Avaliação da remoção de reserva e intracelular do cálcio diastólica cálcio sarcoplasmático em Cardiomyocytes Ventricular isolado

Resumo

Reciclagem de cálcio intracelular desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar sarcoplasmático Ca^{2 +} reserva e função de remoção de cálcio diastólica em cardiomyocytes por um sistema de imagem de cálcio.

Resumo

Reciclagem de cálcio intracelular desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes. Retículo sarcoplasmático cardíaco (SR) serve como um reservatório de Ca^{2 +} para a contração, que reuptakes intracelular Ca^{2 +} durante o relaxamento. A SR Ca^{2 +} reserva disponível para batidas é determinante para contractibility cardíaca, e a remoção de intracelular Ca^{2 +} é crítica para a função cardíaca diastólica. Sob algumas condições fisiopatológicas, tais como diabetes e insuficiência cardíaca, liberação de cálcio prejudicada e SR Ca^{2 +} loja em cardiomyocytes podem estar envolvidos no progresso da disfunção cardíaca. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar SRCa^{2 +} reserva e diastólica Ca^{2 +} remoção. Brevemente, um único casos estava enzimaticamente isolado, e a intracelular Ca^{2 +} fluorescência indicada pelo Fura-2 foi gravada por um sistema de imageamento de cálcio. Para empregar a cafeína para indução total SR Ca^{2 +} lançamento, nós um programa de interruptor automático perfusão pré-estabelecido pela interligação do sistema de estimulação e sistema de perfusão. Em seguida, o encaixe de curva mono-exponencial foi usado para a análise de constantes de tempo de decaimento de pulsos de cálcio induzida por cafeína e transientes de cálcio. Nesse sentido, a contribuição do SR Ca^{2 +}-ATPase (SERCA) e at⁺-Ca^{2 +} trocador (NCX) para remoção de cálcio diastólica foi avaliada.

Introdução

Cálcio intracelular ([Ca^{2 +}]_eu) reciclagem desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes¹. Como sabemos, induzida por cálcio Ca^{2 +} versão inicia o acoplamento, excitação-contração que traduzir o sinal elétrico para a contração. Despolarização da membrana ativa mecanismos L-tipo Ca^{2 +} canais, que induzem Ca^{2 +} lançamento do SR para o citoplasma via receptores ryanodine 2 (RyR2). Os transientes elevados citoplasmática Ca^{2 +} inicia a contração das miofibrilas. Durante a diástole, citoplasmática Ca^{2 +} é reuptaken para o SR mediante o SR Ca^{2 +}-ATPase 2 (SERCA2) e bombeado fora os casos através^{do nd+-Ca 2 +} trocador (NCX)². Este processo leva a reciclagem nos casos de contração-relaxamento.

O SR cardíaca é uma rede intracelular da membrana que rodeia a maquinaria contrátil. Ele serve como um reservatório de Ca^{2 +} para a contração, e ele reabsorve intracelular Ca^{2 +} durante o relaxamento. A SR Ca^{2 +} reserva disponível para batidas é determinante para a contratilidade cardíaca. Entretanto, a remoção do intracelular Ca^{2 +} é crítica para a diástole cardíaca. Sob algumas condições fisiopatológicas, loja em cardiomyocytes como diabetes e insuficiência cardíaca, prejudicada Ca^{2 +} desembaraço e deprimido SR Ca^{2 +} pode estar envolvida no processo de disfunção cardíaca^{2,3 ,4}.

Para medir o SR Ca^{2 +} liberação e diastólica Ca^{2 +} remoção em cardiomyocytes, existem duas abordagens amplamente utilizadas: a integridade da corrente NCX baseado no remendo-braçadeira^5,6e o Ca induzida por cafeína ^{2 +} pulso baseado no Ca^{2 +} fluorescência de imagem^7,8,9. A primeira abordagem depende do fato de que o Ca^{2 +} libertado o SR é largamente bombeado fora da célula por NCX. No entanto, essa abordagem é limitada pela sua exigência de equipamento avançado e hábil operação. No presente estudo, descrevemos uma abordagem conveniente para avaliar SR Ca^{2 +} reserva e Ca^{2 +} remoção em miócitos medindo induzida por cafeína Ca^{2 +} pulso com base em um Ca^{2 +} fluorescência sistema de imagem. Brevemente, intracelular Ca^{2 +} fluorescência é indicada pelo Fura-2. Pela interligação do sistema de estimulação e sistema de perfusão, apresentamos um programa para mudar a perfusão e automaticamente o sistema de estimulação. cafeína de 10 mM foi empregada para induzir rapidamente total Ca^{2 +} lançamento no Sr. As constantes de tempo de decaimento exponencial (Tau) de pulsos de cálcio induzida por cafeína e transientes de cálcio foram obtidas de mono-exponencial curva de encaixe, que refletem a contribuição da SERCA e NCX para remoção de Ca^{2 +} diastólica em conformidade.

Protocolo

todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comité de uso no centro de pesquisa Experimental, China Academy de chinês ciências médicas e Universidade de Zhejiang e institucional Cuidado Animal.

1. preparação da solução

1. preparar todas as soluções, conforme descrito na tabela 1.

2. isolamento de esquerda Ventricular (LV) Cardiomyocytes

Nota: LV cardiomyocytes são isolados enzimaticamente usando um sistema de perfusão Langendroff como descrito anteriormente, ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11}.

1. Configurar o sistema de perfusão Langendroff. Encher o sistema de perfusão com solução de Tyrode Normal (NT), defina a temperatura de 36,5 ° c e eliminar quaisquer bolhas de ar no tubo.
2. Pesar e anestesiar um rato Sprague-Dawley por injeção intraperitoneal (ip) de hidrato de cloral (400 mg/kg). Confirmar o estado anestésico através da avaliação da resposta de pitada de cauda ou dedo do pé após 5 min.
3. Abrir a cavidade abdominal sob o apêndice xifoide com uma tesoura cirúrgica, levantar o processo xifoide e abra o baú com a tesoura. Remover o pericárdio, ligeiramente levantar o coração com pinça curvada, identificar o arco aórtico e cortou o coração pela tesoura da raiz da aorta.
4. Transferir o coração para um prato de 60 mm e lavá-lo com solução de NT. Segure a aorta com duas pinças microdissecando, monte-a da cânula de perfusão de Langendorff e então firmemente ligate da aorta para a cânula usando suturas cirúrgicas.
   Nota: Um operador hábil pode terminar este processo no prazo de 15 s.
5. Perfundir o coração com solução de 30ml NT para recuperar a circulação das artérias coronárias. Em seguida, alternar o perfusato para 30ml Ca ^{2 +}-livre solução de Tyrode (10mm taurina, 1 mg/mL BSA) para parar o batimento cardíaco. Em seguida, alternar o perfusato para solução de isolamento de colagenase A (0,6 mg/mL) para a digestão enzimática.
   Nota: Utilização. um colagenase, para experimentos com ratos diabéticos, ou colagenase II para experimentos sem ratos diabéticos.
6. Após digestão por 20-25 min, alterar rapidamente a solução de perfusão para o Ca ^{2 +}-livre solução de Tyrode para parar mais a digestão. Em seguida, segurar o coração com fórceps, cortá-lo da cânula e colocar o coração em um prato de 35 mm, contendo solução KB (ver tabela 1).
7. Dissecar a parede de LV com tesoura e pinça. Corte o átrio, o ventrículo direito e a área de junção atrioventricular. O tecido remanescente é o LV; transferi-lo para uma nova placa de 35 mm com solução KB. Picar o tecido LV em pedaços pequenos.
8. Suavemente Pipetar as peças com um conta-gotas plástico filtrada e ressuspender em solução 10ml KB.
9. Filtrar as células com 150 µm filtro de aço inoxidável de abertura e transferir para um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar a 150 x g, durante 30 s e descartar o sobrenadante. Ressuspender os miócitos em solução 10ml KB, gratuito se contentar com 6 min, desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em solução 10ml KB.
   Nota: Todas as medidas foram realizadas a 36 ° C em soluções gaseadas com 100% O ₂.

3. Reintrodução de cálcio

1. depois de ter resolvido por 20 min em solução KB, desprezar o sobrenadante e ressuspender os miócitos com solução de reintrodução de cálcio A (0,3 mM Ca ^{2 +}, 4,5 mL de Ca ^{2 +}-livre solução de Tyrode, NT de 1,5 mL de solução) durante 10 min.
2. Repita o procedimento acima com solução de reintrodução de cálcio B (0,3 mM Ca ^{2 +}, 3 mL de Ca ^{2 +}-livre solução de Tyrode, NT de 3 mL de solução).
3. Repita o procedimento acima com solução NT (1.2 mM) Ca ^{2 +} para purificar os miócitos disponíveis. Armazenar os miócitos LV isolados nesta solução e estudá-los dentro de 4-6 h.

4. Set Up de perfusão sistema

1. conectar o tubo de entrada com a solução de NT para perfusão de câmara ( figura 1A).
2. Para perfusão de agulha de miócito o alvo, ligue a Multi barril ponta múltipla (por exemplo, lápis de perfusão, doravante conhecido como lápis), fixado no micromanipulador, com a válvula controlada sistema de perfusão. Adicionar a solução de NT e solução de cafeína de 10 mM para cada coluna do lápis ( figura 1A).
3. Evacuar quaisquer bolhas de ar nos tubos para evitar o bloqueio de ar.
4. Contar o número de gotejamento da ponta micron do lápis para 10 s e manualmente ajustar o regulador de fluxo para manter a velocidade de fluxo a uma velocidade aproximada de 3 s. gotejamento/10

5. Medições de intracelular Ca ^{2 +} transitório e encurtamento do sarcômero ^{7 , 8 , 9}

1. suspensão de células pipeta de 10 µ l do slide, contar o número de células por um contador de células sob o microscópio e calcular a densidade. Diluir miócitos para uma concentração aproximada de 50.000 células/mL.
2. Adicionar o Fura-2 acetoximetil (AM) estoque (um corante sensível de cálcio) em uma suspensão de 1 mL de miócitos para trazer a concentração final de 2 µM. manter no escuro por 20 min em temperatura ambiente.
3. Centrifugar 150g por 30 s e ressuspender o cardiomyocytes com solução NT 2 vezes.
4. Turn off a luz e manter as células no escuro. Coloca os miócitos na câmara de perfusão por 15 min. Então comece a perfusão de câmara (1,5 mL/min) com solução de NT. Ritmo, os miócitos com estimulação de campo 1 Hz usando um estimulador (duração onda 4,0 ms, amplitude de pulso 8.0 V) 5 min.
5. Selecione um miócito com boa forma (forma de haste, borda em ponto e limpar as estrias transversais) e contração muscular estimulada estável (nenhuma contração espontânea) sob o microscópica lente objetiva de 10x. Em seguida, alterar a ampliação microscópica de 40x e girar a orientação da câmera CCD para manter o miócito na posição horizontal.
6. Frame o único miócito ajustando o adaptador de enquadramento de célula. Certifique-se de que o plano de fundo é claro.
7. Expor os miócitos a luz emitida por uma lâmpada de xénon, com 340 ou 380 nm de comprimento de onda da excitação filtros e os miócitos através de um objectivo de 40 x da imagem. Detectar o sinal de fluorescência em 510 nm. Entretanto, observe as mudanças de comprimento do sarcômero dos miócitos e gravar usando o módulo de macio-borda simultaneamente.
8. Registro de fluorescência por um sistema de photomultiplier dual-excitação da fluorescência. Execute o programa de gravação para o cálcio, sistema de imagem, clique em " arquivo/novo arquivo " para criar um novo arquivo de gravação e clique no " iniciar " botão para comprimento de fluorescência e sarcômero sincronicamente registro.

6. Avaliação do SR Ca ^{2 +} reserva e diastólica Ca ^{2 +} função de remoção de ^{7 , 8 , 9}

1. Interlink o " Aux Out " porto em o estimulador com o " analógico em " porto no sistema de controle de válvula (por exemplo, comandante da válvula, consulte Tabela de materiais) por um cabo BNC (para sincronizar o sinal TTL).
2. Um programa para mudar as válvulas de perfusão automaticamente como descrito anteriormente ^{8 , 9}; pré-estabelecido As etapas detalhadas para a operação são listadas como seguindo.
   1. Preset os parâmetros na válvula controlam de software de acordo com a tabela 2 e clique o " Download " o botão para baixar a sequência carregado no programa. Clique o " Trigger " botão para habilitar a função de gatilho.
      Nota: O sistema de controle de válvula pode executar a sequência depois de receber sinal TTL.
   2. Pré-ajuste o estimulador para o modo de sequência e definir os parâmetros conforme tabela 3.
3. Definir o estimulador em " passo S1 " ao ritmo do LV miócitos de 1 Hz. iniciar a perfusão de agulha na velocidade de 1,5 mL/min com solução NT.
   Nota: Porque a velocidade do fluxo de agulha é mais rápido do que a perfusão de câmara, a refração de luz do fluxo de agulha é diferente da luz refração da perfusão de câmara. A diferença de refração de luz indica o intervalo de perfusão de agulha eficaz, que rodeia o alvo miócito.
4. Selecione um miócito alvo sob a visão microscópica de baixa potência (na sequência de jusante para montante), e certifique-se que pode ser alcançado pela micro ponta do lápis. Altere a ampliação do microscópio para 400 x. Gire a orientação da câmera CCD para manter o miócito na posição horizontal. Ajuste a abertura retangular sob o adaptador de enquadramento de célula para uma janela apropriada que enche os miócitos. Certifique-se de que não há fundo mínimo; Não permita que outros miócitos ou restos de células mortas nesta janela.
5. Ajustar a posição do lápis fixada sobre o micromanipulador e cuidadosamente coloque a ponta micro à distância do raio de campo de visão para o miócito alvo menos de 400 x ampliação do microscópio.
6. Ajustar o intervalo de fluxo de agulha para principalmente cobrir o alvo miócito e certifique-se de que o miócito não pode ser arrastado pelo fluxo agulha.
7. Após 60 s básica de estimulação, role o cursor estimulador para o " D2 passo ".
   Nota: O resto do protocolo será executado automaticamente pelo sistema de controle de válvula e estimulador. Com base na configuração acima, o protocolo pode ser executado automaticamente como Figura 2A, 1 Hz básica de estimulação com solução NT para 60 s. Então pausar o ritmo e atraso de 2 s, alternar rapidamente para perfusão de cafeína 10 mM por 15 s (para funcionalmente versão Ca ^{2 +} armazenamento no SR) e em seguida, mudar novamente para solução NT.
8. No final da gravação, detectar a fluorescência de fundo para myocytes individuais. Clique o " pausa " botão para pausar a gravação, o arquivo mover a visualização microscópica de uma área em branco nas proximidades. Clique o " registro " o botão para retomar a gravação por segundos e gravar numérica 340 e 380 nm intensidade valores para correção de fundo.
9. Aberto a " constante de operação/" caixa de diálogo e preencher os valores para o " fundo " formar, respectivamente, o software pode corrigir valores de proporção Fura 2 subtraindo-se o plano de fundo.

7. Análise de dados ⁹

1. para medições de transientes de cálcio e sarcômero encurtamento na fase de estimulação básica, média os impulsos de contração muscular e em seguida analisar parâmetros dinâmicos, tais como transientes de cálcio, a constante de tempo decaimento de transiente de cálcio (Tau-1 Hz), usando o software automaticamente.
   Nota: Se o software não encaixava bem no segmento de decadência, o rastreamento de declínio para o encaixe de curva mono-exponencial manual de exportação.
2. Para pulsos de cálcio induzida por cafeína, selecione apenas o pulso com uma onda íngreme para análise da função de remoção de cálcio. Excluir células com perturbação do sinal, pulso anormal ou aqueles que fluiu fora midway.
3. Medir a amplitude do pulso induzida por cafeína cálcio (Ca-cafeína, um índice da SRCa ^{2 +} reserva).
4. Obter a constante de tempo de queda do pulso de cálcio induzida por cafeína (Tau-cafeína) por mono-exponencial curva encaixe (duração de 10 s) manualmente do software ( Figura 2).

Resultados

Aqui, ilustramos estreptozotocina (STZ) - induzida ratos diabéticos (DM) e idade-combinadas Sprague - Dawley (SD) ratos por exemplo. ratos machos de SD 8 semanas (200 ± 20 g) receberam uma única injeção intraperitoneal de STZ (70 mg/kg, ip) para o buffer de grupo ou citrato de DM para o grupo de controle. Uma semana após a administração de STZ, ratos com glicemia > 16.7 mmol/L foram considerados diabéticos. Depois de 8 semanas, os miócitos de LV foram enzimaticamente isolado...

Discussão

Fluxo de cálcio libertado o SR é a principal fonte de Ca^{2 +} para sístole no coração. Em certa medida, a amplitude do SR Ca^{2 +} conteúdo e o fracionário Ca^{2 +} libertado o SR refletir SR Ca^{2 +} reserva disponível para a contração cardíaca. Por outro lado, a Ca^{2 +} reserva de SR depende da capacidade de recaptação de SR Ca^{2 +} , Ca^{2 +} vazamento de SR e seu equilíbrio através do SR durante a diástole^12,...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Alfa Aesar	E31K43
MgCl2	Alfa Aesar	I02T070
KCl	Alfa Aesar	G22u018
HEPEs	Sigma	SLBM 7880V
D-Glucose	Alfa Aesar	10189341
NaOH	Alfa Aesar	10154048
KOH	Alfa Aesar	10144B17
KH2PO4	Alfa Aesar	F21S033
MgSO4	Alfa Aesar	C31U038
L-Glutamic	Alfa Aesar	10149849
Taurine	Alfa Aesar	J5407a
EGTA	Sigma	SLBM6826V
Collagenase A	Roche	10103586001
Collagenase Type II	Worthington	45k16005
BSA	Roche	735094
caffeine	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscope	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff system	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 links
Perfusion chamber	IonOptix	FHD
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA	VC 3-8
valve commander software	ALA	VC 3 1.0.1.2
Precision flow regulator	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Removable Tip	AutoMate Scientific	360um i.d.
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems	IonOptix	Hyperswitch
Recording software	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436