تطوير هبسك المصل المشتقة الهيئات إمبريويد الحرة لاستجواب الثقافات الخلايا الجذعية 3-D باستخدام الفحوصات ذات الصلة فسيولوجيا

Summary

نحن هنا تقرير بروتوكول لتطوير نظام ثلاثي الأبعاد (3-D) من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (هيبسس) يسمى الجسم الجنين الحرة المصل (سفيب). ويمكن استخدام هذا النموذج 3-D مثل ثقافة شريحة عضوي النمط لنمذجة التنمية القشرية البشرية والاستجواب الفسيولوجي لتطوير الدوائر العصبية.

Abstract

على الرغم من أن عددا من نماذج المرض في المختبر تم تطويرها باستخدام هيبسس، أحد القيود هو أن هذه النظم ثنائية الأبعاد (2-D) قد لا تمثل الهندسة المعمارية الأساسية والتعقيد الوظيفي من الأفراد المتضررين الذين يحملون متغيرات الأمراض المشتبه بها. التقليدية 2-D نماذج تبقى تمثيلات غير مكتملة في الجسم الحي تشبه الهياكل ولا تعبر بشكل كاف عن تعقيد الدماغ. وهكذا، هناك حاجة ناشئة لمزيد من النماذج 3-D هيبسك القائمة التي يمكن أن تلخص بشكل أفضل التفاعلات الخلوية وظائف ينظر في نظام في الجسم الحي .

هنا نحن تقرير بروتوكول لتطوير نظام 3-D من هبسس غير متمايزة على أساس الجسم الجنين الحرة المصل (سفيب). هذا النموذج 3-D يعكس جوانب تطور القشرة المخية الجديدة البطينية ويسمح للدراسات في وظائف لا يتجزأ من الخلايا العصبية الحية وأنسجة سليمة مثل الهجرة والاتصال والتواصل، وحصيرةuration. على وجه التحديد، ونحن نبرهن على أن سفيبس باستخدام بروتوكول لدينا يمكن استجوابه باستخدام الفسيولوجية ذات الصلة والمحتوى عالية الخلية المقايسات القائمة مثل التصوير الكالسيوم، والتسجيلات متعددة القطب (ميي) التسجيلات دون كريوسكتيونينغ. في حالة التسجيلات ميي، ونحن نبرهن على أن سفيبس زيادة كل من ارتفاع النشاط والنشاط على مستوى الشبكة انفجار خلال زراعة على المدى الطويل. يوفر هذا البروتوكول سفيب نظام قوي وقابلة للتطوير لدراسة تطوير تشكيل الشبكة في نموذج 3-D الذي يلتقط جوانب التنمية القشرية في وقت مبكر.

Introduction

لقد سبق أن أبلغنا عن نظام نموذج ثلاثي الأبعاد، تم إنشاؤه من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة من قبل الإنسان (هبسس) التي تلخص بعض جوانب تطوير الشبكة القشرية في وقت مبكر ¹ . هذا النموذج 3-D، وهي هيئة أجنة خالية من المصل (سفيب)، ويحسن على نماذج هيبسك التجميع بسيطة السابقة ^{2 ، 3} . وهناك مجموعة متزايدة من العمل تكشف عن أن الهياكل 3-D مثل سفيبس لدينا، والجوانب التقريبية للتنمية العصبية التي لوحظت عادة في الجسم الحي وفي وقت سابق نقطة من لوحظ في 2-الأبعاد (2-D) / أحادي الطبقة نماذج هيبسك ^{4 ، 5} . وقد ركزت الدراسات الأولية على التعقيد التنظيم الذاتي للهيئات 3-D دون إظهار تعقيدها الفسيولوجية ² .

وقد تم استخدام بروتوكول الموصوفة هنا على هيبس غير متمايزة المستمدة من الخلايا الليفية و خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (بمكس). يتم الحفاظ على هذه الخلايا على γ المشعاعات الماوس الجنينية المشع (ميفس). يتم تنظيف هذه المستعمرات هيبسك يدويا من خلايا متباينة عفوية، حصاد إنزيميا، ومعلق في المتوسطة التي تحتوي على رو-كيناز المانع Y-27632 (روكي). تخضع هبسس غير المتمايزة للتفكك والطرد المركزي قبل أن يتم نقلها إلى 96 جيدا لوحات التصاق منخفضة الخامس أسفل. بعد الطلاء، يبدأ الحث العصبي باستخدام تثبيط سماد المزدوج (SB431542 و LDN193189 جنبا إلى جنب مع ديكوب 1 (دك-1)) لدفع الأمامي الأمامي الجبهي الدماغ العصبي مصير النسب ⁶ . بعد 14 يوما، يتم نقل سفيبس إلى إدراج ثقافة الخلية في لوحة 6 جيدا. وبمجرد نقلها، تبدأ سفيبس الجولة في الانتشار ورقيقة، مع الحفاظ على اتصالات الشبكة المحلية كما هو الحال في كثير من الأحيان لوحظ في الاستعدادات زراعة شريحة عضوي الشكل الحصين باستخدام إدخال خلية ثقافة مماثلة ^{1 ،}سس = "كريف"> 7.

استخدام منصة سفيب 3-D على أساس هذا الشكل هو قابل للإنتاج الفعال للشبكات القشرية التي يمكن استجوابها باستخدام المقايسات الفسيولوجية الخلية القائمة مثل التصوير الكالسيوم أو المقايسات الكهربية مثل تسجيلات خلية واحدة أو مجموعة متعددة القطب (ميي ) ^{1 -} على الرغم من أن نظم 3-D تحمل علامات التنمية القشرية في وقت مبكر، وقد أظهرت دراسات أخرى أن هذه الهيئات 3-D قد تتطلب أوقات حضانة أطول للسماح للبطء بطبيعتها وتيرة تطوير الأنسجة البشرية ⁸ . هذا البروتوكول سفيب يولد بنجاح 3-D سفيبس من هبسس غير المتمايزة التي تلتقط جوانب التنمية في وقت مبكر من القشرة.

إمكانات سفيبس لنماذج نموذجية الانحرافات في الاضطرابات العصبية هو قوة هذا النظام. و هيبسس المستمدة من أنسجة المريض يمكن أن تزرع في خلايا الجهاز العصبي التي تخضع للحمارأيس المتعلقة بيولوجيا الخلية وكذلك ما يصاحب ذلك التعبير الجيني. وتستخدم إيبسس الإنسان للتأكد من الملف الجيني من مجموعات كبيرة من الأفراد الذين يعانون من اضطرابات عصبية متفاوتة مع مسببات معقدة مثل اضطراب طيف التوحد (أسد)، الفصام ⁹ ، متلازمة ريت ¹⁰ ، ومرض الزهايمر ^{11 ، 12} . حتى وقت قريب، كانت نماذج إبسك عادة أحادي الطبقة الاستعدادات التي، في حين يتقن في تقييم التفاعلات الجزيئية، كانت غير كافية في فك رموز التفاعلات الخلوية المعقدة ينظر في الجسم الحي . وكانت النماذج الحيوانية البديل الافتراضي لإعادة إنشاء منصة الجهاز كله. وتعاني هذه النماذج الحيوانية من سوء ترجمة النتائج ولها قدرة محدودة على تكرار التشكيلات الجينية البشرية التي حددتها الدراسات الفحوصات الجينية الكبيرة. وهكذا، فإن تطوير نظم 3-D من إيبسس يضيف طبقة اللازمة من التعقيد في الإنساننمذجة المرض ^{13 ، 14} . الخطوة التالية لمنصات هيبسك 3D هو لاستيعاب متطلبات على نطاق واسع من فحص الإنتاجية العالية باستخدام فحوصات الخلية القائمة ¹⁵ .

Protocol

1. جيل الخلايا العصبية السلف

1. الحفاظ على هبسس المستمدة من الخلايا الليفية و بمكس في 6 لوحات جيدا على γ المشعاع الماوس تغذية الخلايا الجنينية (ميف) طبقة الخلية في المتوسطة إيبسك الإنسان تستكمل مع جزيئات صغيرة (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: الصيانة اليومية هي نسخة معدلة من الإجراءات المبلغ عنها سابقا ^{1 ، 16} .
   1. لوحة 6 × 10 ⁵ ميفس على كل بئر من لوحة 6-جيدا زراعة الأنسجة الصف في 300 ميكرولتر / ينصح جيدا المتوسطة (بروتوكول الشركة المصنعة التالية).
   2. بعد 48 ساعة، استبدال ميفس المتوسطة مع 300 ميكرولتر / جيدا هيبسك المتوسطة لمدة 1 ساعة قبل إضافة هيبسس.
   3. ذوبان الجليد بسرعة هيبسس في حمام مائي 37 درجة مئوية وإضافة ببطء 1 مل هبسك متوسطة قطرة. نقل هيبسس والمتوسطة إلى أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة المتوسطة لجلب الحجم الكلي إلى 5 مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 4 دقائق في 129 x ج، نضح سوبيرناتانت، بلطف إعادة تعليق بيليه في 1 مل وسط هيبسك مع المانع روك في تركيز 1: 1،000.
   4. لوحة تعليق الخلية (عادة المصنفة في 300،000 خلية / بئر) على طبقة الخلية ميف واحتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ كو ₂ ، 95٪ الرطوبة.
   5. رصد ثقافة إبسك عن كثب باستخدام المجهر الضوئي. بعد 48 ساعة، وإزالة الثقافات التي لها حواف متفاوتة، نمت لتصبح الكيسي مثل أو تظهر مصفر البني تحت المجهر الضوئي للحد من التمايز عفوية.
      ملاحظة: بعد 7-10 أيام، يجب أن تشكل مستعمرات هيبسك. يجب أن تكون المستعمرات مستديرة، مع حدود محددة بوضوح وكثافات خلية موحدة، وخالية من الخلايا غير موحدة معبأة بشكل فضفاض.
   6. يدويا تحديد مستعمرات هيبسك مستديرة لمسح ثقافة الخلايا متباينة عفوية. توسيع المستعمرات من خلال وضعها على طبقات ميف جديدة. توسيع 1: 3 كل 7 أيام عندما الثقافات بالقرب كونفلنسي وتجميد ^{1 ، 16} .
2. بعد التوسع وتجميد الخلايا (للنسخ الاحتياطي)، وتنمو مستعمرات هيبسك على لوحات حتى تصل إلى 50-75٪ التقاء.
3. بعد سبعة أيام الطلاء، واستخدام العلاج الأنزيمية خفيفة (5-10 دقيقة مع 300 ميكرولتر من محلول انزيم) و تريتوراتيون لطيف (2-4 مرات مع ماصة 1000 ميكرولتر) لحصاد وإعداد هيبسس لتمايز الخلايا السلائف العصبية.
4. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية في 129 x ج لمدة 4 دقائق، نضح طاف، و ريسوسبيند بيليه في 5 مل المتوسطة إيبسك الإنسان. نقل تعليق الخلية إلى 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 5 سم طبق ثقافة الخلية لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية للقضاء على ميفس وتحقيق أقصى قدر من العائد هيبسك. نقل المتوسطة (مع الخلايا غير الملتصقة) إلى آخر 5 سم طبق الجيلاتين المغلفة.
5. نقل الخلايا غير الملتصقة إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل باستخدام ماصة نقل. شطف بلطف لوحات مع 3 مل المتوسطة وإضافته إلى أنبوب 15 مل.
6. الطرد المركزي تعليق الخلية في 129 x ج لمدة 4 دقائق، نضح السوبرناتانت، و ريسوسبيند بلطف بيليه في المتوسط. تحديد عدد الخلايا باستخدام عداد الخلية الآلي. لوحة 9000 خلية / جيدا في 96-جيدا منخفضة التصاق لوحة V- القاع.
7. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 163 x ج لمدة 3 دقائق. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية، و 95٪ الرطوبة و 5٪ كو ₂ . باستخدام ماصة، وتغيير 50٪ المتوسطة كل يوم عن طريق إزالة نصف المتوسطة واستبدالها مع الطازجة كيميائيا تعريف التفريق المتوسطة 1 (DM1؛ الشكل 1 ؛ جدول المواد) لمدة 14 يوما.

2. المصل خالية الجسم إمبريويد (سفيب) التعريفي ( الشكل 2 )

1. وضع 40 ميكرون ثقافة الخلية إدراج في لوحات 6 جيدا وإضافة 1 مل من DM1 المتوسطة على الأقل 1 ساعة قبل إضافة المجاميع.
2. في يوم 14، ونقل المجاميع مع 20 ميكرولتر المتوسطة باستخدام 200 ميكرولتر طرف الفم واسعة على 40 ميكرون إدراج ثقافة الخلية وتغيير المتوسطة إلى DM2.
   ملاحظة: إدراج ثقافة الخلية هي إدراج المتخصصة التي تجلس قليلا من الجزء السفلي من البئر وتتكون من غشاء بولي ترافلوروإيثيلين معلقة عبر إطار من البلاستيك. هذا الغشاء هو حيويا ويمكن كفاءة الحفاظ على المغذيات ونقل الأكسجين إلى سفيبس، التي توضع على القمة. وتستخدم عادة مع الثقافات شريحة الحصين عضوي النمط مأخوذة من الماوس أو الفئران ^{7 ، 17 ، 18} .
   1. نقل 4-6 المجاميع إلى إدخال خلية واحدة إدراج والسماح مساحة كافية بين المجاميع. إزالة أكبر قدر ممكن من الحل الزائد باستخدام طرف ماصة غرامة (على سبيل المثال 200 ميكرولتر طرف).
      ملاحظة: فمن المقبول لإزعاج لفترة وجيزة سفيب لأنها سوف تتحرك على إدراج ثقافة الخلية كحل في إزالتها من جميع أنحاء سفيبس.
   2. الحفاظ على الثقافات في 1 مل من DM2 عند 37 درجة مئوية، و 95٪ الرطوبة و 5٪ كو ₂ . باستخدام ماصة، وتغيير 75٪متوسطة كل يوم عن طريق إزالة ثلاثة أرباع المتوسط ​​والاستعاضة عن ثلاثة أرباع المتوسطة الطازجة. على سبيل المثال، وإزالة 750 ميكرولتر من المتوسطة وإضافة 750 ميكرولتر من المتوسطة الطازجة.
3. بعد 14 يوما من الثقافة، والتبديل إلى DM3 المتوسطة مع 75٪ المتوسطة تغيير كل يوم و 16 يوما أخرى.
4. للحفاظ على سفيبس على إدراج خلية ثقافة ما بعد 30 يوما، تغيير المتوسطة كل يوم لمدة 60 و 90 و 120 يوما.
   ملاحظة: سوف سفيبس تنمو إلى حوالي 1000 ميكرون في القطر وعادة ما تكون 100-150 ميكرون سميكة ¹ .

3. تحديد تكوين سفيب

1. فصل سفيبس من إدراج بواسطة بيبتينغ بلطف المتوسطة باستخدام 200 ميكرولتر واسعة الفم ماصة طرف. لنقل سفيبس، واستخدام واسعة ماصة الفم تلميح شفط بلطف الأجسام في طرف ماصة. بعد تحميل سفيب في طرف ماصة، نقل بلطف إلى لوحات 12 جيدا وغسل مع 300 ميكرولتر الفوسفات مخزنة المالحة(بس) لكل بئر.
   ملاحظة: سيتم تعليق سفيبس في حل في لوحات 12 جيدا. هذا أمر مهم للسماح الاختراق الكامل من مثبت، حل عرقلة، والأجسام المضادة. إذا كان استخدام سفيبس متعددة للتلطيخ، ويمكن إضافة ما يصل إلى 10 سفيبس لكل بئر من 12 لوحة جيدا. وهذا من شأنه الحفاظ على الحلول والأجسام المضادة.
2. إصلاح سفيبس مع 300 ميكرولتر لكل بئر 4٪ بارافورمالدهيد في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-45 دقيقة. غسل سفيبس الثابتة مرتين مع 300 ميكرولتر بس، 3-5 دقائق كل غسل.
   تحذير: ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل مع بارافورمالدهيد.
   ملاحظة: دقق في إمونوريكتيفيتي إلى علامات لتحديد النضج، نوع الخلية وما إلى ذلك لسمات الخلايا العصبية في هذه الدراسة تم استخدام الدجاج Tuj1 في 1: 500، لعلامات إضافية يرجى الاطلاع على الجدول 2 والمراجع ^{1 ، 16} .
3. بيرمابيليز وكتلة مع 0.1٪ تريتون-X100 في برنامج تلفزيوني و 10٪ مصل حمار العادي (حجب الحل؛ 300 μ؛ L لكل بئر) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
4. إزالة الحل حجب وعلاج سفيبس مع 300 ميكرولتر الأجسام المضادة الأولية في حجب الحل. احتضان عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. غسل سفيبس ثلاث مرات (3-5 دقيقة لكل غسل) في 300 ميكرولتر بس تحتوي على 0.1٪ تريتون-X.
5. إعداد الأجسام المضادة الثانوية 1: 1000 في حجب الحل. احتضان سفيبس لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الأجسام المضادة الثانوية. غسل سفيبس مع 300 ميكرولتر بس، 3 مرات لمدة 3-5 دقائق لكل منهما.
   ملاحظة: في هذه المرحلة يمكن تحضير سفيبس للتصوير.
6. إلى الصورة، ماصة سفيبس على شريحة زجاجية باستخدام ماصة واسعة تحمل. إزالة الحل الزائد حول سفيب باستخدام شفط لطيف.
   ملاحظة: لظروف مماثلة تلطيخ، سفيبس متعددة يمكن وضعها على الشريحة الزجاجية نفسها.
7. إضافة قطرة من وسط تصاعد على سفيبس، وضع ساترة الزجاج، وضغط بلطف لضمان عدم وجود فقاعات الهواء. السماح المتوسطة تصاعد إلى تتصلب والمضي قدما في التصوير والتقدير الكمي (الخطوة 3.8).
   ملاحظة: بعد تصاعد المتوسطة يصعد، و سفيبس جاهزة للتصوير.
8. أداء الكمي الخلية عن طريق اتخاذ مناطق متعددة من الفائدة (روي) عبر سفيب واستخدام Z- كومة جنبا إلى جنب مع صورة الإسقاط القصوى من خلال كل عائد الاستثمار على المجهر متحد البؤر القياسية كما هو موضح في المراجع ^{1 ، 16} .
   ملاحظة: يمكن قياس سفيبس كله باستخدام البلاط على أساس الصورة (انظر المراجع ^{1 ، 16} لمزيد من التفاصيل). منذ سفيبس رقيقة إلى ما يقرب من 100 ميكرون، هناك تشتت الحد الأدنى من الضوء في الأنسجة، وبالتالي ليست هناك حاجة للمجهر 2 الفوتون. في وقت سابق من استخدام هذا البروتوكول مع الخلايا الجذعية المستمدة من الخلايا الليفية إيبسس تنتج خريطة مصير سفيب التي كشفت بنية معقدة ومتنوعة مع المجموعات السكانية الفرعية من إنترنيورونس مع الهويات النسخي التي تشبه سغي والأمامي الدماغ الأمامي ^{1 ، 16.}

4. تسجيل النشاط العصبي في سفيبس باستخدام الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف

1. إعداد 12-جيدا لوحات ميي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
2. غسل لوحات ميي 3 مرات لمدة 5 دقائق مع العقيمة H ₂ O تحت ظروف معقمة لتنظيف. يغسل لمدة 5 دقائق مع 75٪ من الإيثانول ثم مع الإيثانول 100٪ لتعقيم لوحة.
3. خبز لوحة مقلوب في الفرن لمدة 4-5 ح في 50 درجة مئوية لإتمام عملية التعقيم.
4. إضافة 500 ميكرولتر 0.2٪ محلول البولي إثيلينيمين (بي) إلى كل بئر واحتضان 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. نضح بي وغسل الآبار 4x مع مقطر معقم H ₂ O. الهواء الجاف في غطاء محرك السيارة بين عشية وضحاها.
5. إعداد 20 ميكرولتر / مل حل من لامينين في L15 المتوسطة وإضافة 10 ميكرولتر لامينين إلى مركز كل بئر.
   مالحظة: ال تقم بتغطية املرجع املرجعي وأقطاب التأريض.
6. إضافة العقيمة د ₂ O إلى الخزانات المحيطة لمنع التبخر المتوسط ​​أو لامينين.احتضان لوحة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
7. إضافة سفيبس (انظر الأقسام 1 و 2) لوحات ل مامين المغلفة لامينين عن طريق شفط لهم بلطف في غيض ماصة الفم واسعة ونقلها. إضافة 200 ميكرولتر DM2 المتوسطة إلى كل بئر واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، و 95٪ الرطوبة و 5٪ كو ₂ .
8. إضافة 200 ميكرولتر إضافية المتوسطة بعد 24 ساعة والسماح لها لاسترداد لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، و 95٪ الرطوبة، و 5٪ كو ₂ قبل قراءة لوحة.
9. وضع لوحة الشرق الأوسط وأفريقيا في لوحة القارئ (مسخن إلى 37 درجة مئوية) لتسجيل النشاط العصبي. سجل النشاط لمدة 10 دقيقة مع برنامج تسجيل ميي المرتبطة بها. انظر المرجع ¹⁹ للحصول على التفاصيل.
10. توليد البيانات الخام المستمر تيارات والمؤامرات النقطية من نشاط الخلايا العصبية باستخدام برنامج التحليل الإحصائي ¹⁹ .
    ملاحظة: تؤخذ التسجيلات ميي 7 أيام بعد طلاء سفيب. لهذه الدراسة، تم تسجيلات لمدة 10 دقيقة للكشف عن النشاط انفجار الشبكة، يخدعوتتبع دقيق، والمؤامرات النقطية. يمكن الحفاظ على سفيبس على المدى الطويل على لوحات ميي ويمكن تسجيلها على فترات أطول من الزمن باستخدام الظروف التي تسيطر عليها بيئيا ( الشكل 6 ).

النتائج

سفيبس نمت باستخدام تقنيتنا أسفرت الأنسجة مع الخصائص المورفولوجية التي تشبه في وقت مبكر النامية القشرية منطقة تحت البطين مليئة الخلايا العصبية إيجابية Tuj1 إيجابية، فضلا عن الأسلاف العصبية ( الشكل 3A ). لوحظت العديد من الورديات النامية...

Discussion

بروتوكول الموصوفة هنا يوفر شروط لتمييز مصدر هيبسك في هيكل 3-D الذي يلخص مرحلة تنموية في وقت مبكر من القشرة الأمامية. هذا الإجراء يعطي الهياكل التي يمكن استجوابه لالكهربية في حين يجري أيضا قابلة للمجهر. التشكل النهائي لل سفيب يشبه ذلك من عضوي النمط الثقافات شريحة الدما...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components
STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media)	STEMCELL Technologies	0-5835	250 mL
PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media)	GlobalStem	GSM-2001
Name	Company	Catalog Number	Comments
DM1 Media Components
D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1	Invitrogen	10565018	385 mL
Knockout Serum Replacement	Invitrogen	10828028	20% 100 mL
Pen/Strep	Invitrogen	15140122	5 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid	Invitrogen	11140050	5 mL
2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid	Invitrogen	21985023	900 μL
Name	Company	Catalog Number	Comments
DM2 Media Components
D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1	Invitrogen	10565018	500 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
Pen/Strep	Invitrogen	15140122	5 mL
N-2 Supplement (100x), liquid	Invitrogen	17502048	10 mL
Name	Company	Catalog Number	Comments
DM3 Media Components
NEUROBASAL Medium (1x), liquid	Invitrogen	21103049	500 mL
B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid	Invitrogen	12587010	10 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
Pen/Strep	Invitrogen	15140122	5 mL
Name	Company	Catalog Number	Comments
Small Molecules
Thiazovivin	Stemgent	04-0017	2 μM
SB431542	Stemgent	04-0010-10	1:1,000 (10 μM)
Dorsomorphin	Stemgent	04-0024	1 μM
LDN-193189	Stemgent	04-0074-10	250 nM
Y27632 (ROCKi)	Stemgent	04-0012-10	10 μM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant Protiens
DKK-1	Peprotech	120-30	200 ng/mL
Name	Company	Catalog Number	Comments
Components/Materials
Cell Culture inserts 0.4 μM, 30mm Diameter	Millicell	PICM0RG50
Mouse Embryonic Fibroblasts	GlobalStem	GSC-6301G
96 well V bottom w/Lids	Evergreen	222-8031-01V
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	ThermoFisher	A1110501
TritonX-100	ThermoFisher	85111
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher	10010023	500 mL
Normal Donkey Serum	Jackson Labs	017-000-121
Leibovitz's L-15 Medium	ThermoFisher	11415114	500 mL
DRAQ5 (Nuclear Marker)	ThermoFisher	65-0880-96
MEA Plates	Axion Biosystems	M768-GL1-30Pt200
6 well flat bottom	Falcon	353046
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Nestin	Millipore	MAB5326
Brn-2	Protein tech	14596-1-AP
VGLUT1	Synaptic Systems	135 303
Pax6	abcam	ab5790
Calretinin	abcam	ab702
Calbindin	abcam	ab11426
CoupTFII	R&D Systems	PPH714700
Nkx 2.1	abcam	ab12650
Tuj1	abcam	ab41489
Reelin	Millipore	MAB5364
Tbr1	Millipore	MAB2261
NFH	Dako	M0762