Desenvolvimento de corpos de embrióide livres de soro derivado de HiPSC para a interrogação de culturas de células estaminais 3-D usando ensaios relevantes para o fisiologismo

Resumo

Aqui, relatamos um protocolo para desenvolver um sistema tridimensional (3-D) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) chamado corpo embrionóide sem soro (SFEB). Este modelo 3-D pode ser usado como uma cultura de fatia organotípica para modelar o desenvolvimento cortical humano e para a interrogação fisiológica do desenvolvimento de circuitos neurais.

Resumo

Embora uma série de modelos de doenças in vitro tenham sido desenvolvidos usando o HiPSCs, uma limitação é que esses sistemas bidimensionais (2-D) podem não representar a complexidade subjacente citocárdica e funcional dos indivíduos afetados portadores de variantes de doença suspeitas. Os modelos 2-D convencionais permanecem representações incompletas de estruturas semelhantes a in vivo e não capturam adequadamente a complexidade do cérebro. Assim, há uma necessidade emergente de mais modelos baseados em HiPSC 3-D, que podem melhor recapitular as interações e funções celulares observadas em um sistema in vivo .

Aqui, relatamos um protocolo para desenvolver um sistema 3-D a partir de hiPSCs indiferenciados com base no corpo embrionóide sem soro (SFEB). Este modelo 3-D espelha aspectos de um neocórtex ventralizado em desenvolvimento e permite estudos sobre funções integrantes de células neurais vivas e tecido intacto, como migração, conectividade, comunicação e tapeteUração. Especificamente, demonstramos que os SFEBs que usam nosso protocolo podem ser interrogados usando ensaios baseados em células fisiologicamente relevantes e de alto conteúdo, tais como imagens de cálcio e gravações de matrizes múltiplas (MEA) sem criosecção. No caso das gravações MEA, demonstramos que os SFEBs aumentam tanto a atividade do ponto como a atividade de explosão no nível da rede durante o cultivo a longo prazo. Este protocolo SFEB fornece um sistema robusto e escalável para o estudo do desenvolvimento da formação da rede em um modelo 3-D que captura aspectos do desenvolvimento cortical inicial.

Introdução

Já relatamos um sistema modelo 3-D, gerado a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs), que recapitulam alguns aspectos do desenvolvimento inicial da rede cortical ¹ . Este modelo 3-D, um corpo embrionário isento de soro (SFEB), melhora os modelos ^{2 , 3 de} agregação simples anteriores de agregação. Um corpo crescente de trabalho revela que estruturas tridimensionais, como nossas SFEBs, aspectos aproximados do desenvolvimento neural comumente observados in vivo e em um ponto de tempo anterior ao observado nos modelos hipsc 2-dimensional (2-D) / monocamada ^{4 , 5} . Os estudos iniciais têm sido focados na complexidade auto-organizada dos corpos 3-D sem demonstrar sua complexidade fisiológica ² .

O protocolo descrito aqui foi usado em hiPSCs indiferenciados derivados de fibroblastos e Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs). Essas células são mantidas em alimentadores embrionários de ratos irradiados com γ (MEFs). Estas colônias HiPSC são limpas manualmente de células diferenciadas espontaneamente, colhidas enzimaticamente e ressuspensas em meio contendo inibidor de Rho-quinases Y-27632 (ROCKi). HiPSCs indiferenciados são submetidos à dissociação e centrifugação antes de serem transferidos para placas de 96 poços de baixa aderência em V. Após o chapeamento, a indução neural é iniciada usando a inibição dupla de SMAD (SB431542 e LDN193189, juntamente com dickkopf 1 (DKK-1)) para direcionar uma linhagem do farol neurônio anterior-frontal do prosencéfalo ⁶ . Após 14 dias, os SFEBs são transferidos para inserções de cultura de células em uma placa de 6 poços. Uma vez transferidos, os SFEB redondos começam a se espalhar e fino, mantendo conexões de rede locais, como é freqüentemente observado em preparações de cultura de fatia organotípicas do hipocampo usando inserções similares de cultura celular ^{1 ,}Ss = "xref"> 7.

O uso de uma plataforma 3-D baseada em SFEB neste formato é passível de produção eficiente de redes corticais que podem ser interrogadas usando ensaios fisiológicos baseados em células, tais como imagens de cálcio ou ensaios eletrofisiológicos, como gravações de células únicas ou matrizes de vários eletrodos (MEA ) ¹ . Embora os sistemas 3-D tenham marcadores do desenvolvimento cortical precoce, outros estudos mostraram que esses corpos 3-D podem exigir tempos de incubação mais longos para permitir o ritmo inerentemente mais lento do desenvolvimento de tecido humano ⁸ . Este protocolo SFEB gera com sucesso 3-D SFEBs de hiPSCs indiferenciados que captura aspectos do desenvolvimento inicial do córtex.

O potencial de SFEBs para modelar aberrações de rede em distúrbios neurológicos é uma força desse sistema. Os hiPSCs derivados do tecido do paciente podem ser cultivados em células do sistema nervoso que estão sujeitas a bundaSão relacionados à biologia celular, bem como a expressão de genes concomitantes. IPSCs humanos estão a ser usada para determinar o perfil genético de grandes grupos de indivíduos com diferentes distúrbios neurológicos com etiologias complexas, tais como a desordem do espectro do autismo (ASD), esquizofrenia ^9, síndrome de Rett ^10, e doença de Alzheimer ^{11, 12.} Até recentemente, os modelos iPSC eram tipicamente preparações monocamadas que, embora proficientes na avaliação de interações moleculares, eram inadequadas na decifração das interações celulares complexas vistas in vivo . Os modelos de animais têm sido o substituto padrão para recriar a plataforma do órgão inteiro. Esses modelos animais estão atormentados pela má tradução de achados e têm capacidade limitada para replicar perfis genéticos humanos identificados por grandes estudos de triagem genética. Assim, o desenvolvimento de sistemas 3-D de iPSCs adiciona uma camada necessária de complexidade em humanosModelagem da doença ^{13 , 14} . O próximo passo para as plataformas 3D HiPSC é acomodar os requisitos de grande escala de rastreio de alto rendimento usando ensaios baseados em células ¹⁵ .

Protocolo

1. Geração de células progenitoras neuronais

1. Manter o HiPSCs derivados de fibroblastos e PBMCs em placas de 6 poços em uma camada celular de alimentador embrionário de mouse irradiado (MEF) em meio iPSC humano suplementado com pequenas moléculas (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: A manutenção diária é uma versão modificada dos procedimentos relatados anteriormente ^{1 , 16} .
   1. Placa 6 x 10 ⁵ MEFs em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 6 poços em 300 μL / meio recomendado para recomendação (seguindo o protocolo do fabricante).
   2. Após 48 h, substitua o meio MEF com 300 μL / poço de meio hiPSC durante 1 h antes de adicionar oiPSCs.
   3. Descongelar rapidamente o HiPSCs em um banho-maria a 37 ° C e adicionar lentamente 1 mL de meio hiPSC gota a gota. Transfira o hiPSCs e o tubo cônico médio para 15 mL. Adicione o meio para aumentar o volume total para 5 mL. Centrífuga por 4 min a 129 xg, aspira a supernataNt, recoloque suavemente o sedimento em 1 ml de meio HiPSC com inibidor de ROCK a uma concentração de 1: 1000.
   4. Placa a suspensão celular (tipicamente semeada a 300 000 células / poço) na camada de células MEF e incube a 37 ° C, 5% de CO ₂ , 95% de umidade.
   5. Monitore a cultura iPSC de perto usando um microscópio de luz. Após 48 h, remova culturas com bordas irregulares, cresceu para se tornar cística ou pareça marrom-amarelada sob o microscópio de luz para minimizar a diferenciação espontânea.
      NOTA: Após 7 a 10 dias, as colônias do hiPSC devem se formar. As colônias devem ser redondas, com bordas claramente definidas e densidades celulares uniformes, e desprovidas de células não uniformes compactas.
   6. Selecione manualmente as colônias rondas do hiPSC para limpar a cultura de células diferenciadas espontaneamente. Expanda as colônias colocando-as em camadas MEF frescas. Expandir 1: 3 a cada 7 dias quando culturas próximas da confluência e congelar ^{1 , 16} .
2. Após células de expansão e congelamento (para backup), crie colônias de hiPSC em placas até chegarem a 50 a 75% de confluência.
3. Pós-revestimento de sete dias, uso de tratamento enzimático leve (5-10 min com 300 μL de solução enzimática) e trituração suave (2-4 vezes com uma pipeta de 1.000 μL) para colher e preparar HiPSCs para a diferenciação de células precursoras neurais.
4. Centrifugar a suspensão celular a 129 xg durante 4 minutos, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 ml de meio iPSC humano. Transfira a suspensão celular para uma placa de cultura de células de 5 cm revestida com gelatina a 0,1% durante 1 h a 37 ° C para eliminar MEFs e para maximizar o rendimento hiPSC. Transfira o meio (com células não aderentes) para outro prato revestido com gelatina de 5 cm.
5. Transfira as células não aderentes para um tubo de centrífuga de 15 mL usando uma pipeta de transferência. Lavar suavemente os pratos com 3 mL de meio e adicioná-lo ao tubo de 15 mL.
6. Centrifugue a suspensão celular a 129 xg por 4 min, aspirar o superNaturalmente e ressuspenda gentilmente a pelota em meio. Determine a contagem de células usando um contador de células automatizado. Placa 9.000 células / poço em uma placa de 96 poços de baixa aderência em V.
7. Centrifugue a placa a 163 xg por 3 min. Incube a placa a 37 ° C, 95% de umidade e 5% de CO ₂ . Usando uma pipeta, mude 50% de média a cada dois dias, removendo metade do meio e substituindo-o por meio de diferenciação 1 (DM1, Figura 1 , Tabela de Materiais), quimicamente definido, durante 14 dias.

2. Indução do corpo embrionário livre de soro (SFEB) ( Figura 2 )

1. Coloque inserções de cultura celular de 40 μm em placas de 6 poços e adicione 1 mL de meio DM1 pelo menos 1 h antes da adição de agregados.
2. No dia 14, transfira os agregados com 20 μL de meio usando uma ponta de boca de 200 μL de largura para inserções de cultura celular de 40 μm e mude o meio para DM2.
   NOTA: As inserções de cultura de células são inserções especializadas que se sentam levemente no fundo do poço e consistem em uma membrana de politetrafluoroetileno suspensa em uma armação de plástico. Esta membrana é biocompatível e pode sustentar eficientemente o transporte de nutrientes e oxigênio para os SFEBs, que são colocados no topo. Eles são comumente usados ​​com culturas organotipicas em fatia de hipocampo retiradas de ratos ou ratos ^{7 , 17 , 18} .
   1. Transfira 4-6 agregados para uma inserção de cultura celular e permita um espaço adequado entre os agregados. Remova o excesso de solução possível com uma ponta fina de pipeta ( por exemplo, dica de 200 μL).
      NOTA: É aceitável perturbar brevemente o SFEB à medida que eles se moverão na inserção de cultura celular como a solução removida em torno dos SFEBs.
   2. Manter as culturas em 1 mL de DM2 a 37 ° C, 95% de umidade e 5% de CO ₂ . Usando uma pipeta, mude 75%Médio todos os dias, removendo três quartos do meio e substituindo por três quartos de meio fresco. Por exemplo, remova 750 μL de meio e adicione 750 μL de meio fresco.
3. Após 14 dias de cultura, mude para o meio DM3 com 75% de mudança média a cada dois dias e por mais 16 dias.
4. Para manter os SFEBs em inserções de cultura de células além de 30 dias, altere a média todos os dias durante 60, 90 e 120 dias.
   NOTA: Os SFEBs crescerão para cerca de 1.000 μm de diâmetro e são tipicamente de 100-150 μm de espessura ¹ .

3. Determinando a Composição do SFEB

1. Destaque os SFEBs da inserção por meio de pipetagem suave usando uma ponta de pipeta de boca de 200 μL. Para transferir os SFEBs, use uma ponta de pipeta de boca larga para succionar suavemente os corpos na ponta da pipeta. Depois de carregar o SFEB na ponta da pipeta, transferir suavemente para placas de 12 poços e lavar com 300 μL de solução salina tamponada com fosfato(PBS) por poço.
   NOTA: Os SFEBs serão suspensos em solução nas placas de 12 poços. Isto é importante para permitir a penetração total do fixador, a solução de bloqueio e os anticorpos. Se estiver usando vários SFEBs para coloração, podem ser adicionados até 10 SFEB por poço de uma placa de 12 poços. Isso irá economizar soluções e anticorpos.
2. Fixar SFEB com 300 μL por poço 4% de paraformaldeído à temperatura ambiente durante 30-45 min. Lave os SFEB fixos duas vezes com 300 μL de PBS, 3-5 min cada lavagem.
   Cuidado: Usar equipamento de proteção pessoal adequado ao manusear paraformaldeído.
   NOTA: Sonda para imunorreatividade para marcadores para determinar a maturidade, tipo de célula, etc. Para marcar os neurônios neste estudo, o frango-Tuj1 foi utilizado em 1: 500, para marcadores adicionais, ver Tabela 2 e referências ^{1 , 16} .
3. Permeabilize e bloqueie com 0,1% de Triton-X100 em PBS e 10% de soro de burro normal (solução de bloqueio, 300 μ; L por poço) durante 1 h à temperatura ambiente.
4. Remova a solução de bloqueio e trate SFEBs com 300 μL de anticorpos primários em solução de bloqueio. Incubar a 4 ° C durante a noite. Lavar SFEBs três vezes (3-5 min por lavagem) em 300 μL de PBS contendo 0,1% de Triton-X.
5. Preparar anticorpos secundários 1: 1000 em solução de bloqueio. Incubar SFEB durante 1 h à temperatura ambiente com anticorpos secundários. Lavar SFEBs com 300 μL de PBS, 3 vezes por 3-5 min cada.
   NOTA: Nesta fase, os SFEB podem ser preparados para imagens.
6. Para imagem, pipette SFEBs em um slide de vidro usando uma pipeta de diâmetro largo. Remova o excesso de solução em torno do SFEB usando sucção suave.
   NOTA: Para condições de coloração semelhantes, vários SFEBs podem ser colocados no mesmo slide de vidro.
7. Adicione uma gota de meio de montagem nos SFEBs, coloque uma lamínula de vidro e pressione suavemente para garantir que não haja bolhas de ar. Permitir que o meio de montagem se endureça e proceda à imagem e quantificação (passo 3.8).
   NOTA: Após o tamanho de montagem endurecer, os SFEB estão prontos para imagens.
8. Execute a quantificação celular tomando múltiplas regiões de interesse (ROI) em todo o SFEB e usando uma pilha z combinada com uma imagem de projeção máxima através de cada ROI em um microscópio confocal padrão conforme descrito nas referências ^{1 , 16} .
   NOTA: SFEBs inteiros podem ser quantificados usando telhas baseadas em imagens (veja referências ^{1 , 16} para detalhes). Uma vez que os SFEBs são finos para aproximadamente 100 μm, há uma dispersão mínima de luz no tecido e, portanto, não há necessidade de microscopia de 2 fótons. Os usos anteriores deste protocolo com iPSCs derivados de fibroblastos produziram um mapa de destino SFEB que revelou estrutura complexa e diversa com subpopulações de interneurônios com identidades transcricionais que se assemelhavam ao CGE e ao passado do prosencéfalo anterior ^{1 , 16.}

4. Gravação da atividade neuronal nos SFEBs usando MEAs

1. Prepare placas de MEA de 12 poços de acordo com as instruções do fabricante.
2. Lave as placas MEA 3 vezes durante 5 min com H ₂ O estéril em condições assépticas para limpar. Lavar durante 5 min com 75% de etanol e depois com 100% de etanol para esterilizar a placa.
3. Asse o prato invertido num forno por 4-5 h a 50 ° C para completar o processo de esterilização.
4. Adicione 500 μL de solução de polietilenoimina a 0,2% (PEI) a cada poço e incuba 1 h à temperatura ambiente. Aspirar PEI e lavar os poços 4x com H _{2 O} destilado estéril. Ar seco no capô durante a noite.
5. Prepare uma solução de laminina de 20 μL / mL em meio L15 e adicione 10 μL de laminina ao centro de cada poço.
   NOTA: Não cubra os eletrodos de referência e de aterramento circundantes.
6. Adicione dH ₂ O esterilizado aos reservatórios circundantes para evitar a evaporação média ou laminina.Incubar a placa durante 1 h a 37 ° C.
7. Adicione SFEBs (veja as seções 1 e 2) às placas MEA revestidas com laminina, suavizando-as suavemente até uma ponta de pipeta de boca larga e transfira-os. Adicione 200 μL de meio DM2 a cada poço e incube durante a noite a 37 ° C, 95% de umidade e 5% de CO ₂ .
8. Adicione mais 200 μl de meio após 24 h e permita que ele se recupere durante 30 min a 37 ° C, 95% de umidade, 5% de CO ₂ antes de ler a placa.
9. Coloque a placa MEA no leitor de placas (pré-aquecido a 37 ° C) para registrar a atividade neuronal. Registre a atividade por 10 minutos com o software de gravação MEA associado. Consulte a referência ¹⁹ para obter detalhes.
10. Gerar dados brutos - fluxos contínuos e tramas raster da atividade neuronal usando o software de análise estatística ¹⁹ .
    NOTA: as gravações MEA são tomadas 7 dias após a colocação do SFEB. Para este estudo, as gravações foram realizadas por 10 min para detectar a atividade de explosão da rede, conRastro contínuo e tramas rásticas. Os SFEB podem ser mantidos a longo prazo em placas de MEA e podem ser gravados por longos períodos de tempo usando condições ambientalmente controladas ( Figura 6 ).

Resultados

Os SFEB crescidos usando nossa técnica produziram tecido com características morfológicas que se assemelham a uma zona subventricular cortical desenvolvida inicialmente repleta de extensos neurônios Tuj1-positivos, bem como progenitores neurais ( Figura 3A ). Numerosas rosetas corticais em desenvolvimento foram observadas nas camadas externas e camadas internas do SFEB ( Figura 3B ). A borda externa do SFEB se assemelha a um...

Discussão

O protocolo descrito aqui fornece as condições para diferenciar uma fonte hiPSC em uma estrutura 3-D que recapitula um estágio inicial de desenvolvimento do córtex frontal. Este procedimento produz estruturas que podem ser interrogadas para eletrofisiologia, ao mesmo tempo que são passíveis de microscopia. A morfologia final do SFEB se assemelha à das culturas de fatia de cérebro organotípica e permite uma imagem confocal detalhada de alta qualidade. Este protocolo pode gerar com sucesso SFEBs de ambos os hiPSC...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components
STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media)	STEMCELL Technologies	0-5835	250 mL
PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media)	GlobalStem	GSM-2001
Name	Company	Catalog Number	Comments
DM1 Media Components
D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1	Invitrogen	10565018	385 mL
Knockout Serum Replacement	Invitrogen	10828028	20% 100 mL
Pen/Strep	Invitrogen	15140122	5 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid	Invitrogen	11140050	5 mL
2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid	Invitrogen	21985023	900 μL
Name	Company	Catalog Number	Comments
DM2 Media Components
D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1	Invitrogen	10565018	500 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
Pen/Strep	Invitrogen	15140122	5 mL
N-2 Supplement (100x), liquid	Invitrogen	17502048	10 mL
Name	Company	Catalog Number	Comments
DM3 Media Components
NEUROBASAL Medium (1x), liquid	Invitrogen	21103049	500 mL
B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid	Invitrogen	12587010	10 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
Pen/Strep	Invitrogen	15140122	5 mL
Name	Company	Catalog Number	Comments
Small Molecules
Thiazovivin	Stemgent	04-0017	2 μM
SB431542	Stemgent	04-0010-10	1:1,000 (10 μM)
Dorsomorphin	Stemgent	04-0024	1 μM
LDN-193189	Stemgent	04-0074-10	250 nM
Y27632 (ROCKi)	Stemgent	04-0012-10	10 μM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant Protiens
DKK-1	Peprotech	120-30	200 ng/mL
Name	Company	Catalog Number	Comments
Components/Materials
Cell Culture inserts 0.4 μM, 30mm Diameter	Millicell	PICM0RG50
Mouse Embryonic Fibroblasts	GlobalStem	GSC-6301G
96 well V bottom w/Lids	Evergreen	222-8031-01V
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	ThermoFisher	A1110501
TritonX-100	ThermoFisher	85111
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher	10010023	500 mL
Normal Donkey Serum	Jackson Labs	017-000-121
Leibovitz's L-15 Medium	ThermoFisher	11415114	500 mL
DRAQ5 (Nuclear Marker)	ThermoFisher	65-0880-96
MEA Plates	Axion Biosystems	M768-GL1-30Pt200
6 well flat bottom	Falcon	353046
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Nestin	Millipore	MAB5326
Brn-2	Protein tech	14596-1-AP
VGLUT1	Synaptic Systems	135 303
Pax6	abcam	ab5790
Calretinin	abcam	ab702
Calbindin	abcam	ab11426
CoupTFII	R&D Systems	PPH714700
Nkx 2.1	abcam	ab12650
Tuj1	abcam	ab41489
Reelin	Millipore	MAB5364
Tbr1	Millipore	MAB2261
NFH	Dako	M0762