; diğer miyositler veya ölü hücre artıkları bu pencerede izin vermemek.
5. Micromanipulator üzerinde sabit kalem konumunu ayarlamak ve dikkatle mikro ipucu yer görme alanı hedef myocyte için yarıçap mesafeden altında 400 x mikroskop büyütme.
6. Çoğunlukla hedef myocyte kapak ve myocyte uzak iğne akış tarafından süpürüldü değil emin olmak için iğne akış aralığı ayarlamak.
7. Sonra 60 s temel Stimülatörü imlecine rulo pacing, " D2 adım ".
   Not: Protokolü geri kalanı otomatik olarak uyarıcı ve supap kontrol sistemi tarafından yürütülür. Yukarıdaki ayarına göre iletişim kuralı otomatik olarak olduğu gibi şekil 2A, 1 Hz 60 için NT çözüm ile pacing temel yürütülebilir s. Pacing ve gecikme 2 için duraklatmak s, 10 mM kafein perfüzyon 15 hızla geçmek s (işlevsel olarak Ca ^{2 +} SR depoda serbest bırakmak için) ve sonra geri NT çözüm anahtarı.
8. Kayıt sonunda bireysel miyositler için arka plan Floresans algılamak. ' I tıklatın " Duraklat " yakın boş alana taşımak mikroskobik görünümü düğmesini dosya kayıt, duraklatmak için. ' I tıklatın " Kayıt " Kayıt için birkaç saniye devam düğmesini tıklatın ve kayıt arka plan düzeltme için sayısal 340 ve 380 nm yoğunluk değerleri.
9. Açık " işlemi ve sabitler " iletişim kutusunda ve içine değerleri doldurma " arka plan " form, sırasıyla; yazılım arka çıkararak Fura 2 oranı değerleri düzeltebilirsiniz.

7. Veri analizi ⁹

1. kalsiyum geçişler ve hız ayarlama temel aşamada kısalma sarcomere ölçülerini, seğirme bakliyat ortalama ve kalsiyum geçişler, zaman sabiti gibi dinamik parametreleri analiz Kalsiyum geçici çürüme (Tau-1 Hz), belgili tanımlık bilgisayar yazılımı kullanılarak otomatik olarak.
   Not: yazılımın çürüme kesimi de uymazsa ihracat düşüş izleme için el ile mono üstel eğri uydurma.
2. Kafein kaynaklı kalsiyum atışlar için sadece nabız kalsiyum kaldırma işlevi çözümlenmesi için dik bir dalga ile seçin. Sinyal bozukluğu, anormal darbe ya da o uzakta midway akan içeren hücreleri dışlamak.
3. Kafein kaynaklı kalsiyum darbe (Ca-kafein, SRCa ^{2 +} rezerv dizini) genliği ölçmek.
4. Mono üstel eğriyi (10 s süresi) el ile ( şekil 2C) bilgisayar yazılımı--dan yaklaştırarak çürümesine zaman sabit kafein kaynaklı kalsiyum darbe (Tau-kafein) elde edilir.

Sonuçlar

Burada, - diyabetik sıçan (DM) indüklenen ve yaş eşleşti Sprague'ı - streptozotocin (STZ) göstermek Dawley (SD) fareler gibi. 8-hafta-yaşlı erkek SD rats (200 ± 20 g) kontrol grubu için DM grup veya sitrat arabellek STZ (70 mg/kg, IP) tek bir mayi enjeksiyon aldı. Bir hafta sonra STZ yönetim, sıçanlar kan şekeri ile > 16,7 mmol/L diyabetik kabul. 8 hafta sonra LV miyositler enzimatik izole edildi. Kalsiyum tekrar rifampisin sonra hayatta kalma durumunda kalır miyosit...

Tartışmalar

Kalsiyum akı SR yayımlanan başlıca Ca^{2 +} Sistol kalbinde için kaynağıdır. Bir ölçüde, SR Ca^{2 +} içerik genliği ve kesirli Ca SR yayımlanan^{2 +} yansıtmak SR Ca^{2 +} rezerv kardiyak kasılma için kullanılabilir. Öte yandan, Ca^{2 +} rezerv SR sırasında diastole^12,13,14arasında SR SR Ca^{2 +} geri alım, Ca^{2 +} sızıntı SR ve kendi dengesini ye...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Alfa Aesar	E31K43
MgCl2	Alfa Aesar	I02T070
KCl	Alfa Aesar	G22u018
HEPEs	Sigma	SLBM 7880V
D-Glucose	Alfa Aesar	10189341
NaOH	Alfa Aesar	10154048
KOH	Alfa Aesar	10144B17
KH2PO4	Alfa Aesar	F21S033
MgSO4	Alfa Aesar	C31U038
L-Glutamic	Alfa Aesar	10149849
Taurine	Alfa Aesar	J5407a
EGTA	Sigma	SLBM6826V
Collagenase A	Roche	10103586001
Collagenase Type II	Worthington	45k16005
BSA	Roche	735094
caffeine	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscope	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff system	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 links
Perfusion chamber	IonOptix	FHD
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA	VC 3-8
valve commander software	ALA	VC 3 1.0.1.2
Precision flow regulator	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Removable Tip	AutoMate Scientific	360um i.d.
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems	IonOptix	Hyperswitch
Recording software	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436