Entwickeln von HiPSC-abgeleiteten serumfreien Embryoidkörpern zur Vernehmung von 3-D-Stammzellkulturen unter Verwendung physiologisch relevanter Assays

Zusammenfassung

Hier berichten wir über ein Protokoll zur Entwicklung eines dreidimensionalen (3-D) -Systems aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs), dem so genannten serumfreien Embryoidkörper (SFEB). Dieses 3-D-Modell kann wie eine organotypische Scheibenkultur verwendet werden, um die menschliche kortikale Entwicklung zu modellieren und für die physiologische Abfrage der Entwicklung von neuronalen Schaltungen.

Zusammenfassung

Obwohl eine Reihe von In-vitro- Erkrankungsmodellen unter Verwendung von hiPSCs entwickelt worden ist, ist eine Einschränkung, dass diese zweidimensionalen (2-D) -Systeme nicht die zugrunde liegende zytoarchitektonische und funktionelle Komplexität der betroffenen Individuen darstellen, die vermutete Krankheitsvarianten tragen. Konventionelle 2-D-Modelle bleiben unvollständige Darstellungen von in vivo- artigen Strukturen und erfassen die Komplexität des Gehirns nicht adäquat. So gibt es einen neuen Bedarf an mehr 3-D-hiPSC-basierten Modellen, die die zellulären Wechselwirkungen und Funktionen, die in einem In-vivo- System gesehen werden, besser rekapitulieren können.

Hier berichten wir über ein Protokoll zur Entwicklung eines 3-D-Systems aus undifferenzierten HIPSCs basierend auf dem serumfreien Embryoidkörper (SFEB). Dieses 3-D-Modell spiegelt Aspekte eines sich entwickelnden ventralisierten Neocortex und ermöglicht Studien in Funktionen integraler Bestandteil der lebenden neuronalen Zellen und intakten Gewebe wie Migration, Konnektivität, Kommunikation und MatteUration Speziell zeigen wir, dass die SFEBs, die unser Protokoll verwenden, unter Verwendung physiologisch relevanter und hochinhaltszellbasierter Assays wie Calcium-Imaging und Multi-Elektroden-Array (MEA) -Aufzeichnungen ohne Kryoschaltung abgefragt werden können. Im Fall von MEA-Aufnahmen zeigen wir, dass SFEBs während der langfristigen Kultivierung sowohl die Spike-Aktivität als auch die auf Wachstumsebene beruhigende Aktivität erhöhen. Dieses SFEB-Protokoll bietet ein robustes und skalierbares System für die Untersuchung der Entwicklung der Netzwerkbildung in einem 3-D-Modell, das Aspekte der frühen kortikalen Entwicklung erfasst.

Einleitung

Wir haben bereits ein 3-D-Modellsystem gemeldet, das aus patientenorientierten humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) erzeugt wurde, die einige Aspekte der frühen kortikalen Netzwerkentwicklung zusammenfassen ¹ . Dieses 3-D-Modell, ein serumfreier Embryoidkörper (SFEB), verbessert die bisherigen einfachen Aggregations-HIPSC-Modelle ^{2 , 3} . Ein wachsender Körper der Arbeit zeigt, dass 3-D-Strukturen wie unsere SFEBs, ungefähre Aspekte der neuralen Entwicklung, die in vivo und zu einem früheren Zeitpunkt beobachtet werden, als in den zweidimensionalen (2-D) / Monolayer-hiPSC-Modellen ^{4 , 5 beobachtet wurden} . Die anfänglichen Studien konzentrierten sich auf die selbstorganisierende Komplexität von 3-D-Körpern, ohne ihre physiologische Komplexität zu demonstrieren ² .

Das hier beschriebene Protokoll wurde auf undifferenzierten HiPSCs aus Fibroblasten und Peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs). Diese Zellen werden auf γ-bestrahlten Maus-Embryonal-Feedern (MEFs) gehalten. Diese hiPSC-Kolonien werden manuell von spontan differenzierten Zellen gereinigt, enzymatisch geerntet und in Medium, das den Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632 (ROCKi) enthält, resuspendiert. Undifferenzierte hiPSCs werden einer Dissoziation und Zentrifugation unterworfen, bevor sie auf 96-Well-Niedrigadhäsions-V-Bodenplatten übertragen werden. Nach dem Plattieren wird die neuronale Induktion mittels Dual-SMAD-Hemmung (SB431542 und LDN193189 zusammen mit dickkopf 1 (DKK-1)) initiiert, um eine anterior-frontale Vorderhirn-Neuronal-Schicksalslinie ⁶ zu treiben. Nach 14 Tagen werden die SFEBs in Zellkultureinsätze in eine 6-Well-Platte überführt. Einmal übertragen, beginnen die runden SFEBs zu verbreiten und zu dünn, während die Aufrechterhaltung lokaler Netzwerkverbindungen, wie es häufig in hippocampalen organotypischen Scheibenkulturpräparaten unter Verwendung ähnlicher Zellkultureinsätze ^{1 ,}Ss = "xref"> 7

Die Verwendung einer SFEB-basierten 3-D-Plattform in diesem Format ist der effizienten Herstellung von kortikalen Netzwerken zugänglich, die unter Verwendung von zellbasierten physiologischen Assays wie z. B. Calcium-Imaging oder elektrophysiologische Assays wie Einzelzell-Aufnahmen oder Multi-Elektroden-Array (MEA) abgefragt werden können ) ¹ . Obwohl 3-D-Systeme die Marker der frühen kortikalen Entwicklung tragen, haben andere Studien gezeigt, dass diese 3-D-Körper längere Inkubationszeiten benötigen, um das inhärent langsamere Tempo der Entwicklung des menschlichen Gewebes zu ermöglichen ⁸ . Dieses SFEB-Protokoll generiert erfolgreich 3-D-SFEBs aus undifferenzierten hiPSCs, die Aspekte der frühen Entwicklung der Kortex erfassen.

Das Potenzial von SFEBs, Netzwerk-Aberrationen bei neurologischen Störungen zu modellieren, ist eine Stärke dieses Systems. Die aus dem Patientengewebe gewonnenen hiPSCs können in Zellen des Nervensystems gezüchtet werden, die dem Arsch unterworfen sindAys in Bezug auf die Zellbiologie sowie die gleichzeitige Genexpression. Human-iPSCs werden verwendet, um das genetische Profil von großen Gruppen von Individuen mit unterschiedlichen neurologischen Störungen mit komplexen Ätiologien wie Autismus-Spektrum-Störung (ASD), Schizophrenie ⁹ , Rett-Syndrom ¹⁰ und Alzheimer-Krankheit ^{11 , 12 zu ermitteln} . Bis vor kurzem waren iPSC-Modelle typischerweise Monolayer-Präparate, die bei der Bewertung molekularer Wechselwirkungen bei der Entschlüsselung der in vivo beobachteten komplexen zellulären Wechselwirkungen unzureichend waren. Tiermodelle sind der Standard-Ersatz für die Wiederherstellung der Ganz-Organ-Plattform. Diese Tiermodelle werden von einer schlechten Übersetzung der Befunde geplagt und haben eine begrenzte Fähigkeit, menschliche genetische Profile zu replizieren, die durch große genetische Screening-Studien identifiziert wurden. So fügt die Entwicklung von 3-D-Systemen von iPSCs eine erforderliche Schicht von Komplexität in menschlichen hinzuKrankheitsmodellierung ^{13 , 14} . Der nächste Schritt für 3D-hiPSC-Plattformen ist es, den großtechnischen Anforderungen des Hochdurchsatz-Screenings unter Verwendung von zellbasierten Assays ¹⁵ Rechnung zu tragen.

Protokoll

1. Erzeugung von neuronalen Progenitorzellen

1. HIPSCs, die von Fibroblasten und PBMCs in 6-Well-Platten auf einer γ-bestrahlten Maus-Embryonal-Feeder (MEF) -Zellschicht in menschlichem iPSC-Medium, ergänzt mit kleinen Molekülen (siehe Materialtabelle), abgeleitet sind.
   HINWEIS: Die tägliche Wartung ist eine modifizierte Version der zuvor gemeldeten Verfahren ^{1 , 16} .
   1. Platte 6 x 10 ⁵ MEFs auf jede Vertiefung einer 6-Well-Gewebekultur-Gradplatte in 300 μl / gut empfohlenem Medium (nach Herstellerprotokoll).
   2. Nach 48 h, ersetzen Sie MEFs Medium mit 300 μl / well hiPSC Medium für 1 h vor dem Hinzufügen von hiPSCs.
   3. Schnelles Aufhängen von hiPSCs in einem 37 ° C Wasserbad und langsam 1 mL hiPSC Medium tropfenweise hinzufügen. Übertragen Sie die HIPSCs und das Medium auf ein 15 ml konisches Röhrchen. Medium hinzufügen, um das Gesamtvolumen auf 5 ml zu bringen. 5 min bei 129 xg zentrifugieren, die supernata absaugenNt, das Pellet vorsichtig in 1 mL hiPSC-Medium mit ROCK-Inhibitor bei 1: 1000-Konzentration wieder suspendieren.
   4. Die Zellsuspension (typischerweise bei 300.000 Zellen / Vertiefung) auf die MEF-Zellschicht auftragen und bei 37 ° C, 5% CO ₂ , 95% Feuchtigkeit inkubieren.
   5. Überwachen Sie die iPSC-Kultur mit einem Lichtmikroskop. Nach 48 h, entfernen Sie Kulturen, die unebene Kanten haben, sind gewachsen, um zystisch zu werden oder gelblich-braun unter dem Lichtmikroskop zu erscheinen, um die spontane Differenzierung zu minimieren.
      ANMERKUNG: Nach 7 - 10 Tagen sollten sich hiPSC Kolonien bilden. Kolonien sollten rund, mit klar definierten Grenzen und einheitlichen Zelldichten und ohne lose gepackte ungleichförmige Zellen sein.
   6. Manuell selektieren Sie runde hiPSC Kolonien, um die Kultur der spontan differenzierten Zellen zu löschen. Erweitern Sie die Kolonien, indem Sie sie auf frische MEF-Schichten legen. Erweitere 1: 3 alle 7 Tage, wenn Kulturen in der Nähe von Konfluenz und Einfrieren ^{1 , 16} .
2. Nach der Expansion und dem Einfrieren von Zellen (für die Sicherung), wachsen hiPSC Kolonien auf Platten, bis sie 50 - 75% Konfluenz erreichen.
3. Sieben-Tage-Nachplattierung, mild enzymatische Behandlung (5-10 min mit 300 μl Enzymlösung) und sanftes Triturieren (2-4 mal mit einer 1000 μl Pipette) zur Ernte und Herstellung von hiPSCs für die neuronale Vorläuferzelldifferenzierung.
4. Die Zellsuspension bei 129 xg für 4 min zentrifugieren, den Überstand absaugen und das Pellet in 5 ml menschlichem iPSC-Medium resuspendieren. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 0,1% ige Gelatine-beschichtete 5 cm Zellkulturschale für 1 h bei 37 ° C, um MEFs zu eliminieren und die hiPSC-Ausbeute zu maximieren. Übertragen Sie das Medium (mit nicht-adhärenten Zellen) auf eine weitere 5 cm Gelatine beschichtete Schale.
5. Übertragen der nicht-adhärenten Zellen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen unter Verwendung einer Transferpipette. Die Platten mit 3 mL Medium vorsichtig ausspülen und in die 15 ml Röhre geben.
6. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 129 xg für 4 min, aspirieren Sie den SuperNatant, und sanft resuspend das Pellet in Medium. Bestimmen Sie die Zellenzählung mit einem automatisierten Zellenzähler. Platte 9.000 Zellen / Vertiefung in einer 96-Well-Niedrigadhäsions-V-Bodenplatte.
7. Die Platte bei 163 xg für 3 min zentrifugieren. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C, 95% Feuchtigkeit und 5% CO ₂ . Mit einer Pipette wechseln Sie 50% Medium jeden zweiten Tag, indem Sie die Hälfte des Mediums entfernen und es mit frischem, chemisch definiertem Differenzierungsmedium 1 (DM1, Abbildung 1 , Tabelle der Materialien) für 14 Tage ersetzen.

2. Serumfreier Embryoidkörper (SFEB) Induktion ( Abbildung 2 )

1. Legen Sie 40 μm Zellkultureinsätze in 6-Well-Platten und fügen Sie 1 mL DM1-Medium mindestens 1 h vor der Zugabe von Aggregaten hinzu.
2. Am Tag 14 werden die Aggregate mit 20 μl Medium unter Verwendung einer 200 μl breiten Mundspitze auf 40 μm Zellkultureinsätze transferiert und das Medium auf DM2 umgestellt.
   HINWEIS: Zellkultur-Einsätze sind spezialisierte Einsätze, die sich leicht von der Unterseite des Brunnens sitzen und aus einer Polytetrafluorethylenmembran bestehen, die über einem Kunststoffrahmen aufgehängt ist. Diese Membran ist biokompatibel und kann den Nährstoff- und Sauerstofftransport effizient zu den SFEBs führen, die oben platziert werden. Sie werden häufig mit organotypischen hippocampalen Scheibenkulturen aus der Maus oder Ratte ^{7 , 17 , 18 verwendet} .
   1. Übertragen Sie 4-6 Aggregate auf einen Zellkultureinsatz und erlauben ausreichend Platz zwischen den Aggregaten. Mit einer feinen Pipettenspitze ( zB 200 μl Spitze) so viel überschüssige Lösung wie möglich entfernen.
      HINWEIS: Es ist akzeptabel, das SFEB kurz zu stören, da sie sich auf dem Zellkultureinsatz bewegen werden, da die Lösung aus den SFEBs entfernt wird.
   2. Pflegen Sie die Kulturen in 1 ml DM2 bei 37 ° C, 95% Feuchtigkeit und 5% CO ₂ . Mit einer Pipette wechseln Sie 75%Medium jeden zweiten Tag durch die Beseitigung von drei Viertel des Mediums und ersetzt mit drei Vierteln frisches Medium. Zum Beispiel 750 μl Medium entfernen und 750 μl frisches Medium zugeben.
3. Nach 14 Tagen Kultur wechseln Sie zu DM3 Medium mit 75% mittlerer Veränderung jeden zweiten Tag und für weitere 16 Tage.
4. Um die SFEBs auf Zellkultureinsätzen über 30 Tage zu halten, ändere das Medium jeden zweiten Tag für 60, 90 und 120 Tage.
   HINWEIS: Die SFEBs wachsen auf etwa 1000 μm Durchmesser und sind typischerweise 100-150 μm dick ¹ .

3. Bestimmung der SFEB-Zusammensetzung

1. Lösen Sie die SFEBs aus dem Einsatz durch sanftes Pipettieren von Medium mit einer 200 μl breiten Mundpipettenspitze. Um die SFEBs zu transportieren, verwenden Sie eine breite Mundpipettenspitze, um die Körper vorsichtig in die Pipettenspitze zu saugen. Nach dem Beladen von SFEB in die Pipettenspitze, sanft auf 12-Well-Platten überführen und mit 300 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen(PBS) pro Vertiefung
   HINWEIS: SFEBs werden in den 12-Well-Platten in Lösung suspendiert. Dies ist wichtig, um die vollständige Penetration des Fixiermittels, der Blockierungslösung und der Antikörper zu ermöglichen. Bei Verwendung mehrerer SFEBs zur Färbung können bis zu 10 SFEBs pro Well einer 12-Well-Platte zugesetzt werden. Dadurch werden Lösungen und Antikörper konserviert.
2. Fixieren Sie SFEBs mit 300 μl pro Well 4% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 30-45 min. Waschen Sie feste SFEBs zweimal mit 300 μL PBS, 3-5 min jede Waschung.
   Achtung: Bei der Handhabung von Paraformaldehyd geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen.
   HINWEIS: Sonde für Immunreaktivität auf Marker zur Bestimmung der Reife, Zelltyp etc. Für die Markierung von Neuronen in dieser Studie wurde Huhn-Tuj1 bei 1: 500 verwendet, für zusätzliche Marker siehe Tabelle 2 und Referenzen ^{1 , 16} .
3. Permeabilisieren und blockieren mit 0,1% Triton-X100 in PBS und 10% normalem Eselserum (Blockierungslösung, 300 μL pro gut) für 1 h bei Raumtemperatur.
4. Entfernen Sie die Blockierungslösung und behandeln Sie SFEBs mit 300 μl primären Antikörpern in Blockierungslösung. Inkubieren bei 4 ° C über Nacht. Waschen Sie SFEBs dreimal (3-5 min pro Waschgang) in 300 & mgr; l PBS, enthaltend 0,1% Triton-X.
5. Sekundärantikörper 1: 1000 in Blockierungslösung vorbereiten. SFEBs für 1 h bei Raumtemperatur mit sekundären Antikörpern inkubieren. Wasche SFEBs mit 300 μL PBS, 3 mal für 3-5 min.
   HINWEIS: In diesem Stadium können SFEBs für die Bildgebung vorbereitet werden.
6. Zum Bild pipettieren Sie SFEBs auf eine Glasrutsche mit einer breitlochigen Pipette. Entfernen Sie überschüssige Lösung um das SFEB mit sanfter Absaugung.
   HINWEIS: Für ähnliche Färbebedingungen können mehrere SFEBs auf der gleichen Glasrutsche platziert werden.
7. Fügen Sie einen Tropfen Montagemedium auf die SFEBs, legen Sie ein Glas Deckglas, und drücken Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass es keine Luftblasen gibt. Lassen Sie das Montagemedium aushärten und gehen Sie zur Bildgebung und Quantifizierung vor (Schritt 3.8).
   HINWEIS: Nach dem Aushärten des Montagemediums sind die SFEBs für die Bildgebung bereit.
8. Führen Sie die Zellquantifizierung durch, indem Sie mehrere Regionen von Interesse (ROI) über das SFEB nehmen und einen Z-Stack kombinieren mit einem maximalen Projektionsbild durch jeden ROI auf einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop, wie in den Referenzen ^{1 , 16} beschrieben, kombiniert werden.
   HINWEIS: Ganze SFEBs können mit bildbasierten Fliesen quantifiziert werden (siehe Referenzen ^{1 , 16} für Details). Da die SFEBs auf etwa 100 μm dünn sind, gibt es eine minimale Streuung von Licht im Gewebe und somit besteht keine Notwendigkeit für eine 2-Photonen-Mikroskopie. Frühere Verwendungen dieses Protokolls mit Fibroblasten-abgeleiteten iPSCs produzierten eine SFEB-Schicksalskarte, die komplexe und vielfältige Struktur mit Subpopulationen von Interneuronen mit Transkriptionsidentitäten zeigte, die CGE und anterioren Vorderhirnschicksalen ^{1 , 16} ähnelten ^.

4. Neuronale Aktivität in SFEBs mit MEAs aufnehmen

1. Bereiten Sie 12-Well-MEA-Platten gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
2. Waschen Sie die MEA Platten 3 mal für 5 min mit sterilem H ₂ O unter aseptischen Bedingungen zu reinigen. 5 min mit 75% igem Ethanol und dann mit 100% igem Ethanol zum Sterilisieren der Platte waschen.
3. Die Platte in einem Ofen für 4-5 h bei 50 ° C umkehren, um den Sterilisationsvorgang abzuschließen.
4. Füge 500 μl 0,2% Polyethyleniminlösung (PEI) zu jeder Vertiefung hinzu und inkubiere 1 h bei Raumtemperatur. Pflegen Sie PEI und waschen Sie die Wells 4x mit sterilem destilliertem H ₂ O. Luft trocknen in der Kapuze über Nacht.
5. Eine 20 & mgr; l / ml Lösung von Laminin in L15-Medium vorbereiten und 10 & mgr; l Laminin in die Mitte jeder Vertiefung geben.
   HINWEIS: Die umgebenden Referenz- und Erdungselektroden nicht beschichten.
6. Fügen Sie sterile dH ₂ O zu den umgebenden Reservoirs hinzu, um eine mediale oder Lamininverdampfung zu verhindern.Die Platte 1 h bei 37 ° C inkubieren.
7. Fügen Sie SFEBs (siehe Abschnitte 1 und 2) zu den lamininbeschichteten MEA-Platten hinzu, indem Sie sie sanft in eine breite Mundpipettenspitze absaugen und übertragen. 200 μl DM2-Medium in jede Vertiefung geben und über Nacht bei 37 ° C, 95% Feuchtigkeit und 5% CO ₂ inkubieren.
8. Nach 24 h zusätzliches 200 μl Medium zugeben und 30 Minuten bei 37 ° C, 95% Feuchtigkeit, 5% CO ₂ vor dem Messvorgang abkühlen lassen.
9. Legen Sie die MEA-Platte in den Plattenleser (vorgewärmt auf 37 ° C), um neuronale Aktivität aufzuzeichnen. Rekordaktivität für 10 min mit der zugehörigen MEA-Aufnahmesoftware. Siehe Referenz ¹⁹ für Details.
10. Generieren Sie rohe Daten-kontinuierliche Ströme und Rasterplots der neuronalen Aktivität mit Hilfe der statistischen Analyse-Software ¹⁹ .
    HINWEIS: MEA-Aufnahmen werden 7 Tage nach SFEB-Beschichtung genommen. Für diese Studie wurden Aufzeichnungen für 10 min genommen, um Netzwerk-Burst-Aktivität zu erkennen, conKontinuierliche Spur und Rasterplots. SFEBs können langfristig auf MEA-Platten gehalten werden und können über längere Zeit mit umweltgerechten Bedingungen aufgezeichnet werden ( Abbildung 6 ).

Ergebnisse

SFEBs, die mit unserer Technik gezüchtet wurden, lieferten Gewebe mit morphologischen Merkmalen, die einer frühen entwickelnden kortikalen subventrikulären Zone ähneln, die mit umfangreichen Tuj1-positiven Neuronen sowie neuronalen Vorläufern voll ist ( Abbildung 3A ). Zahlreiche sich entwickelnde kortikale Rosetten wurden in den äußeren Schichten und inneren Schichten des SFEB beobachtet ( Fig. 3B ). Die äußere Kante d...

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll liefert die Bedingungen für die Differenzierung einer HiFi-Quelle in eine 3-D-Struktur, die eine frühe Entwicklungsstufe des frontalen Kortex rekapituliert. Diese Prozedur liefert Strukturen, die für die Elektrophysiologie abgefragt werden können, während sie auch der Mikroskopie zugänglich sind. Die endgültige Morphologie des SFEB ähnelt der von organotypischen Hirnscheibenkulturen und ermöglicht eine qualitativ hochwertige, konfokale Bildgebung. Dieses Protokoll kann erfolgreic...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components
STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media)	STEMCELL Technologies	0-5835	250 mL
PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media)	GlobalStem	GSM-2001
Name	Company	Catalog Number	Comments
DM1 Media Components
D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1	Invitrogen	10565018	385 mL
Knockout Serum Replacement	Invitrogen	10828028	20% 100 mL
Pen/Strep	Invitrogen	15140122	5 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid	Invitrogen	11140050	5 mL
2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid	Invitrogen	21985023	900 μL
Name	Company	Catalog Number	Comments
DM2 Media Components
D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1	Invitrogen	10565018	500 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
Pen/Strep	Invitrogen	15140122	5 mL
N-2 Supplement (100x), liquid	Invitrogen	17502048	10 mL
Name	Company	Catalog Number	Comments
DM3 Media Components
NEUROBASAL Medium (1x), liquid	Invitrogen	21103049	500 mL
B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid	Invitrogen	12587010	10 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
Pen/Strep	Invitrogen	15140122	5 mL
Name	Company	Catalog Number	Comments
Small Molecules
Thiazovivin	Stemgent	04-0017	2 μM
SB431542	Stemgent	04-0010-10	1:1,000 (10 μM)
Dorsomorphin	Stemgent	04-0024	1 μM
LDN-193189	Stemgent	04-0074-10	250 nM
Y27632 (ROCKi)	Stemgent	04-0012-10	10 μM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant Protiens
DKK-1	Peprotech	120-30	200 ng/mL
Name	Company	Catalog Number	Comments
Components/Materials
Cell Culture inserts 0.4 μM, 30mm Diameter	Millicell	PICM0RG50
Mouse Embryonic Fibroblasts	GlobalStem	GSC-6301G
96 well V bottom w/Lids	Evergreen	222-8031-01V
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	ThermoFisher	A1110501
TritonX-100	ThermoFisher	85111
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher	10010023	500 mL
Normal Donkey Serum	Jackson Labs	017-000-121
Leibovitz's L-15 Medium	ThermoFisher	11415114	500 mL
DRAQ5 (Nuclear Marker)	ThermoFisher	65-0880-96
MEA Plates	Axion Biosystems	M768-GL1-30Pt200
6 well flat bottom	Falcon	353046
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Nestin	Millipore	MAB5326
Brn-2	Protein tech	14596-1-AP
VGLUT1	Synaptic Systems	135 303
Pax6	abcam	ab5790
Calretinin	abcam	ab702
Calbindin	abcam	ab11426
CoupTFII	R&D Systems	PPH714700
Nkx 2.1	abcam	ab12650
Tuj1	abcam	ab41489
Reelin	Millipore	MAB5364
Tbr1	Millipore	MAB2261
NFH	Dako	M0762