Sviluppare corpi embrioni liberi del siero derivato da HiPSC per l'interrogazione di colture a cellule staminali a 3 dosi utilizzando saggi fisiologicamente rilevanti

Riepilogo

Qui viene riportato un protocollo per sviluppare un sistema tridimensionale (3-D) da cellule staminali pluripotenziali umane (hiPSCs) chiamate il corpo embrionale libero (SFEB) serico. Questo modello di 3-D può essere utilizzato come una cultura di fetta organotipica per modellare lo sviluppo corticale umano e per l'interrogatorio fisiologico dei circuiti neurali in via di sviluppo.

Abstract

Sebbene siano stati sviluppati alcuni modelli di malattia in vitro usando hiPSCs, una limitazione è che questi sistemi bidimensionali (2-D) non possono rappresentare la complessità cytoarchitectural e funzionale sottostante degli individui affetti che trasportano varianti di malattia sospette. I modelli 2D convenzionali rimangono rappresentazioni incomplete di strutture in vivo e non catturano adeguatamente la complessità del cervello. Pertanto, esiste un'esigenza emergente per altri modelli basati su 3-D hiPSC che possono meglio ricapitolare le interazioni cellulari e le funzioni viste in un sistema in vivo .

Qui si segnalano un protocollo per sviluppare un sistema 3-D da hiPSC indifferenziati basato sul corpo embrionale libero (SFEB) serico. Questo modello di 3-D riflette aspetti di un neocortex ventralizzato in sviluppo e consente di studiare funzioni integrali a cellule neurali viventi e tessuti intatti come migrazione, connettività, comunicazione e matriceURATA. In particolare, dimostriamo che i SFEB che utilizzano il nostro protocollo possono essere interrogati utilizzando saggi fisiologicamente rilevanti e basati su cellule ad alto contenuto, come ad esempio la formazione di calcio e le registrazioni multi-elettrodi (MEA) senza cryosectioning. Nel caso delle registrazioni MEA, dimostriamo che gli SFEB aumentano l'attività di picco e la rottura a livello di rete durante la coltura a lungo termine. Questo protocollo SFEB fornisce un sistema robusto e scalabile per lo studio dello sviluppo della formazione di reti in un modello 3-D che cattura gli aspetti dello sviluppo corticale precoce.

Introduzione

Abbiamo precedentemente segnalato un sistema di modelli a 3, generato da cellule staminali pluripotenti indotte da pazienti derivate dal paziente (hiPSCs) che ricapitulano alcuni aspetti dello sviluppo della rete corticale precoce ¹ . Questo modello 3-D, un corpo embrionale libero senza sforzo (SFEB), migliora sui precedenti modelli di hiPSC semplici aggregazione ^{2 , 3} . Un crescente numero di lavori sta rivelando che le strutture a 3-D come le nostre SFEB, gli aspetti approssimativi dello sviluppo neurale comunemente osservati in vivo e in un momento precedente rispetto a quelli osservati nei modelli 2D (2D) / monolayer hiPSC ^{4 , 5} . Gli studi iniziali sono stati focalizzati sulla complessità autoorganizzativa degli organi 3-D senza dimostrare la loro complessità fisiologica ² .

Il protocollo qui descritto è stato utilizzato su hiPSC indifferenziati derivati ​​da fibroblasti e Cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs). Queste cellule sono mantenute su alimentatori embrionali (MEF) erogati da γ-irradiati. Queste colonie hiPSC vengono pulite manualmente da cellule spontaneamente differenziate, raccolte enzimaticamente e risospese in mezzo contenente inibitore Rho-Kinasi Y-27632 (ROCKi). I hiPSC indifferenziati vengono sottoposti a dissociazione e centrifugazione prima di essere trasferiti in piastre a basso tenore a basso tenore a 96 pozzetti. Dopo la placcatura, l'induzione neurale viene avviata usando la doppia inibizione SMAD (SB431542 e LDN193189 insieme a dickkopf 1 (DKK-1)) per guidare un linfoidale neurone-fate anteriore-frontale ⁶ . Dopo 14 giorni, i SFEB vengono trasferiti a inserti di coltura cellulare in un piatto a 6 pozzetti. Una volta trasferiti, i SFEB rotondi iniziano a diffondersi e sottili, pur mantenendo le connessioni di rete locali come spesso si osserva nelle preparazioni di coltura organotipica di fetta di ippocampo usando inserti simili della coltura cellulare ^{1 ,}Ss = "xref"> 7.

L'utilizzo di una piattaforma 3-D basata su SFEB in questo formato è suscettibile di un'efficiente produzione di reti corticali che possono essere interrogate utilizzando saggi fisiologici basati su cellule come l'imaging di calcio o analisi elettrofisiologiche come registrazioni singole o array multi-elettrodo (MEA ) ¹ . Sebbene i sistemi 3-D abbiano i marcatori dello sviluppo corticale precoce, altri studi hanno dimostrato che questi corpi a 3-D potrebbero richiedere tempi di incubazione più lunghi per consentire il ritmo intrinsecamente più lento dello sviluppo del tessuto umano ⁸ . Questo protocollo SFEB genera con successo SFEB a 3-D da hiPSC indifferenziati che cattura gli aspetti dello sviluppo precoce della corteccia.

Il potenziale di SFEB per modellare le aberrazioni di rete nei disturbi neurologici è una forza di questo sistema. Gli hiPSC derivati ​​dal tessuto del paziente possono essere coltivati ​​in cellule del sistema nervoso soggette a culoAys correlati alla biologia cellulare e all'espressione genica concomitante. IPSC umani vengono utilizzati per accertare il profilo genetico di grandi gruppi di individui con disturbi neurologici variabili con etiologie complesse come il disturbo dello spettro autistico (ASD), la schizofrenia ⁹ , la sindrome di Rett ¹⁰ e la malattia di Alzheimer ^{11 , 12} . Fino a poco tempo fa i modelli iPSC sono stati tipicamente preparati monostrato che, pur avendo esperienza nella valutazione delle interazioni molecolari, erano inadeguate nel decifrare le complesse interazioni cellulari viste in vivo . I modelli animali sono stati il ​​sostituto predefinito per ricreare la piattaforma di organo intero. Questi modelli animali sono afflitti dalla scarsa traduzione dei risultati e hanno limitato capacità di replicare profili genetici umani identificati da grandi studi di screening genetico. Pertanto, lo sviluppo di sistemi 3-D da iPSC aggiunge un necessario livello di complessità nell'uomoModellazione delle malattie ^{13 , 14} . Il passo successivo per le piattaforme 3D hiPSC è quello di soddisfare i requisiti di grande scala di screening ad alto rendimento utilizzando i test a base di celle ¹⁵ .

Protocollo

1. Generazione di cellule progenitrici neurali

1. Mantenere hiPSC derivati ​​da fibroblasti e PBMC in piastre a 6 pozzetti su uno strato di cellule embrionali (MEF) di tipo γ-irradiato nel mezzo umano iPSC integrato con piccole molecole (vedi tabella dei materiali).
   NOTA: la manutenzione giornaliera è una versione modificata delle procedure precedentemente riportate ^{1 , 16} .
   1. Piastra 6 x 10 ⁵ MEF su ciascun pozzetto di una piastra di coltura di tessuti a 6 pozzetti in 300 μL / media raccomandata (seguendo il protocollo del produttore).
   2. Dopo 48 h, sostituire il mezzo di MEF con 300 μL / pozzetto hiPSC medium per 1 h prima di aggiungere hiPSCs.
   3. Rapidamente scongelare hiPSCs in un bagno d'acqua di 37 ° C e aggiungere lentamente 1 ml di mezzo hiPSC in goccia. Trasferire i hiPSC e il mezzo a un tubo conico da 15 ml. Aggiungere mezzo per portare il volume totale a 5 ml. Centrifugare per 4 min a 129 xg, aspirare la supernataNt, riposizionare delicatamente il pellet in 1 mL di mezzo hiPSC con inibitore ROCK a concentrazione di 1: 1000.
   4. Piattare la sospensione cellulare (tipicamente seminata a 300.000 cellule / pozzetto) sullo strato di cellule MEF e incubare a 37 ° C, 5% CO ₂ , 95% di umidità.
   5. Monitorare la cultura iPSC utilizzando attentamente un microscopio leggero. Dopo 48 ore, togliere le colture che presentano spigoli irregolari, diventano cisti-simili o appaiono marrone giallastro sotto il microscopio per minimizzare la differenziazione spontanea.
      NOTA: Dopo 7 - 10 giorni, le colonie hiPSC dovrebbero formarsi. Le colonie dovrebbero essere rotonde, con frontiere chiaramente definite e densità cellulari uniformi e prive di cellule non uniformi imballate.
   6. Selezionare manualmente le colonie hiPSC rotonde per liberare la cultura delle cellule spontaneamente differenziate. Espandere le colonie posizionandole su strati MEF freschi. Espandere 1: 3 ogni 7 giorni quando le culture vicino confluenza e congelare ^{1 , 16} .
2. Dopo l'espansione e la congelazione delle celle (per il backup), coltivare le colonie hiPSC sulle piastre fino a raggiungere la confluenza del 50-75%.
3. Dopo 7 giorni di placcatura, utilizzare un trattamento enzimatico lieve (5-10 min con 300 μL di soluzione enzimatica) e una triturazione delicata (2-4 volte con una pipetta da 1000 μL) per raccogliere e preparare hiPSC per la differenziazione delle cellule dei precursori neurali.
4. Centrifugare la sospensione cellulare a 129 xg per 4 min, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 5 mL di iPSC umano. Trasferire la sospensione cellulare in un gel da 0,1% di gelato rivestito da 5 cm per 1 h a 37 ° C per eliminare i MEF e massimizzare la resa hiPSC. Trasferire il mezzo (con cellule non aderenti) ad un altro piatto rivestito con gelatina da 5 cm.
5. Trasferire le cellule non aderenti in un tubo centrifugo da 15 ml utilizzando una pipetta di trasferimento. Risciacquare delicatamente le piastre con 3 ml di media e aggiungerlo al tubo da 15 ml.
6. Centrifugare la sospensione cellulare a 129 xg per 4 min, aspirare il superE riposizionare delicatamente il pellet in mezzo. Determinare il conteggio delle cellule utilizzando un contatore di celle automatiche. Piastra 9.000 celle / pozzetto in una piastra di fondo a basso tenore a 96 pozzetti.
7. Centrifugare la piastra a 163 xg per 3 min. Incubare la piastra a 37 ° C, umidità del 95% e 5% CO ₂ . Utilizzando una pipetta, cambiare il 50% di media ogni altro giorno rimuovendo la metà del mezzo e sostituendolo con un nuovo mezzo di differenziazione chimico definito 1 (DM1; Figura 1 ; Tabella dei Materiali) per 14 giorni.

2. Induzione del corpo embrionale senza emorragie (SFEB) ( Figura 2 )

1. Inserire gli inserti di coltura di cellule da 40 μm in lastre a 6 pozzetti e aggiungere 1 mL di mezzo DM1 almeno 1 h prima dell'aggiunta di aggregati.
2. Il giorno 14, trasferire gli aggregati con 20 μL di mezzo utilizzando una punta di bocca larga da 200 μL su inserti di coltura di cellule da 40 μm e cambiare il mezzo a DM2.
   NOTA: Gli inserti della coltura cellulare sono inserti specializzati che si trovano leggermente fuori dal fondo del pozzo e sono costituiti da una membrana di politetrafluoroetilene sospesa su un telaio di plastica. Questa membrana è biocompatibile e può sostenere in modo efficace il trasporto di sostanze nutritive e ossigeno nei SFEB, che vengono collocati in cima. Sono comunemente utilizzati con colture organiche di fetta di ippocampo prelevate dal topo o dal ratto ^{7 , 17 , 18} .
   1. Trasferisci 4-6 aggregati ad un inserto di coltura cellulare e permette spazio sufficiente tra gli aggregati. Rimuovere la soluzione più eccessiva possibile utilizzando una punta fine pipetta ( ad es. 200 μL di punta).
      NOTA: È accettabile disturbare brevemente l'SFEB mentre si muoveranno sull'inserto della coltura cellulare come soluzione in rimosso da circa i SFEB.
   2. Mantenere le colture in 1 ml di DM2 a 37 ° C, umidità del 95% e 5% di CO ₂ . Utilizzando una pipetta, cambiate il 75%Media ogni due giorni rimuovendo tre quarti del mezzo e sostituendo con tre quarti freschi. Ad esempio, rimuovere 750 μl di mezzo e aggiungere 750 μl di terreno fresco.
3. Dopo 14 giorni di coltura, passare al mezzo DM3 con il 75% di cambio medio ogni altro giorno e per altri 16 giorni.
4. Per mantenere gli SFEB sugli inserti della coltura cellulare oltre 30 giorni, modificare il mezzo ogni altro giorno per 60, 90 e 120 giorni.
   NOTA: Le SFEB cresceranno a circa 1.000 μm di diametro e sono tipicamente 100-150 μm di spessore ¹ .

3. Determinazione della composizione SFEB

1. Staccare le SFEB dall'inserto facendo pipettare delicatamente il mezzo utilizzando una punta pipetta a bocca larga da 200 μL. Per trasferire i SFEB, utilizzare una punta di pipetta largo per aspirazione delicatamente ai corpi nella punta del pipetta. Dopo aver caricato SFEB nella punta del pipetta, trasferire delicatamente su piatti da 12 pozzetti e lavare con 300 μL salina fosfata tamponata(PBS) per pozzetto.
   NOTA: SFEBs saranno sospesi in soluzione nelle piastre a 12 pozzetti. Questo è importante per consentire la penetrazione completa del fissativo, della soluzione di blocco e degli anticorpi. Se si utilizzano più SFEB per la colorazione, fino a 10 SFEB possono essere aggiunti per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Ciò conserverà soluzioni e anticorpi.
2. Fissare SFEB con 300 μL per pozzetto 4% di paraformaldeide a temperatura ambiente per 30-45 minuti. Lavare SFEB fisso due volte con 300 μL di PBS, 3-5 minuti ogni lavaggio.
   Attenzione: Indossare dispositivi di protezione appropriati per la manipolazione della paraformaldeide.
   NOTA: Sonda per l'immunoreattività ai marcatori per determinare la maturità, il tipo di cellule ecc. Per la marcatura dei neuroni in questo studio il pollo-Tuj1 è stato utilizzato a 1: 500, per marcatori aggiuntivi vedere la Tabella 2 e le referenze ^{1 , 16} .
3. Permeabilizzare e bloccare con 0,1% di Triton-X100 in PBS e 10% di siero normale di asina (soluzione di blocco; 300 μ; L per pozzetto) per 1 h a temperatura ambiente.
4. Rimuovere la soluzione di blocco e trattare SFEB con 300 μL di anticorpi primari nella soluzione di blocco. Incubare a 4 ° C per una notte. Lavare tre volte SFEB (3-5 minuti per lavaggio) in 300 μL di PBS contenente 0,1% di Triton-X.
5. Preparare gli anticorpi secondari 1: 1000 nella soluzione di blocco. Incubare SFEB per 1 h a temperatura ambiente con anticorpi secondari. Lavare SFEB con 300 μl PBS, 3 volte per 3-5 minuti ciascuno.
   NOTA: in questa fase i SFEB possono essere preparati per l'imaging.
6. Per l'immagine, pipettare SFEB su una lastra di vetro usando una pipetta largo-bore. Rimuovere la soluzione in eccesso attorno all'SFEB usando una aspirazione dolce.
   NOTA: per condizioni simili di colorazione, possono essere posizionati più SFEB sulla stessa vetrata.
7. Aggiungere una goccia di supporto di montaggio sugli SFEB, posizionare una copertura in vetro e premere delicatamente per assicurare che non ci siano bolle d'aria. Lasciare che il supporto di montaggio si indurisca e proceda all'immagine e alla quantificazione (passo 3.8).
   NOTA: dopo che il supporto di fissaggio si indurisce, i SFEB sono pronti per l'imaging.
8. Eseguire la quantificazione delle cellule prendendo più regioni di interesse (ROI) attraverso il SFEB e utilizzando una z-stack combinata con un'immagine di proiezione massima per ogni ROI su un microscopio confocale standard come descritto nei riferimenti ^{1 , 16} .
   NOTA: SFEB interi possono essere quantificati utilizzando piastrelle a base di immagini (vedere i riferimenti ^{1 , 16} per i dettagli). Poiché i SFEB sono sottili a circa 100 μm, c'è una minima dispersione di luce nel tessuto e quindi non c'è bisogno di microscopia a 2 fotoni. Gli usi precedenti di questo protocollo con iPSC derivanti da fibroblasti hanno prodotto una mappa del destino SFEB che ha rivelato una struttura complessa e diversificata con sottopopolazioni di interneuroni con identità trascrizionali che somigliavano a CGE e ai predatori anteriori ^{1 , 16.}

4. Registrazione dell'attività neuronale in SFEB utilizzando MEAs

1. Preparare le piastre MEA a 12 pozzetti secondo le istruzioni del produttore.
2. Lavare le piastre MEA 3 volte per 5 min con H ₂ O sterile in condizioni asettiche da pulire. Lavare per 5 min con etanolo al 75% e poi con 100% etanolo per sterilizzare la piastra.
3. Cuocere la piastra invertita in forno per 4-5 h a 50 ° C per completare il processo di sterilizzazione.
4. Aggiungere a ciascun pozzetto 500 μL di soluzione di polietilenimina (PEI) di 0,2% e incubare per 1 h a temperatura ambiente. Aspirare PEI e lavare i pozzetti 4x con H ₂ O distillato sterile. Asciugare l'aria nel cappuccio durante la notte.
5. Preparare una soluzione di laminina da 20 μL / mL in mezzo L15 e aggiungere 10 μL di laminina al centro di ogni pozzetto.
   NOTA: Non rivestire gli elettrodi di riferimento e di messa a terra circostanti.
6. Aggiungere dH ₂ O sterile ai serbatoi circostanti per evitare l'evaporazione medio o laminina.Incubare la piastra per 1 ora a 37 ° C.
7. Aggiungere le SFEB (vedere paragrafi 1 e 2) alle piastre MEA rivestite con laminina, facendole delicatamente immergetele in una punta della pipetta a larga bocca e trasferirle. Aggiungere a ciascun pozzetto 200 μL di media DM2 e incubare per una notte a 37 ° C, umidità del 95% e 5% CO ₂ .
8. Aggiungere un ulteriore 200 μl di mezzo dopo 24 h e lasciarlo recuperare per 30 minuti a 37 ° C, umidità del 95%, 5% CO ₂ prima di leggere la piastra.
9. Posizionare la piastra MEA nel lettore piastra (preriscaldata a 37 ° C) per registrare l'attività neuronale. Attività di registrazione per 10 minuti con il software di registrazione MEA associato. Vedere il riferimento ¹⁹ per i dettagli.
10. Generare flussi continui e dati ristretti di dati di attività neuronale utilizzando il software di analisi statistica ¹⁹ .
    NOTA: Le registrazioni MEA sono prese 7 giorni dopo la placcatura SFEB. Per questo studio, le registrazioni sono state prese per 10 minuti per rilevare l'attività di rottura della rete, conTracce tinuose e trame raster. Le SFEB possono essere mantenute a lungo termine sulle piastre MEA e possono essere registrate per lunghi periodi di tempo con condizioni ambientali controllate ( Figura 6 ).

Risultati

Le SFEB coltivate usando la nostra tecnica hanno prodotto il tessuto con caratteristiche morfologiche che assomigliano a una zona subventricolare corticale presto sviluppata con lunghi neuroni Tuj1 positivi e progenitori neurali ( Figura 3A ). Numerose rosette corticali sviluppate sono state osservate negli strati esterni e negli strati interni del SFEB ( Figura 3B ). Il bordo esterno del SFEB assomiglia a una piastra corticale ...

Discussione

Il protocollo descritto qui fornisce le condizioni per differenziare una sorgente di hiPSC in una struttura a 3-D che ricapitola una fase iniziale dello sviluppo della corteccia frontale. Questa procedura consente di ottenere strutture che possono essere interrogate per l'elettrofisiologia pur essendo inoltre idonee alla microscopia. La morfologia finale del SFEB è simile a quella delle culture organiche di fetta di cervello e consente un'immagine confocale dettagliata di alta qualità. Questo protocollo può g...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components
STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media)	STEMCELL Technologies	0-5835	250 mL
PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media)	GlobalStem	GSM-2001
Name	Company	Catalog Number	Comments
DM1 Media Components
D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1	Invitrogen	10565018	385 mL
Knockout Serum Replacement	Invitrogen	10828028	20% 100 mL
Pen/Strep	Invitrogen	15140122	5 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid	Invitrogen	11140050	5 mL
2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid	Invitrogen	21985023	900 μL
Name	Company	Catalog Number	Comments
DM2 Media Components
D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1	Invitrogen	10565018	500 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
Pen/Strep	Invitrogen	15140122	5 mL
N-2 Supplement (100x), liquid	Invitrogen	17502048	10 mL
Name	Company	Catalog Number	Comments
DM3 Media Components
NEUROBASAL Medium (1x), liquid	Invitrogen	21103049	500 mL
B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid	Invitrogen	12587010	10 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
Pen/Strep	Invitrogen	15140122	5 mL
Name	Company	Catalog Number	Comments
Small Molecules
Thiazovivin	Stemgent	04-0017	2 μM
SB431542	Stemgent	04-0010-10	1:1,000 (10 μM)
Dorsomorphin	Stemgent	04-0024	1 μM
LDN-193189	Stemgent	04-0074-10	250 nM
Y27632 (ROCKi)	Stemgent	04-0012-10	10 μM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant Protiens
DKK-1	Peprotech	120-30	200 ng/mL
Name	Company	Catalog Number	Comments
Components/Materials
Cell Culture inserts 0.4 μM, 30mm Diameter	Millicell	PICM0RG50
Mouse Embryonic Fibroblasts	GlobalStem	GSC-6301G
96 well V bottom w/Lids	Evergreen	222-8031-01V
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	ThermoFisher	A1110501
TritonX-100	ThermoFisher	85111
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher	10010023	500 mL
Normal Donkey Serum	Jackson Labs	017-000-121
Leibovitz's L-15 Medium	ThermoFisher	11415114	500 mL
DRAQ5 (Nuclear Marker)	ThermoFisher	65-0880-96
MEA Plates	Axion Biosystems	M768-GL1-30Pt200
6 well flat bottom	Falcon	353046
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Nestin	Millipore	MAB5326
Brn-2	Protein tech	14596-1-AP
VGLUT1	Synaptic Systems	135 303
Pax6	abcam	ab5790
Calretinin	abcam	ab702
Calbindin	abcam	ab11426
CoupTFII	R&D Systems	PPH714700
Nkx 2.1	abcam	ab12650
Tuj1	abcam	ab41489
Reelin	Millipore	MAB5364
Tbr1	Millipore	MAB2261
NFH	Dako	M0762