Développer des corps embryoïdes libres de sérum dérivés dérivés de HiPSC pour l'interrogation de cultures cellulaires souches 3-D à l'aide de tests physiologiquement pertinents

Résumé

Ici, nous rapportons un protocole pour développer un système tridimensionnel (3-D) à partir de cellules souches induites par l'homme-pluripotent (hiPSC) appelé le corps embryoïde sans sérum (SFEB). Ce modèle 3-D peut être utilisé comme une culture de tranche organotypique pour modéliser le développement cortical humain et pour l'interrogation physiologique des circuits neuronaux en développement.

Résumé

Bien qu'un certain nombre de modèles de maladies in vitro aient été développés à l'aide de HiPSC, une limitation est que ces systèmes bidimensionnels (2-D) peuvent ne pas représenter la complexité cytoarchitecturale et fonctionnelle sous-jacente des personnes concernées portant des variants présumés de la maladie. Les modèles 2-D classiques restent des représentations incomplètes des structures semblables à celles de l' in vivo et ne captent pas adéquatement la complexité du cerveau. Ainsi, il existe un besoin émergent de plus de modèles 3-D hiPSC qui peuvent mieux récapituler les interactions et les fonctions cellulaires observées dans un système in vivo .

Nous rapportons ici un protocole pour développer un système 3-D à partir de hiPSC non indifférenciés basé sur le corps embryoïde sans sérum (SFEB). Ce modèle 3-D reflète les aspects d'un néocortex ventralisé en développement et permet des études sur des fonctions intégrées aux cellules neuronales vivantes et aux tissus intacts tels que la migration, la connectivité, la communication et le matelasUration. Plus précisément, nous démontrons que les SFEB utilisant notre protocole peuvent être interrogés à l'aide de tests basés sur des cellules physiologiquement pertinents et à haute teneur, tels que l'imagerie au calcium et les enregistrements multi-électrodes (AMA) sans cryotypie. Dans le cas des enregistrements MEA, nous démontrons que les SFEB augmentent l'activité de pointe et l'activité d'éclatement au niveau du réseau pendant la culture à long terme. Ce protocole SFEB fournit un système robuste et évolutif pour l'étude du développement de la formation de réseau dans un modèle 3-D qui capte des aspects du développement corticale précoce.

Introduction

Nous avons déjà signalé un système modèle 3-D, généré à partir de cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC), qui récapitule certains aspects du développement initial du réseau cortical ¹ . Ce modèle 3-D, un corps embryoïde sans sérum (SFEB), améliore l'agrégation simple précédente hiPSC models ^{2 , 3} . Un travail croissant révèle que les structures en 3-D, comme nos SFEB, ont des aspects approximatifs du développement neuronal communément observés in vivo et à un point de temps antérieur à ceux observés dans les modèles ^{2 , 5} (2-D) / monocouches hiPSC. Les études initiales ont porté sur la complexité auto-organisée des corps en 3-D sans démontrer leur complexité physiologique ² .

Le protocole décrit ici a été utilisé sur des hiPSC indifférenciés dérivés de fibroblastes et Cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC). Ces cellules sont maintenues sur des alimentateurs embryonnaires de souris irradiés par γ (MEF). Ces colonies hiPSC sont nettoyées manuellement de cellules spontanément différenciées, récoltées enzymatiquement et remises en suspension dans un milieu contenant l'inhibiteur de Rho-kinase Y-27632 (ROCKi). Les hiPSC indifférenciés sont soumis à la dissociation et à la centrifugation avant d'être transférés dans des plaques à fond de V à faible adhérence à 96 puits. Après le placage, l'induction neurale est initiée à l'aide d'une double inhibition de SMAD (SB431542 et LDN193189 avec dickkopf 1 (DKK-1)) pour conduire une lignée de front neuronal avant-cerveau avant antérieur ⁶ . Après 14 jours, les SFEB sont transférés dans des plaquettes de culture cellulaire dans une assiette à 6 puits. Une fois transféré, les SFEB rondes commencent à se propager et minces, tout en maintenant les connexions au réseau local, comme cela est souvent observé dans les préparations de culture en tranche organotypique de l'hippocampe en utilisant des inserts de culture cellulaire similaires ^{1 ,}Ss = "xref"> 7.

L'utilisation d'une plate-forme 3D basée sur SFEB dans ce format est susceptible de produire efficacement des réseaux corticaux qui peuvent être interrogés à l'aide de tests physiologiques à base de cellules tels que l'imagerie au calcium ou des analyses électrophysiologiques telles que les enregistrements cellulaires simples ou les ensembles multi-électrodes (MEA ) ¹ . Bien que les systèmes 3-D portent les marqueurs du développement corticale précoce, d'autres études ont montré que ces corps 3-D peuvent nécessiter des temps d'incubation plus longs pour permettre le rythme intrinsèquement plus lent du développement des tissus humains ⁸ . Ce protocole SFEB génère avec succès des SFEB 3-D à partir de hiPSC indifférenciés qui capte des aspects du développement précoce du cortex.

Le potentiel des SFEB pour modéliser les aberrations du réseau dans les troubles neurologiques est une force de ce système. Les hiPSC dérivés du tissu patient peuvent être transformés en cellules du système nerveux qui sont sujettes à un culAys concernant la biologie cellulaire ainsi que l'expression concomitante des gènes. IPSCs humaines sont utilisées pour déterminer le profil génétique de grands groupes de personnes avec divers troubles neurologiques d'étiologies complexes tels que les troubles du spectre autistique (ASD), la schizophrénie ^9, le syndrome de Rett ^10, et la maladie d'Alzheimer ^{11, 12.} Jusqu'à récemment, les modèles iPSC étaient généralement des préparations monocouches qui, tout en maîtrisant l'évaluation des interactions moléculaires, étaient insuffisantes pour déchiffrer les interactions cellulaires complexes observées in vivo . Les modèles animaux ont été le substitut par défaut pour recréer la plate-forme entière d'organe. Ces modèles animaux sont en proie à une mauvaise traduction des résultats et ont une capacité limitée à reproduire les profils génétiques humains identifiés par de grandes études de dépistage génétique. Ainsi, le développement de systèmes 3-D à partir d'iPSCs ajoute une couche de complexité nécessaire en humainModélisation de la maladie ^{13 , 14} . La prochaine étape pour les plates-formes 3D HiPSC est de répondre aux exigences à grande échelle du dépistage à haut débit en utilisant des analyses à base de cellules ¹⁵ .

Protocole

1. Génération de cellules progénitrices neuronales

1. Maintenir les hiPSC dérivés de fibroblastes et de PBMC dans des plaques à 6 puits sur une couche de cellules d'alimentation embryonnaire de souris irradiée par γ (MEF) dans un milieu iPSC humain complété par de petites molécules (voir la Table des matériaux).
   REMARQUE: La maintenance quotidienne est une version modifiée des procédures ^{1 , 16} précédemment rapportées.
   1. Placer 6 x 10 ⁵ MEF sur chaque puits d'une plaque de culture de culture de tissu de 6 puits en 300 μL / bien recommandé (suivant le protocole du fabricant).
   2. Après 48 heures, remplacer le milieu MEF par un milieu hiPSC 300 μL / puit pendant 1 h avant d'ajouter les hiPSC.
   3. Décomposer rapidement les hiPSC dans un bain d'eau à 37 ° C et ajouter lentement 1 mL de milieu hiPSC à goutte à goutte. Transférer les hiPSC et le tube conique à 15 mL. Ajouter un milieu pour porter le volume total à 5 ​​mL. Centrifuger pendant 4 min à 129 xg, aspirer les supernataNt, relâchez doucement la pastille dans un milieu HiPSC de 1 mL avec un inhibiteur de ROCK à 1: 1 000 de concentration.
   4. Placer la suspension cellulaire (typiquement ensemencée à 300 000 cellules / puits) sur la couche de cellules MEF et incuber à 37 ° C, 5% de CO ₂ , 95% d'humidité.
   5. Surveillez la culture iPSC en utilisant étroitement un microscope optique. Après 48 h, enlever les cultures qui ont des bords inégaux, ont grandi pour devenir cystiques ou semblent brun jaunâtre sous microscope optique pour minimiser la différenciation spontanée.
      REMARQUE: Après 7 à 10 jours, les colonies hiPSC devraient se former. Les colonies devraient être rondes, avec des frontières clairement définies et des densités cellulaires uniformes, et dépourvues de cellules non uniformes peu emballées.
   6. Sélectionnez manuellement les colonies hiPSC rondes pour éliminer la culture de cellules différenciées spontanément. Développez les colonies en les plaçant sur des couches MEF fraîches. Développer 1: 3 tous les 7 jours lorsque les cultures proches de la confluence et de congeler ^{1 , 16} .
2. Après l'expansion et la congélation des cellules (pour la sauvegarde), cultiver les colonies hiPSC sur les plaques jusqu'à atteindre 50 à 75% de confluence.
3. Sept jours de post-plaquage, utilisez un traitement enzymatique léger (5-10 min avec 300 μL de solution enzymatique) et une trituration douce (2-4 fois avec une pipette de 1000 μl) pour récolter et préparer des hiPSC pour la différenciation des cellules précurseurs neuronales.
4. Centrifuger la suspension cellulaire à 129 xg pendant 4 min, aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 5 ml de milieu iPSC humain. Transférer la suspension cellulaire dans un plat de culture de cellules de 5 cm revêtu de gélatine à 0,1% pendant 1 h à 37 ° C pour éliminer les MEF et pour maximiser le rendement hiPSC. Transférer le milieu (avec des cellules non adhérentes) à un autre plat revêtu de gélatine de 5 cm.
5. Transférer les cellules non adhérentes dans un tube centrifuge de 15 mL en utilisant une pipette de transfert. Rincer doucement les plaques avec 3 mL de milieu et l'ajouter au tube de 15 mL.
6. Centrifuger la suspension cellulaire à 129 xg pendant 4 min, aspirer le superEt de ressusciter doucement la pastille dans le milieu. Déterminer le nombre de cellules à l'aide d'un compteur de cellules automatisé. Placer 9 000 cellules / puits dans une plaque à fond de V à faible adhérence à 96 puits.
7. Centrifuger la plaque à 163 xg pendant 3 min. Incuber la plaque à 37 ° C, 95% d'humidité et 5% de CO ₂ . En utilisant une pipette, changez 50% de moyenne tous les deux jours en enlevant la moitié du milieu et en la remplaçant par un milieu différenciateur chimique défini 1 (DM1, Figure 1 , Tableau des matériaux) pendant 14 jours.

2. Induction du corps d'embryéroïde sans sérum (SFEB) ( Figure 2 )

1. Placer des inserts de culture cellulaire de 40 μm dans des plaques à 6 puits et ajouter 1 mL de milieu DM1 au moins 1 h avant l'addition d'agrégats.
2. Le jour 14, transférez les agrégats avec un milieu de 20 μL en utilisant une pointe de bouche large de 200 μl sur des inserts de culture cellulaire de 40 μm et changez le milieu en DM2.
   NOTE: Les inserts de culture cellulaire sont des inserts spécialisés qui se détachent légèrement du fond du puits et se composent d'une membrane en polytétrafluoroéthylène suspendue à travers un cadre en plastique. Cette membrane est biocompatible et peut efficacement soutenir le transport des nutriments et de l'oxygène vers les SFEB, qui sont placés sur le dessus. Ils sont couramment utilisés avec des cultures organototypiques en coupe de l'hippocampe prises à partir de souris ou de rat ^{7 , 17 , 18} .
   1. Transférer les agrégats 4-6 dans un insert de culture cellulaire et permettre un espace adéquat entre les agrégats. Retirez autant de solution excédentaire que possible à l'aide d'une pointe de pipette fine ( p . Ex . Pointe de 200 μL).
      REMARQUE: Il est acceptable de déranger brièvement le SFEB car ils se déplacent sur l'insert de culture cellulaire en tant que solution éliminée des SFEB.
   2. Maintenir les cultures dans 1 mL de DM2 à 37 ° C, 95% d'humidité et 5% de CO ₂ . À l'aide d'une pipette, changez 75%Moyen tous les deux jours en enlevant les trois quarts du milieu et en remplaçant par trois quarts de milieu frais. Par exemple, enlever 750 μL de milieu et ajouter 750 μL de milieu frais.
3. Après 14 jours de culture, passer au milieu DM3 avec un changement moyen de 75% tous les deux jours et pendant 16 jours supplémentaires.
4. Pour maintenir les SFEB sur les inserts de culture cellulaire au-delà de 30 jours, changez le support tous les deux jours pendant 60, 90 et 120 jours.
   NOTE: Les SFEB atteindront environ 1000 μm de diamètre et sont généralement de 100-150 μm d'épaisseur ¹ .

3. Détermination de la composition de SFEB

1. Détachez les SFEB de l'insert par un fluide de pipetage doux à l'aide d'une pointe de pipette à bouche large de 200 μl. Pour transférer les SFEB, utilisez une pointe de pipette à bouche large pour aspirer doucement les corps dans la pointe de la pipette. Après avoir chargé SFEB dans la pointe de la pipette, transférer doucement dans des plaques à 12 puits et laver avec 300 μL de solution salée tamponnée au phosphate(PBS) par puits.
   REMARQUE: Les SFEB seront suspendus en solution dans les plaques à 12 puits. Ceci est important pour permettre une pénétration complète du fixateur, de la solution de blocage et des anticorps. Si vous utilisez des SFEB multiples pour la coloration, jusqu'à 10 SFEB peuvent être ajoutés par puits d'une plaque de 12 puits. Cela consistera à conserver des solutions et des anticorps.
2. Fixez les SFEB avec 300 μL par puits 4% de paraformaldéhyde à température ambiante pendant 30 à 45 minutes. Laver les SFEB fixes deux fois avec 300 μL de PBS, 3-5 minutes chaque lavage.
   Attention: Portez un équipement de protection individuelle approprié lors de la manipulation du paraformaldéhyde.
   REMARQUE: Probe d'immunoréactivité aux marqueurs pour déterminer la maturité, le type de cellule, etc. Pour marquer les neurones dans cette étude, le poulet-Tuj1 a été utilisé à 1: 500, pour les marqueurs supplémentaires, voir le tableau 2 et les références ^{1 , 16} .
3. Perméabiliser et bloquer avec 0,1% de Triton-X100 dans du PBS et 10% de sérum d'âne normal (solution de blocage, 300 μ, L par puits) pendant 1 h à température ambiante.
4. Supprimer la solution de blocage et traiter les SFEB avec 300 μL d'anticorps primaires dans la solution de blocage. Incuber à 4 ° C pendant la nuit. Les SFEB de lavage sont trois fois (3-5 min par lavage) dans 300 μL de PBS contenant 0,1% de Triton-X.
5. Préparez les anticorps secondaires 1: 1000 dans la solution de blocage. Incuber les SFEB pendant 1 h à température ambiante avec des anticorps secondaires. Wash SFEB avec 300 μL de PBS, 3 fois pendant 3-5 minutes chacun.
   REMARQUE: À ce stade, les SFEB peuvent être préparés pour l'imagerie.
6. Pour l'image, faites pipeter des SFEB sur une glissière en verre à l'aide d'une pipette à grand diamètre. Retirer la solution excédentaire autour du SFEB en utilisant une aspiration douce.
   REMARQUE: pour des conditions de coloration similaires, plusieurs SFEB peuvent être placés sur la même diapositive en verre.
7. Ajouter une goutte de support sur les SFEB, placer une lamelle de verre et appuyer doucement pour s'assurer qu'il n'y a pas de bulles d'air. Laisser durcir le support de montage et procéder à l'imagerie et à la quantification (étape 3.8).
   NOTE: Après le durcissement du support de montage, les SFEB sont prêts à l'imagerie.
8. Effectuer la quantification des cellules en prenant plusieurs régions d'intérêt (ROI) à travers le SFEB et en utilisant une pile z combinée avec une image de projection maximale à travers chaque ROI sur un microscope confocal standard comme décrit dans les références ^{1 , 16} .
   REMARQUE: les SFEB entiers peuvent être quantifiés à l'aide d'un carrelage basé sur l'image (voir les références ^{1 , 16} pour plus de détails). Étant donné que les SFEB sont minces à environ 100 μm, il y a une diffusion minimale de lumière dans le tissu et donc il n'y a pas besoin de microscopie à 2 photons. Les utilisations antérieures de ce protocole avec des iPSC basés sur les fibroblastes ont produit une carte de destinée de SFEB qui a révélé une structure complexe et diversifiée avec des sous-populations d'interneurones ayant des identités transcriptionnelles ressemblant à des cérébrales et des fêtes avant-cerveau avant ^{1 , 16.}

4. Enregistrement de l'activité neuronale dans les SFEB à l'aide de MEA

1. Préparer des plaques MEA de 12 puits selon les instructions du fabricant.
2. Laver les plaques MEA 3 fois pendant 5 minutes avec H ₂ O stérile dans des conditions aseptiques pour nettoyer. Laver pendant 5 minutes avec de l'éthanol à 75% puis avec de l'éthanol à 100% pour stériliser la plaque.
3. Cuire la plaque inversée dans un four pendant 4-5 h à 50 ° C pour compléter le processus de stérilisation.
4. Ajouter 500 μL de solution de polyéthylèneimine 0,2% (PEI) à chaque puits et incuber 1 h à température ambiante. Aspirer l'Île-du-Prince-Édouard et laver les puits 4x avec de l'H ₂ O distillé stérile. Faire sécher à l'air dans la hotte pendant la nuit.
5. Préparez une solution de laminine de 20 μL / mL en milieu L15 et ajoutez 10 μL de laminine au centre de chaque puits.
   REMARQUE: Ne pas enduire les électrodes de référence et de mise à la terre environnantes.
6. Ajouter du dH ₂ O stérile aux réservoirs environnants pour éviter l'évaporation moyenne ou à la laminine.Incuber la plaque pendant 1 h à 37 ° C.
7. Ajouter les SFEB (voir les sections 1 et 2) aux plaques MEA revêtues de laminine en les aspirant doucement dans une pointe de pipette à bouche large et les transférer. Ajouter 200 μL de milieu DM2 à chaque puits et incuber pendant une nuit à 37 ° C, 95% d'humidité et 5% de CO ₂ .
8. Ajouter un milieu supplémentaire de 200 μL après 24 h et lui permettre de récupérer pendant 30 min à 37 ° C, 95% d'humidité, 5% de CO ₂ avant de lire la plaque.
9. Placez la plaque MEA dans le lecteur de plaque (préchauffé à 37 ° C) pour enregistrer l'activité neuronale. Enregistrez l'activité pendant 10 min avec le logiciel d'enregistrement MEA associé. Voir la référence ¹⁹ pour plus de détails.
10. Générer des données brutes - des flux continus et des parcelles raster de l'activité neuronale à l'aide d'un logiciel d'analyse statistique ¹⁹ .
    REMARQUE: les enregistrements MEA sont pris 7 jours après le placage SFEB. Pour cette étude, des enregistrements ont été effectués pendant 10 minutes pour détecter l'activité de rafale du réseau,Trace continue et traces rares. Les SFEB peuvent être maintenus à long terme sur des plaques MEA et peuvent être enregistrés sur des périodes plus longues en utilisant des conditions environnementales ( figure 6 ).

Résultats

Les SFEB cultivés à l'aide de notre technique ont produit des tissus présentant des caractéristiques morphologiques qui ressemblent à une zone subventriculaire corticale de développement précoce remplie de neurones Tuj1-positifs étendus, ainsi que de progéniteurs neuronaux ( Figure 3A ). De nombreuses rosettes corticales en développement ont été observées dans les couches externes et les couches internes du SFEB ( figure...

Discussion

Le protocole décrit ici fournit les conditions pour différencier une source hiPSC en une structure 3-D qui récapitule un stade de développement précoce du cortex frontal. Cette procédure donne des structures qui peuvent être interrogées pour l'électrophysiologie tout en étant susceptibles de microscopie. La morphologie finale du SFEB ressemble à celle des cultures de tranches de cerveau organotypiques et permet une imagerie confocale détaillée de haute qualité. Ce protocole peut générer des SFEB à l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components
STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media)	STEMCELL Technologies	0-5835	250 mL
PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media)	GlobalStem	GSM-2001
Name	Company	Catalog Number	Comments
DM1 Media Components
D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1	Invitrogen	10565018	385 mL
Knockout Serum Replacement	Invitrogen	10828028	20% 100 mL
Pen/Strep	Invitrogen	15140122	5 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid	Invitrogen	11140050	5 mL
2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid	Invitrogen	21985023	900 μL
Name	Company	Catalog Number	Comments
DM2 Media Components
D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1	Invitrogen	10565018	500 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
Pen/Strep	Invitrogen	15140122	5 mL
N-2 Supplement (100x), liquid	Invitrogen	17502048	10 mL
Name	Company	Catalog Number	Comments
DM3 Media Components
NEUROBASAL Medium (1x), liquid	Invitrogen	21103049	500 mL
B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid	Invitrogen	12587010	10 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
Pen/Strep	Invitrogen	15140122	5 mL
Name	Company	Catalog Number	Comments
Small Molecules
Thiazovivin	Stemgent	04-0017	2 μM
SB431542	Stemgent	04-0010-10	1:1,000 (10 μM)
Dorsomorphin	Stemgent	04-0024	1 μM
LDN-193189	Stemgent	04-0074-10	250 nM
Y27632 (ROCKi)	Stemgent	04-0012-10	10 μM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant Protiens
DKK-1	Peprotech	120-30	200 ng/mL
Name	Company	Catalog Number	Comments
Components/Materials
Cell Culture inserts 0.4 μM, 30mm Diameter	Millicell	PICM0RG50
Mouse Embryonic Fibroblasts	GlobalStem	GSC-6301G
96 well V bottom w/Lids	Evergreen	222-8031-01V
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	ThermoFisher	A1110501
TritonX-100	ThermoFisher	85111
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher	10010023	500 mL
Normal Donkey Serum	Jackson Labs	017-000-121
Leibovitz's L-15 Medium	ThermoFisher	11415114	500 mL
DRAQ5 (Nuclear Marker)	ThermoFisher	65-0880-96
MEA Plates	Axion Biosystems	M768-GL1-30Pt200
6 well flat bottom	Falcon	353046
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Nestin	Millipore	MAB5326
Brn-2	Protein tech	14596-1-AP
VGLUT1	Synaptic Systems	135 303
Pax6	abcam	ab5790
Calretinin	abcam	ab702
Calbindin	abcam	ab11426
CoupTFII	R&D Systems	PPH714700
Nkx 2.1	abcam	ab12650
Tuj1	abcam	ab41489
Reelin	Millipore	MAB5364
Tbr1	Millipore	MAB2261
NFH	Dako	M0762