פיתוח HiPSC נגזר סרום חינם גופים embryoid לחקירת 3-D תא תרבויות גזע באמצעות מבחנים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית

Summary

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול לפתח מערכת תלת ממדית (3-D) מתאי גזע של האדם המושרה-פלוריפוטנט (hiPSCs) הנקראת גוף העובר החופשי בסרום (SFEB). מודל זה 3-D ניתן להשתמש כמו תרבות פרוסה organotypic כדי מודל התפתחות קליפת המוח האנושי ועל חקירה פיזיולוגית של פיתוח מעגלים עצביים.

Abstract

למרות שמספר מודלים של מחלות חוץ-גופית פותחו באמצעות hiPSCs, מגבלה אחת היא שמערכות דו-מימדיות אלו (2-D) אינן מייצגות את המורכבות הקיטורית והפונקציונלית הבסיסית של החולים הנגועים הנושאים גרסאות חשודות של המחלה. מודלים 2-D קונבנציונאלי להישאר ייצוגים שלמים במבנים דמויי vivo ואינם ללכוד כראוי את המורכבות של המוח. לכן, יש צורך המתעוררים יותר 3-D מודלים מבוססי hiPSC שיכולים לשחזר טוב יותר את אינטראקציות הסלולר פונקציות לראות במערכת vivo .

כאן אנו מדווחים פרוטוקול לפתח מערכת 3-D מ hiPSCs בלתי מובחנים על בסיס הגוף העובר ללא תמותה (SFEB). מודל תלת-ממדי זה משקף היבטים של ניאוקורטקס מתפתח ומאפשר מחקרים לתפקודים אינטגראליים לתאים עצביים חיים ורקמות שלמות כגון הגירה, קישוריות, תקשורת ומחצלתרוויה. באופן ספציפי, אנו מדגימים כי SFEBs באמצעות פרוטוקול שלנו ניתן לחקור באמצעות מבחני התא רלוונטיות פיזיולוגית גבוהה תוכן מבוסס כגון הדמיה סידן, ומערכות אלקטרודה רב (MEA) הקלטות ללא cryosectioning. במקרה של הקלטות MEA, אנו מראים כי SFEBs להגביר את פעילות ספייק פעילות ברמת הרשת מתפרץ במהלך תרבות לטווח ארוך. פרוטוקול SFEB זה מספק מערכת חזקה וניתנת להרחבה ללימוד פיתוח רשת במודל תלת-ממדי, אשר לוכד היבטים של התפתחות קליפת המוח.

Introduction

יש לנו בעבר דיווחו על מודל 3-D מודל, שנוצר מחולה נגזר האדם המושרה בתאי גזע pluripotent המושרה (hiPSCs) כי recapitulates כמה היבטים של פיתוח רשת קליפתית מוקדם ¹ . זה מודל 3-D, גוף ללא עוברים בסרום (SFEB), משפר על מודלים פשוטים לשעבר hiPSC צבירה ^{2 , 3} . גוף גדל והולך של עבודה הוא חושף כי 3-D מבנים כמו SFEBs שלנו, ההיבטים המקורבים של התפתחות עצביים נפוץ נצפה in vivo ובנקודת זמן מוקדמת יותר מאשר שנצפה 2 מימדי (2-D) / monolayer hiPSC מודלים ^{4 , 5} . מחקרים ראשוניים כבר התמקדו המורכבות של ארגון העצמית של גופי 3-D ללא הוכחת המורכבות ² הפיזיולוגיות שלהם.

הפרוטוקול המתואר כאן נעשה שימוש על hiPSCs מובחנים הנגזרים fibroblasts ו תאי דם מונונוגרעיניים היקפיים (PBMCs). תאים אלה נשמרים על מזוהמים עכבר מזוהמים γ (MEFs). מושבות אלה hiPSC מנוקים באופן ידני של תאים מובחנים ספונטנית, שנקטפו אנזימטית, resuspended בינוני המכיל Rho-Kinase מעכב Y-27632 (ROCKi). Uniferentiated hiPSCs נתונים דיסוציאציה ו צנטריפוגה לפני מועברים 96 נמוך נמוך הידבקות V- צלחות התחתונה. לאחר ציפוי, אינדוקציה עצבית היא יזמה באמצעות עיכוב SMAD כפול (SB431542 ו LDN193189 יחד עם dickkopf 1 (DKK-1)) לנהוג הקדמי חזיתית הקדמית forberrain neuronal- גורל השושלת ⁶ . לאחר 14 ימים, SFEBs מועברים מוסיף תרבות התא בצלחת 6-היטב. לאחר שהועברו, SFEBs עגול מתחילים להתפשט ודק, תוך שמירה על חיבורי הרשת המקומית כפי שנצפה לעתים קרובות בהכנות בהיפוקמפוס organotypic פרוסה תרבות באמצעות הוספת תאים דומים תרבות ^{1 ,}Ss = "xref"> 7.

השימוש SFEB מבוסס 3-D פלטפורמת בפורמט זה מקובל הייצור היעיל של רשתות קליפת המוח, כי ניתן לחקור באמצעות מבחני פיזיולוגיים מבוססי תא כגון הדמיה סידן או מבחני אלקטרופיזי כגון הקלטות תא בודד או רב אלקטרודה מערך (MEA ) ¹ . למרות 3-D מערכות לשאת את סמנים של התפתחות קליפת המוח מוקדם, מחקרים אחרים הראו כי אלה 3-D גופים עשויים לדרוש פעמים הדגירה ארוכה כדי לאפשר את קצב איטי מטבעו של התפתחות רקמת האדם ⁸ . זה פרוטוקול SFEB בהצלחה מייצר 3-D SFEBs מ hiPSCs לא מובחן כי לוכדת היבטים של התפתחות מוקדמת של קליפת המוח.

הפוטנציאל של SFEBs כדי מודל סטיות רשת בהפרעות נוירולוגיות הוא כוח של מערכת זו. את hiPSCs נגזר רקמת החולה ניתן לגדל לתוך התאים של מערכת העצבים כי הם כפופים התחתAys הקשורים לביולוגיה התא, כמו גם ביטוי גנטי במקביל. משתמשים ב- iPSCs כדי לבדוק את הפרופיל הגנטי של קבוצות גדולות של אנשים עם הפרעות נוירולוגיות שונות עם אטיולוגיות מורכבות כגון הפרעת ספקטרום האוטיזם (ASD), סכיזופרניה ⁹ , תסמונת רט, ¹⁰ ואלצהיימר ^{11 , 12} . עד לאחרונה, מודלים iPSC היו בדרך כלל ההכנות monolayer, כי בעוד בקיאים בהערכת אינטראקציות מולקולריות, לא היו מספיק לפענח את האינטראקציות הסלולר המורכב לראות in vivo . מודלים של בעלי חיים היו תחליף ברירת המחדל עבור מחדש את פלטפורמת האיבר כולו. מודלים אלה של בעלי חיים סובלים מתרגום גרוע של הממצאים ויש להם יכולת מוגבלת לשכפל פרופילים גנטיים אנושיים שזוהו על ידי מחקרים גדולים של בדיקות גנטיות. לפיכך, הפיתוח של מערכות תלת ממדיות מ- iPSCs מוסיף שכבה של מורכבות אנושיתדוגמנות ^{13 , 14} . השלב הבא עבור פלטפורמות hiPSC 3D היא להתאים את דרישות בקנה מידה גדול של הקרנה תפוקה גבוהה באמצעות מבחני תאים מבוסס ¹⁵ .

Protocol

1. הדור של תאים עצביים עצביים

1. שמור hiPSCs נגזר fibroblasts ו PBMCs ב 6 גם צלחות על γ- מוקרן העכבר עובריים מזין (MEF) שכבת התא במדיום iPSC האדם בתוספת קטנה מולקולות (ראה את טבלת החומרים).
   הערה: תחזוקה יומית היא גרסה שונה של פרוצדורות שדווחו בעבר ^{, 1 , 16} .
   1. צלחת 6 x 10 ⁵ MEFs על גבי כל היטב של 6-רקמה צלחת כיתה תרבותית 300 בינוני μL / מומלץ גם (להלן פרוטוקול של היצרן).
   2. לאחר 48 שעות, להחליף בינוני MEFs עם 300 μL / מדיום hiPSC היטב עבור 1 שעות לפני הוספת hiPSCs.
   3. להפשיר במהירות hiPSCs אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים לאט להוסיף 1 מ"ל hiPSC dropwise בינוני. מעבירים את hiPSCs בינוני עד צינור חרוטי 15 מ"ל. הוסף בינוני כדי להביא את הנפח הכולל ל 5 מ"ל. צנטריפוגה במשך 4 דקות ב 129 xg, לשאוב את supernataNt, בעדינות מחדש להשעות את גלולה במדיום 1 מ"ל hiPSC עם מעכב ROCK ב 1: 1 ריכוז.
   4. פלייט ההשעיה התא (בדרך כלל seeded ב 300,000 תאים / טוב) על שכבת תא MEF ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ , לחות 95%.
   5. צג תרבות iPSC מקרוב באמצעות מיקרוסקופ אור. לאחר 48 שעות, להסיר תרבויות בעלות קצוות לא אחידים, גדלו להיות כמו סיסטיק או להיראות חום צהבהב תחת מיקרוסקופ אור כדי למזער בידול ספונטני.
      הערה: לאחר 7-10 ימים, מושבות hiPSC צריכות להיווצר. המושבות צריכות להיות עגולות, עם גבולות מוגדרים בבירור וצפיפות תאים אחידה, נטולי תאים לא אחידים רופפים.
   6. באופן ידני לבחור מושבות hiPSC כדי לנקות את התרבות של תאים מובחנים באופן ספונטני. הרחב את המושבות על ידי הצבת אותם על שכבות חדשות MEF. הרחב 1: 3 כל 7 ימים כאשר תרבויות ליד confluency להקפיא ^{1 , 16} .
2. לאחר הרחבת תאי הקפאה (לגיבוי), לגדול מושבות hiPSC על צלחות עד שהם מגיעים 50 - 75% מפגש.
3. שבעה ימים לאחר ציפוי, להשתמש בטיפול אנזימטי קלה (5-10 דקות עם 300 μL 300 של פתרון האנזים) וטחינה דקה עדינה (2-4 פעמים עם 1,000 μL pipet) למסוק ולהכין hiPSCs עבור הבדל תאים עצביים מבשר.
4. צנטריפוגה ההשעיה תא ב XG 129 במשך 4 דקות, לשאוב supernatant, ו resuspend גלולה ב 5 מ"ל iPSC בינוני האדם. מעבירים את ההשעיה תא על 0.1% ג 'לטין מצופה 5 ס"מ צלחת תרבות התא עבור 1 שעה ב 37 ° C לחסל MEFs כדי למקסם את התשואה hiPSC. מעבירים את המדיום (עם תאים שאינם חסיד) כדי עוד 5 ס"מ צלחת מצופה ג 'לטין.
5. מעבירים את התאים שאינם חסיד לצינור צנטריפוגות 15 מ"ל באמצעות טפטפת העברת. בעדינות לשטוף את הצלחות עם בינוני 3 מ"ל ולהוסיף אותו לצינור 15 מ"ל.
6. צנטריפוגה ההשעיה התא 129 xg במשך 4 דקות, לשאוב את סופרNatant, ו resuspend בעדינות גלולה בינוני. קבע את ספירת התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי. פלייט 9,000 תאים / גם צלחת 96-נמוך נמוך V- התחתונה.
7. צנטריפוגה את הצלחת ב XG 163 במשך 3 דקות. לדגור את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס, לחות 95% ו 5% CO ₂ . באמצעות פיפטה, לשנות בינוני 50% מדי יום ביומו על ידי הסרת חצי המדיום והחלפתו עם בינוני טרי מוגדרים כימית בינוני 1 (DM1, איור 1 , טבלה של חומרים) במשך 14 ימים.

2. סרום ללא עוברים גוף Embuction (SFEB) אינדוקציה ( איור 2 )

1. מקום 40 מיקרומטר תא התרבות מוסיף צלחות 6-היטב ולהוסיף בינוני 1 מ"ל DM1 לפחות 1 שעות לפני תוספת של אגרגטים.
2. ביום 14, להעביר את אגרגטים עם בינוני 20 μL באמצעות 200 μL קצה הפה רחב על 40 מיקרומטר תרבית תאים מוסיף ולשנות את המדיום כדי DM2.
   הערה: מוסיף תרבית תאים הם התוספות מיוחדים כי לשבת מעט את החלק התחתון של הבאר מורכב קרום polytetrafluoroethylene תלוי על מסגרת פלסטיק. קרום זה biocompatible והוא יכול ביעילות לחזק את חומרי הזנה וחמצן התחבורה SFEBs, אשר ממוקמים על גבי. הם נפוצים עם תרבויות פרוסות בהיפוקמפוס organotypic נלקח עכבר או חולדה ^{7 , 17 , 18} .
   1. העברת 4-6 אגרגטים לתרבות אחת התא להוסיף ולאפשר מרחב הולם בין אגרגטים. הסר כמו פתרון עודף ככל האפשר באמצעות קצה פיפטה בסדר ( למשל 200 עצה μL).
      הערה: זה מקובל להפריע לזמן קצר SFEB כפי שהם יעברו על תרבית תרבות התא כמו פתרון הוסר סביב SFEBs.
   2. לשמור על תרבויות 1 מ"ל של DM2 ב 37 ° C, לחות 95% ו 5% CO ₂ . באמצעות פיפטה, לשנות 75%מדי יום ביומו על ידי הסרת שלושה רבעים של המדיום והחלפה עם שלושה רבעים בינוני טרי. לדוגמה, להסיר 750 μL של המדיום ולהוסיף 750 μL של המדיום הטרי.
3. לאחר 14 ימים של תרבות, לעבור המדיום DM3 עם 75% בינוני לשנות כל יום אחר במשך 16 ימים נוספים.
4. כדי לשמור על SFEBs על הוספת תרבית תאים מעבר 30 יום, לשנות את המדיום כל יום אחר עבור 60, 90 ו - 120 ימים.
   הערה: SFEBs יגדל ל כ 1000 מיקרומטר בקוטר והם בדרך כלל 100-150 מיקרומטר עבה ¹ .

3. קביעת הרכב SFEB

1. לנתק את SFEBs מן להכניס ידי pipetting בעדינות בינוני באמצעות 200 μL רחב פיפטה קצה פיפטה. כדי להעביר את SFEBs, השתמש קצה פיפטה רחב פה לשאוב בעדינות את הגופים לתוך קצה פיפטה. לאחר טעינת SFEB לתוך קצה פיפטה, בעדינות להעביר צלחות 12 גם ולשטוף עם 300 μL פוספט שנאגרו מלוחים(PBS) לכל טוב.
   הערה: SFEBs יושעה בפתרון 12 צלחות. זה חשוב כדי לאפשר חדירה מלאה של מקבע, פתרון חסימה, ונוגדנים. אם משתמשים SFEBs מרובים עבור מכתים, עד 10 SFEBs ניתן להוסיף היטב של צלחת 12 גם. זה יהיה לשמר פתרונות ונוגדנים.
2. תקן SFEBs עם μL 300 לכל paraformaldehyde טוב 4% בטמפרטורת החדר למשך 30-45 דקות. לשטוף SFEBs קבוע פעמיים עם 300 μL PBS, 3-5 דקות כל לשטוף.
   זהירות: ללבוש ציוד מגן אישי מתאים בעת טיפול paraformaldehyde.
   הערה: בדוק עבור immunoreactivity לסמנים לקבוע בגרות, סוג התא וכו 'לסימון נוירונים במחקר זה עוף-Tuj1 שימש ב 1: 500, עבור סמנים נוספים אנא ראה טבלה 2 והפניות ^{1 , 16} .
3. Permeabilize ולחסום עם 0.1% Triton-X100 ב PBS ו 10% בסרום חמור רגיל (חסימת פתרון; 300 μ, L לכל טוב) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
4. הסר את פתרון חסימת ולטפל SFEBs עם 300 נוגדנים העיקרי μL בפתרון חסימה. לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לשטוף SFEBs שלוש פעמים (3-5 דקות לכל לשטוף) ב 300 μL PBS המכיל 0.1% Triton-X.
5. הכן נוגדנים משני 1: 1000 ב חסימת פתרון. דגירה SFEBs במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר עם נוגדנים משני. לשטוף SFEBs עם 300 μL PBS, 3 פעמים במשך 3-5 דקות כל אחד.
   הערה: בשלב זה SFEBs יכול להיות מוכן הדמיה.
6. כדי תמונה, SFEBs פיפטה על גבי שקופית זכוכית באמצעות פיפטה רחב נשא. הסר פתרון עודף סביב SFEB באמצעות יניקה עדינה.
   הערה: עבור תנאי מכתים דומים, SFEBs מרובים ניתן להציב על שקופית זכוכית זהה.
7. הוסף טיפה של המדיום הרכבה על SFEBs, במקום coverslip זכוכית, ולחץ בעדינות כדי לוודא שאין בועות אוויר. אפשר המדיום גובר להתקדם ולהמשיך הדמיה וכימות (שלב 3.8).
   הערה: לאחר התקשות המדידה, SFEBs מוכנים להדמיה.
8. בצע כימות תאים על ידי לקיחת מספר אזורים של עניין (ROI) על פני SFEB ושימוש z- מחסנית בשילוב עם תמונה היטל מקסימלי דרך החזר על כל ROI על מיקרוסקופ confocal רגיל כמתואר הפניות ^{1 , 16} .
   הערה: כל SFEBs ניתן לכמת באמצעות ריצוף תמונה מבוסס (ראה הפניות ^{1 , 16} לפרטים). מאז SFEBs דק כ 100 מיקרומטר, יש פיזור מינימלי של אור הרקמה ולכן אין צורך במיקרוסקופ 2 פוטון. שימושים קודמים של פרוטוקול זה עם iPSCs נגזר fibroblast הפיק מפת הגורל SFEB כי גילה מבנה מורכב ומגוונים עם subpopulations של interneurons עם זהויות תעתיק הדומה CGE ו קדמי forebrain גורל ^{1 , 16.}

4. הקלטה הפעילות העצבית SFEBs באמצעות MEAs

1. הכן 12-היטב MEA צלחות לפי הוראות היצרן.
2. לשטוף את צלחות MEA 3 פעמים במשך 5 דקות עם סטרילי H ₂ O תחת תנאים aseptic לניקוי. לשטוף במשך 5 דקות עם אתנול 75% ולאחר מכן עם אתנול 100% לעקר את הצלחת.
3. אופים את הצלחת הפוכה בתנור במשך 4-5 שעות ב 50 ° C כדי להשלים את תהליך העיקור.
4. הוסף 500 μL תמיסת polyethyleneimine 0.2% (PEI) כדי היטב כל דגירה 1 שעה בטמפרטורת החדר. לשאוב PEI ולשטוף את הבארות 4x עם סטרילי מזוקק H ₂ O. האוויר יבש במכסה המנוע בן לילה.
5. הכן 20 μL פתרון / מ"ל ​​של laminin במדיום L15 ולהוסיף 10 laminin μL למרכז של כל טוב.
   הערה: אין לכסות את ההתייחסות הסמויה ואת האלקטרודות הארקה.
6. הוסף סטרילי dH ₂ O על המאגרים הסובבים כדי למנוע אידוי בינוני או laminin.דגירה את הצלחת עבור 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס.
7. הוסף SFEBs (ראה סעיפים 1 ו -2) כדי laminin מצופה צלחות MEA ידי יניקה בעדינות אותם לתוך קצה פיפטה פה רחב ולהעביר אותם. הוסף 200 מדיום DM2 μL היטב כל דגירה לילה ב 37 ° C, לחות 95% ו 5% CO ₂ .
8. הוסף בינוני 200 μL נוסף לאחר 24 שעות ולאפשר לו להתאושש במשך 30 דקות ב 37 ° C, לחות 95%, 5% CO ₂ לפני קריאת הצלחת.
9. מניחים את הצלחת MEA בקורא צלחת (שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס) כדי להקליט פעילות העצבית. פעילות שיא במשך 10 דקות עם תוכנת הקלטה MEA הקשורים. למידע נוסף, עיין בסעיף ¹⁹ .
10. יצירת נתונים גולמיים רציף זרמים מגרשים סריקה של הפעילות העצבית באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי ¹⁹ .
    הערה: הקלטות MEA נלקחים 7 ימים לכתוב SFEB ציפוי. עבור מחקר זה, הקלטות נלקחו במשך 10 דקות כדי לזהות פעילות פרץ ברשת, conעקבות רזה, מגרשים רסטר. SFEBs ניתן להישמר לטווח ארוך על לוחות MEA והוא יכול להיות מוקלט על פני תקופות זמן ארוכות יותר באמצעות תנאים בשליטה סביבתית ( איור 6 ).

תוצאות

SFEBs גדל באמצעות הטכניקה שלנו הניב רקמה עם מאפיינים מורפולוגיים הדומים לאזור תת קליפת המוח המוקדם קליפת המוח גדוש נוירונים חיוביים Tuj1 חיובי, כמו גם אבות עצביים ( איור 3 א ). רבים פיתחו שושנות קליפת המוח נצפו השכבות החיצוניות השכבות הפנ?...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מספק את התנאים להבדיל מקור hiPSC לתוך מבנה 3-D כי recapitulates בשלב התפתחותי מוקדם של קליפת המוח הקדמית. הליך זה מניב מבנים שניתן לחקור עבור electrophysiology בעת גם להיות מקובל למיקרוסקופ. מורפולוגיה הסופי של SFEB דומה לזו של תרבויות פרוסות המוח organotypic ומאפשר הדמיה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components
STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media)	STEMCELL Technologies	0-5835	250 mL
PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media)	GlobalStem	GSM-2001
Name	Company	Catalog Number	Comments
DM1 Media Components
D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1	Invitrogen	10565018	385 mL
Knockout Serum Replacement	Invitrogen	10828028	20% 100 mL
Pen/Strep	Invitrogen	15140122	5 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid	Invitrogen	11140050	5 mL
2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid	Invitrogen	21985023	900 μL
Name	Company	Catalog Number	Comments
DM2 Media Components
D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1	Invitrogen	10565018	500 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
Pen/Strep	Invitrogen	15140122	5 mL
N-2 Supplement (100x), liquid	Invitrogen	17502048	10 mL
Name	Company	Catalog Number	Comments
DM3 Media Components
NEUROBASAL Medium (1x), liquid	Invitrogen	21103049	500 mL
B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid	Invitrogen	12587010	10 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
Pen/Strep	Invitrogen	15140122	5 mL
Name	Company	Catalog Number	Comments
Small Molecules
Thiazovivin	Stemgent	04-0017	2 μM
SB431542	Stemgent	04-0010-10	1:1,000 (10 μM)
Dorsomorphin	Stemgent	04-0024	1 μM
LDN-193189	Stemgent	04-0074-10	250 nM
Y27632 (ROCKi)	Stemgent	04-0012-10	10 μM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant Protiens
DKK-1	Peprotech	120-30	200 ng/mL
Name	Company	Catalog Number	Comments
Components/Materials
Cell Culture inserts 0.4 μM, 30mm Diameter	Millicell	PICM0RG50
Mouse Embryonic Fibroblasts	GlobalStem	GSC-6301G
96 well V bottom w/Lids	Evergreen	222-8031-01V
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	ThermoFisher	A1110501
TritonX-100	ThermoFisher	85111
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher	10010023	500 mL
Normal Donkey Serum	Jackson Labs	017-000-121
Leibovitz's L-15 Medium	ThermoFisher	11415114	500 mL
DRAQ5 (Nuclear Marker)	ThermoFisher	65-0880-96
MEA Plates	Axion Biosystems	M768-GL1-30Pt200
6 well flat bottom	Falcon	353046
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Nestin	Millipore	MAB5326
Brn-2	Protein tech	14596-1-AP
VGLUT1	Synaptic Systems	135 303
Pax6	abcam	ab5790
Calretinin	abcam	ab702
Calbindin	abcam	ab11426
CoupTFII	R&D Systems	PPH714700
Nkx 2.1	abcam	ab12650
Tuj1	abcam	ab41489
Reelin	Millipore	MAB5364
Tbr1	Millipore	MAB2261
NFH	Dako	M0762