Desarrollo de cuerpos embrionarios libres de suero derivados de HiPSC para la interrogación de cultivos de células madre tridimensionales usando ensayos fisiológicamente relevantes

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para desarrollar un sistema tridimensional (3-D) de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (HiPSCs) llamado cuerpo embrioide libre de suero (SFEB). Este modelo tridimensional puede ser utilizado como un cultivo de corte organotípico para modelar el desarrollo cortical humano y para la interrogación fisiológica del desarrollo de circuitos neuronales.

Resumen

Aunque una serie de modelos de enfermedades in vitro se han desarrollado utilizando hiPSCs, una limitación es que estos sistemas bidimensionales (2-D) pueden no representar la subyacente cytoarchitectural y complejidad funcional de los individuos afectados portadores de las variantes de enfermedad sospechosos. Modelos convencionales 2-D siguen siendo incompletas representaciones de in vivo- como las estructuras y no captar adecuadamente la complejidad del cerebro. Por lo tanto, hay una necesidad emergente de más modelos basados ​​en HiPSC 3-D que puedan recapitular mejor las interacciones y funciones celulares vistas en un sistema in vivo .

Aquí presentamos un protocolo para desarrollar un sistema 3-D de hiPSC indiferenciados basados ​​en el cuerpo embrioide libre de suero (SFEB). Este modelo tridimensional refleja aspectos de un neocórtex ventralizado en desarrollo y permite estudiar las funciones integrales de las células neurales vivas y el tejido intacto tales como la migración, la conectividad, la comunicación y la alfombraCión. Específicamente, demostramos que los SFEBs que usan nuestro protocolo pueden ser interrogados utilizando ensayos basados ​​en células fisiológicamente relevantes y de alto contenido como imágenes de calcio y registros de múltiples electrodos (MEA) sin criosección. En el caso de las grabaciones de MEA, demostramos que los SFEBs aumentan tanto la actividad de pico como la actividad de ruptura a nivel de la red durante el cultivo a largo plazo. Este protocolo SFEB proporciona un sistema robusto y escalable para el estudio del desarrollo de la formación de redes en un modelo tridimensional que captura aspectos del desarrollo cortical temprano.

Introducción

Hemos informado anteriormente de un sistema modelo 3D, generado a partir de pacientes derivados de las células madre pluripotentes inducidas por humanos (HiPSCs) que recapitula algunos aspectos de la primera red cortical desarrollo ¹ . Este modelo tridimensional, un cuerpo embrionario libre de suero (SFEB), mejora los modelos hiPSC anteriores de agregación simple ^{2 , 3} . Un creciente cuerpo de trabajo está revelando que las estructuras tridimensionales como nuestro SFEBs, los aspectos aproximados de desarrollo neural comúnmente observados in vivo y en un momento anterior de lo observado en 2-dimensional (2-D) / monolayer hiPSC modelos [ ^{4 , 5]} . Los estudios iniciales se han centrado en la complejidad autoorganizada de los cuerpos tridimensionales sin demostrar su complejidad fisiológica ² .

El protocolo descrito aquí se ha utilizado en los hiPSC indiferenciados derivados de fibroblastos y Células mononucleares de sangre periférica (PBMCs). Estas células se mantienen en alimentadores embrionarios de ratón irradiados con γ (MEFs). Estas colonias hiPSC se limpian manualmente de células espontáneamente diferenciadas, se cosechan enzimáticamente y se resuspenden en medio que contiene el inhibidor de la Rho-quinasa Y-27632 (ROCKi). Los hiPSC indiferenciados se someten a disociación y centrifugación antes de ser transferidos a placas de fondo en V de baja adherencia de 96 pocillos. Después de la galjanoplastia, la inducción neural se inicia usando la inhibición SMAD dual (SB431542 y LDN193189 junto con dickkopf 1 (DKK-1)) para conducir un linaje neuronal-fado forebrain anterior-frontal ⁶ . Después de 14 días, los SFEB se transfieren a insertos de cultivo celular en una placa de 6 pocillos. Una vez transferidos, los SFEBs redondos comienzan a esparcirse y adelgazarse, manteniendo al mismo tiempo conexiones de red local como se observa a menudo en preparaciones de cultivo de corte organotípico del hipocampo usando insertos de cultivo de células similares ^{1 ,}Ss = "xref"> 7.

El uso de una plataforma tridimensional basada en SFEB en este formato es susceptible a la producción eficiente de redes corticales que pueden ser interrogadas usando ensayos fisiológicos basados ​​en células tales como imágenes de calcio o ensayos electrofisiológicos tales como grabaciones de célula única o matriz de múltiples electrodos (MEA ) ¹ . Aunque los sistemas tridimensionales llevan los marcadores de desarrollo cortical temprano, otros estudios han demostrado que estos cuerpos 3-D pueden requerir tiempos de incubación más largos para permitir el ritmo inherentemente más lento de desarrollo de tejidos humanos ⁸ . Este protocolo SFEB genera con éxito los SFEB 3-D de los hiPSC indiferenciados que capturan aspectos del desarrollo temprano de la corteza.

El potencial de los SFEBs para modelar aberraciones de red en trastornos neurológicos es una fuerza de este sistema. Los hiPSCs derivados del tejido del paciente pueden crecer en células del sistema nervioso que están sujetas a culoAys relacionados con la biología celular, así como la expresión génica concomitante. Las iPSC humanas se utilizan para determinar el perfil genético de grandes grupos de individuos con diferentes trastornos neurológicos con etiologías complejas como el trastorno del espectro autista (TEA), la esquizofrenia ⁹ , el síndrome de Rett ¹⁰ y la enfermedad de Alzheimer ^{11 , 12} . Hasta hace poco, los modelos iPSC eran típicamente preparaciones monocapa que, aunque eran competentes en la evaluación de interacciones moleculares, eran inadecuadas para descifrar las interacciones celulares complejas vistas in vivo . Los modelos animales han sido el sustituto por defecto para recrear la plataforma de órgano entero. Estos modelos animales están plagados de mala traducción de los hallazgos y tienen una capacidad limitada para replicar los perfiles genéticos humanos identificados por grandes estudios de cribado genético. Por lo tanto, el desarrollo de sistemas 3-D de iPSCs añade una capa necesaria de complejidad en humanosModelación de enfermedades ^{13 , 14} . El siguiente paso para las plataformas 3D hiPSC es acomodar los requerimientos a gran escala de la detección de alto rendimiento mediante ensayos basados ​​en células ¹⁵ .

Protocolo

1. Generación de células progenitoras neurales

1. Mantener los hiPSCs derivados de fibroblastos y PBMCs en placas de 6 pocillos en una capa celular de alimentador embrionario de ratón (MEF) irradiada con γ en medio iPSC humano suplementado con moléculas pequeñas (véase la Tabla de Materiales).
   NOTA: El mantenimiento diario es una versión modificada de los procedimientos anteriores ^{1 , 16} .
   1. Placa 6 x 10 ⁵ MEFs en cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 6 pocillos en un medio recomendado de 300 μl / pocillo (siguiendo el protocolo del fabricante).
   2. Después de 48 h, sustituir MEFs medio con 300 μ l / well hiPSC medio durante 1 h antes de añadir hiPSCs.
   3. Destilar rápidamente los hiPSCs en un baño de agua a 37 ° C y añadir lentamente 1 ml de medio hiPSC gota a gota. Transfiera los hiPSCs y el medio a un tubo cónico de 15 mL. Añadir medio para llevar el volumen total a 5 ml. Centrifugar durante 4 min a 129 xg, aspirar la supernataNt, vuelva a suspender suavemente el gránulo en 1 mL de medio hiPSC con inhibidor de ROCK a una concentración de 1: 1.000.
   4. Se plancha la suspensión celular (típicamente sembrada a 300.000 células / pocillo) sobre la capa celular MEF e incuba a 37ºC, 5% CO ₂ , 95% de humedad.
   5. Monitoree la cultura del iPSC de cerca usando un microscopio de luz. Después de 48 h, eliminar los cultivos que tienen bordes irregulares, han crecido hasta convertirse en quística-like o aparecen marrón amarillento bajo el microscopio de luz para minimizar la diferenciación espontánea.
      NOTA: Después de 7 a 10 días, las colonias hiPSC deben formarse. Las colonias deben ser redondas, con bordes claramente definidos y densidades celulares uniformes, y carentes de células no uniformes unidas flojamente.
   6. Seleccionar manualmente las colonias rondas hiPSC para eliminar el cultivo de células diferenciadas espontáneamente. Expanda las colonias colocándolas en capas MEF frescas. Expandir 1: 3 cada 7 días cuando culturas cerca confluencia y congelación ^{1 , 16} .
2. Después de la expansión y congelación de las células (para la copia de seguridad), crecer las colonias hiPSC en las placas hasta llegar a 50 - 75% de confluencia.
3. Siete días después de la aplicación, utilizar un tratamiento enzimático suave (5-10 minutos con 300 μl de solución enzimática) y una trituración suave (2-4 veces con una pipeta de 1000 μl) para cosechar y preparar hiPSCs para la diferenciación neuronal de células precursoras.
4. Centrifugar la suspensión celular a 129 xg durante 4 min, aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 5 mL de medio iPSC humano. Transferir la suspensión celular a un plato de cultivo celular de 5 cm de gelatina revestida al 0,1% durante 1 h a 37ºC para eliminar los MEF y maximizar el rendimiento de hiPSC. Transferir el medio (con células no adherentes) a otro plato recubierto con gelatina de 5 cm.
5. Transferir las células no adherentes a un tubo de centrífuga de 15 ml usando una pipeta de transferencia. Enjuague suavemente las placas con 3 ml de medio y agregue al tubo de 15 ml.
6. Centrifugar la suspensión celular a 129 xg durante 4 min, aspirar el superNatura y resuspenda suavemente el gránulo en medio. Determine el recuento de células utilizando un contador de celdas automatizado. Placa de 9.000 células / pocillo en una placa de 96 pocillos de baja adherencia en forma de V.
7. Centrifugar la placa a 163 xg durante 3 min. Incubar la placa a 37 ° C, 95% de humedad y 5% de CO ₂ . Usando una pipeta, cambie 50% de medio cada dos días eliminando la mitad del medio y reemplazándolo con medio de diferenciación químicamente definido 1 (DM1, Tabla 1 ) durante 14 días.

2. Inducción del cuerpo embrionario sin suero (SFEB) ( Figura 2 )

1. Colocar insertos de cultivo celular de 40 mu m en placas de 6 pocillos y añadir 1 ml de medio DM1 al menos 1 h antes de la adición de agregados.
2. El día 14, se transfieren los agregados con 20 μl de medio usando una punta de boca de 200 μl de anchura sobre insertos de cultivo celular de 40 μm y se cambia el medio a DM2. 7 ^{, 17 , 18} .
   1. Transferir 4-6 agregados a un inserto de cultivo celular y permitir un espacio adecuado entre los agregados. Retire la mayor cantidad posible de solución en exceso utilizando una punta de pipeta fina ( por ejemplo, 200 μl de punta).
      NOTA: Es aceptable perturbar brevemente el SFEB ya que se moverán sobre el inserto de cultivo celular como la solución eliminada de alrededor de los SFEB.
   2. Mantener los cultivos en 1 mL de DM2 a 37 ° C, 95% de humedad y 5% de CO ₂ . Utilizando una pipeta, cambie el 75%Medio cada dos días eliminando tres cuartos del medio y reemplazándolo por tres cuartos de medio fresco. Por ejemplo, eliminar 750 μL de medio y agregar 750 μl de medio fresco.
3. Después de 14 días de cultivo, cambie al medio DM3 con 75% de cambio medio cada dos días y durante otros 16 días.
4. Para mantener los SFEBs en insertos de cultivo celular más allá de 30 días, cambie el medio cada dos días durante 60, 90 y 120 días.
   NOTA: Los SFEBs crecerán hasta aproximadamente 1.000 μm de diámetro y son típicamente de 100-150 μm de grosor ¹ .

3. Determinación de la composición del SFEB

1. Separar los SFEBs de la inserción suavemente pipeteando el medio con una punta de pipeta 200 μL boca ancha. Para transferir los SFEB, use una punta de pipeta de boca ancha para succionar suavemente los cuerpos en la punta de la pipeta. Después de cargar SFEB en la punta de la pipeta, transferir suavemente a placas de 12 pocillos y lavar con 300 μl de solución salina tamponada con fosfato(PBS) por pocillo.
   NOTA: Los SFEBs se suspenderán en solución en las placas de 12 pocillos. Esto es importante para permitir la penetración completa del fijador, la solución de bloqueo y los anticuerpos. Si se usan múltiples SFEB para tinción, se pueden agregar hasta 10 SFEB por pocillo de una placa de 12 pocillos. Esto conservará soluciones y anticuerpos.
2. Fijar SFEBs con 300 μL por pocillo de paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 30-45 min. Lavar dos veces SFEBs fijo con 300 μL de PBS, 3-5 min cada lavado.
   Precaución: Use equipo protector personal adecuado cuando maneje paraformaldehído.
   Para identificar las neuronas en este estudio, se usó pollo-Tuj1 a 1: 500, para marcadores adicionales, véase la Tabla 2 y las referencias ^{1 , 16} .
3. Permeabilizar y bloquear con 0,1% de Triton-X100 en PBS y 10% de suero de burro normal (solución de bloqueo, 300 μ; L por pocillo) durante 1 h a temperatura ambiente.
4. Eliminar la solución de bloqueo y tratar SFEBs con 300 μ l de anticuerpos primarios en la solución de bloqueo. Incubar a 4 ° C durante la noche. Lavar los SFEB tres veces (3-5 minutos por lavado) en 300 μL de PBS que contiene 0,1% de Triton-X.
5. Preparar anticuerpos secundarios 1: 1000 en solución de bloqueo. Incubar SFEBs durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios. Lavar los SFEB con 300 μl de PBS, 3 veces durante 3-5 min cada uno.
   NOTA: En esta etapa pueden prepararse SFEBs para imágenes.
6. Para la imagen, pipetee SFEBs en una diapositiva de vidrio usando una pipeta de diámetro ancho. Retire el exceso de solución alrededor del SFEB con succión suave.
   NOTA: Para condiciones de tinción similares, se pueden colocar varios SFEB en el mismo portaobjetos de vidrio.
7. Añadir una gota de medio de montaje en el SFEBs, coloque un cubreobjetos de vidrio, y presione suavemente para asegurarse de que no hay burbujas de aire. Dejar que el medio de montaje se endurezca y proceder a la obtención de imágenes y la cuantificación (paso 3.8).
   NOTA: Una vez que el medio de montaje se endurece, los SFEB están listos para la obtención de imágenes.
8. Realice la cuantificación de células tomando varias regiones de interés (ROI) a través del SFEB y utilizando una pila z combinada con una imagen de proyección máxima a través de cada ROI en un microscopio confocal estándar como se describe en las referencias ^{1 , 16} .
   NOTA: Los SFEBs completos se pueden cuantificar mediante mosaicos basados ​​en imágenes (véanse las referencias ^{1 , 16} para más detalles). Debido a que los SFEB se adelgazan a aproximadamente 100 μm, existe una dispersión mínima de luz en el tejido y, por lo tanto, no hay necesidad de microscopía de 2 fotones. Anterior usos de este protocolo con fibroblastos derivados de iPSCs producido un SFEB destino mapa que reveló estructura compleja y diversa con subpoblaciones de interneurones con identidades transcripcionales que se asemejaba a CGE y forebrain anterior destino ^{1 , 16.}

4. Registro de actividad neuronal en SFEBs Uso de AMAs

1. Prepare placas MEA de 12 pocillos según las instrucciones del fabricante.
2. Lavar las placas de MEA 3 veces durante 5 min con H ₂ O estéril en condiciones asépticas para limpiar. Lavar durante 5 minutos con etanol al 75% y luego con etanol al 100% para esterilizar la placa.
3. Hornear la placa invertida en un horno durante 4-5 h a 50 ° C para completar el proceso de esterilización.
4. Añadir 500 μl de solución de polietilenimina al 0,2% (PEI) a cada pocillo e incubar 1 h a temperatura ambiente. Aspirar PEI y lavar los pocillos 4x con agua destilada H ₂ O. Aire seco estéril en la campana durante una noche.
5. Preparar una solución de 20 μL / mL de laminina en medio L15 y añadir 10 μL de laminina al centro de cada pocillo.
   NOTA: No cubra los electrodos de referencia y de tierra circundantes.
6. Añadir dH ₂ O estéril a los depósitos circundantes para evitar la evaporación del medio o laminina.Incubar la placa durante 1 h a 37 ° C.
7. Añada los SFEBs (ver secciones 1 y 2) a las placas de MEA recubiertas con laminina suzándolas suavemente en una punta de pipeta de boca ancha y transfiéralas. Añadir 200 μl de medio DM2 a cada pocillo e incubar durante la noche a 37 ° C, 95% de humedad y 5% de CO ₂ .
8. Añadir 200 μl de medio adicional después de 24 h y dejar que se recupere durante 30 min a 37 ° C, 95% de humedad, 5% de CO ₂ antes de leer la placa.
9. Colocar la placa MEA en el lector de placas (precalentado a 37 ° C) para registrar la actividad neuronal. Registre la actividad durante 10 minutos con el software de grabación MEA asociado. Véase la referencia ¹⁹ para más detalles.
10. Generar datos crudos - flujos continuos y tramas raster de actividad neuronal utilizando software de análisis estadístico ¹⁹ .
    NOTA: Las grabaciones MEA se toman 7 días después del recubrimiento SFEB. Para este estudio, las grabaciones se tomaron durante 10 minutos para detectar la actividad de ráfaga de red, conRastreo continuo y parcelas raster. Los SFEBs pueden mantenerse a largo plazo en placas MEA y pueden ser registrados durante periodos de tiempo más largos usando condiciones ambientalmente controladas ( Figura 6 ).

Resultados

Los SFEB cultivados usando nuestra técnica dieron tejido con características morfológicas que se asemejan a una zona subventricular cortical precoz repleta de extensas neuronas Tuj1 positivas, así como progenitores neurales ( Figura 3A ). Se observaron numerosas rosetas corticales en desarrollo en las capas externas y capas internas del SFEB ( Figura 3B ). El borde exterior del SFEB se asemeja a una placa cortical en desarro...

Discusión

El protocolo descrito aquí proporciona las condiciones para diferenciar una fuente hiPSC en una estructura tridimensional que recapitula una etapa temprana de desarrollo de la corteza frontal. Este procedimiento produce estructuras que pueden ser interrogadas para electrofisiología, al tiempo que son susceptibles de microscopía. La morfología final del SFEB se asemeja a la de los cultivos organotípicos del corte cerebral y permite una imagen confocal detallada de alta calidad. Este protocolo puede generar con éxit...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components
STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media)	STEMCELL Technologies	0-5835	250 mL
PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media)	GlobalStem	GSM-2001
Name	Company	Catalog Number	Comments
DM1 Media Components
D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1	Invitrogen	10565018	385 mL
Knockout Serum Replacement	Invitrogen	10828028	20% 100 mL
Pen/Strep	Invitrogen	15140122	5 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid	Invitrogen	11140050	5 mL
2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid	Invitrogen	21985023	900 μL
Name	Company	Catalog Number	Comments
DM2 Media Components
D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1	Invitrogen	10565018	500 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
Pen/Strep	Invitrogen	15140122	5 mL
N-2 Supplement (100x), liquid	Invitrogen	17502048	10 mL
Name	Company	Catalog Number	Comments
DM3 Media Components
NEUROBASAL Medium (1x), liquid	Invitrogen	21103049	500 mL
B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid	Invitrogen	12587010	10 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
Pen/Strep	Invitrogen	15140122	5 mL
Name	Company	Catalog Number	Comments
Small Molecules
Thiazovivin	Stemgent	04-0017	2 μM
SB431542	Stemgent	04-0010-10	1:1,000 (10 μM)
Dorsomorphin	Stemgent	04-0024	1 μM
LDN-193189	Stemgent	04-0074-10	250 nM
Y27632 (ROCKi)	Stemgent	04-0012-10	10 μM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant Protiens
DKK-1	Peprotech	120-30	200 ng/mL
Name	Company	Catalog Number	Comments
Components/Materials
Cell Culture inserts 0.4 μM, 30mm Diameter	Millicell	PICM0RG50
Mouse Embryonic Fibroblasts	GlobalStem	GSC-6301G
96 well V bottom w/Lids	Evergreen	222-8031-01V
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	ThermoFisher	A1110501
TritonX-100	ThermoFisher	85111
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher	10010023	500 mL
Normal Donkey Serum	Jackson Labs	017-000-121
Leibovitz's L-15 Medium	ThermoFisher	11415114	500 mL
DRAQ5 (Nuclear Marker)	ThermoFisher	65-0880-96
MEA Plates	Axion Biosystems	M768-GL1-30Pt200
6 well flat bottom	Falcon	353046
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Nestin	Millipore	MAB5326
Brn-2	Protein tech	14596-1-AP
VGLUT1	Synaptic Systems	135 303
Pax6	abcam	ab5790
Calretinin	abcam	ab702
Calbindin	abcam	ab11426
CoupTFII	R&D Systems	PPH714700
Nkx 2.1	abcam	ab12650
Tuj1	abcam	ab41489
Reelin	Millipore	MAB5364
Tbr1	Millipore	MAB2261
NFH	Dako	M0762