قياس الالتقام حويصلة متشابك في الخلايا العصبية هيبوكامبال مثقف

Summary

تم الكشف عن الالتقام حويصلة متشابك الخفيفة الميكروسكوب من فلورين تنصهر مع البروتين حويصلة متشابك والمجهر الإلكتروني لامتصاص حويصلة.

Abstract

خلال الالتقام، يتم استرداد حويصلات متشابك تنصهر في المحطات العصبية، مما يسمح لإعادة التدوير حويصلة ومن ثم الحفاظ على انتقال متشابك أثناء إطلاق العصبية المتكررة. الالتقام البصر في الحالات المرضية ويؤدي إلى نقصان في مهام القوة والدماغ متشابك. هنا، يمكننا وصف الطرق المستخدمة لقياس الالتقام حويصلة متشابك في المشبك هيبوكامبال الثدييات في ثقافة العصبية. نحن يرصدها الالتقام البروتين حويصلة متشابك الصمامات بروتين غشائي حويصلية متشابك، بما في ذلك سينابتوفيسين و VAMP2/سينابتوبريفين، إلى جانب لومينال حويصلية، مع فلورين، حساسة لدرجة الحموضة بروتين فلورية خضراء التي تزيد عن كثافة الأسفار كما يزيد من درجة الحموضة. خلال الرقابة، يزيد الرقم الهيدروجيني التجويف حويصلية، بينما خلال التجويف حويصلية الالتقام الأس الهيدروجيني إعادة المحمضة. وهكذا، يشير إلى زيادة كثافة fluorescence فلورين الانصهار، بينما تشير إلى انخفاض الالتقام البروتين المسمى حويصلة متشابك. بالإضافة إلى استخدام أسلوب التصوير فلورين لتسجيل الالتقام، نحن يرصدها غشاء حويصلية الالتقام بقياسات الميكروسكوب الإلكتروني (م) الفجل البيروكسيديز (HRP) امتصاص حويصلات. وأخيراً، نحن رصد تشكيل الأعصاب الطرفية الغشاء حفر في أوقات مختلفة بعد depolarization المستحثة بالبوتاسيوم عالية. يشير مسار الوقت لتشكيل حفرة الامتصاص والغشاء HRP إلى مسار الوقت الالتقام.

Introduction

أجهزة الإرسال العصبية المخزنة في حويصلات متشابك وصدر عن الرقابة. غشاء حويصلة متشابك والبروتين ثم استيعابه الالتقام، وإعادة استخدامها في الجولة القادمة للرقابة. أمر مهم للحفاظ على تجمعات حويصلة متشابك الالتقام حويصلات متشابك ويزيل حويصلات بارزة من غشاء البلازما. وقد استخدمت فلورين البروتينات الفلورية الخضراء حساسة لدرجة الحموضة، وهو مروي في الظروف الحمضية وديكوينتشيد في الأس الهيدروجيني المحايدة، لقياس الوقت الالتقام دورات في العيش الخلايا^1،،من²³. عادة ما ترتبط البروتين فلورين الجانب لومينال حويصلة متشابك البروتينات، مثل سينابتوفيسين أو VAMP2/سينابتوبريفين. في الراحة وهي تطفئ فلورين في التجويف pH 5.5 من حويصلات متشابك. حويصلة الانصهار لغشاء البلازما يكشف التجويف حويصلية للحل خارج الخلية حيث هو الرقم الهيدروجيني ~ 7.3، أدى إلى زيادة في الأسفار فلورين. بعد الرقابة، يتعفن fluorescence المتزايدة، نظراً الالتقام بروتينات حويصلة متشابك تليها التحمض إعادة حويصلة داخل تلك الحويصلات المستردة. على الرغم من أن يعكس الانحلال الالتقام وتحمض إعادة حويصلية، أنه يعكس الالتقام، معظمها لتحميض إعادة أسرع من الالتقام في معظم الأحوال^1،4. هو وقت ثابت لإعادة التحميض s 3-4 أو أقل^5،6، الذي عادة أسرع من 10 s أو أكثر مطلوب لحويصلة الالتقام^4،5. إذا كانت التجارب ضرورية للتمييز بين الالتقام من إعادة التحميض، حمض تجارب التبريد باستخدام الحل (MES) حمض مورفولينيثانيسولفونيك 4 (25 مم) مع الرقم الهيدروجيني 5.5 يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كان يتم استرداد البروتينات حويصلة متشابك من غشاء البلازما عن طريق الالتقام^1،،من³⁴. وبالتالي، زيادة كثافة fluorescence فلورين يعكس توازناً أكسو-والالتقام، ويعكس الانخفاض بعد تحفيز الأعصاب على وجه التحديد الالتقام.

يمكن استخدام التصوير فلورين ليس فقط لقياس الدورة الزمنية الالتقام، ولكن أيضا حجم حويصلة متشابك برك^7،8، واحتمال الإفراج عن مقولة وعفوية الإفراج عن⁹. العديد من العوامل والبروتينات المشاركة في تنظيم الالتقام، مثل الكالسيوم وجبهة الخلاص الوطني-مرفق قابل للذوبان بروتين مستقبلات (الفخ) البروتينات، factor(BDNF) نيوروتروفيك المستمدة من الدماغ وكالسينيورين وقد حددت استخدام التصوير فلورين^{1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16}-وعلاوة على ذلك، يمكن اكتشاف الإفراج عن العصبي في الخلايا العصبية الأولية فقط لا بل في خلايا neuroblastoma مع تيرفم¹⁷. مؤخرا، تم وضع المتغيرات فلورين، دسريد، مورانج وفتوماتو لرصد تسجيلات المتزامن لعوامل متعددة في^18،المشبك واحد¹⁹. على سبيل المثال، تنصهر مع سينابتوفيسين فتوماتو ويستخدم مع مؤشر كالسيوم مشفرة جينياً (GCaMP5K) لمراقبة الانصهار حويصلة presynaptic و Ca^{2 +} تدفق في حجرة بوستسينابتيك²⁰. ولذلك، فلورين يعلق على البروتينات متشابك يوفر وسيلة مفيدة لتحليل العلاقة بين الالتقام والرقابة.

أم هو أسلوب آخر استخداماً في دراسة الالتقام، سبب عالية الدقة المكانية التي تظهر التغييرات ultrastructural أثناء الالتقام. اثنين من مجالات عامة هي القدرة على تصور التغييرات المرضية داخل الخلايا العصبية²¹ وتعقب حويصلة البروتينات²². على وجه الخصوص، مراقبة امتصاص حويصلة متشابك، انحناء غشاء المغلفة كلاثرين في منطقة بيرياكتيفي، وهياكل اندوسومال ممكن مع م^3،،من^{2324،25 26، ،،}من²⁷²⁸. بينما م ينطوي على التحف المحتملة، مثل التشوهات الناجمة عن مثبت، التي قد تؤثر على الالتقام، وتحليل بيانات العمالة المكثفة، أن القرار يوفر فرصة جذابة لتصور البنية الخلوية. يمكن التغلب على المشاكل المحتملة مثبت والقيد في الأزمنة م بالضغط العالي تجميد، وتوفير وسيلة سريعة وغير كيميائية لاستقرار الهياكل الدقيقة الحالية أثناء الالتقام²⁷.

Protocol

ملاحظة: البروتوكول التالي يصف أساليب التصوير فلورين وم الأساليب المستخدمة في استزراع الخلايا العصبية هيبوكامبال. فلورين شاشات حويصلة متشابك بروتين امتصاص في الخلايا الحية ويكشف م الإقبال على حويصلة متشابك و التغييرات ultrastructural.

رعاية الحيوان والإجراء المعاهد الوطنية للصحة للمبادئ التوجيهية ووافقت عليها لجنة الاستخدام والمعاهد الوطنية للصحة الحيوانية العناية.

1-فلورين التصوير

1. ثقافة العصبية هيبوكامبال
   1. تحضير الحصين المخزن المؤقت (خضاب الدم) عن طريق الجمع بين NaHCO ₃ 4 و 5 ملم هيبيس وضبط على درجة الحموضة 7.3 مع 5 م هيدروكسيد الصوديوم. جعل المتوسط الثقافة بخلط نيوروباسال المتوسط، 2% B27، 0.5 مم ستربتوميسين البنسلين لام الجلوتامين و 1%. بالإضافة إلى ذلك، إعداد خليط من المخزن المؤقت غبطة مع 20% "مصل بقرى الجنين" (HB/20% FBS).
      ملاحظة: يستند هذا البروتوكول تثقيف أرى, et al. ²⁹ ووو , et al. ²⁴
   2. قطع رأس الجراء الماوس بين يوم بعد الولادة 0 إلى 2 في اليوم في المتوسط الثقافة، واستخراج المخ إلى 4 درجة مئوية HB/20% FBS. إزالة الدماغ والمهاد لفضح هيبوكامبي. تشريح خارج هيبوكامبي، بعد كشف أنه بإزالة الدماغ والمهاد، ونقل إلى الطازجة 4 درجة مئوية HB/20% FBS-
      ملاحظة: عادة ما يكون العائد حوالي 4 × 10 ⁵ خلايا/مل ألجرو واحد (اثنين هيبوكامبي). نظيفة من الأغشية المنضمة باستخدام الملقط أو المقص، ثم نقل إلى الطازجة 4 درجة مئوية HB/20% FBS. إلغاء المغزلي المسنن، وعزل في سوبيكولوم بقطع بالمقص، ثم نقل إلى الطازجة 4 درجة مئوية HB/20% FBS-
   3. تقسيم كل الحصين، بقطع من البداية إلى النهاية، إلى حوالي 10 شرائح وتحويلها إلى أنبوب 15 مل مخروطية البوليبروبيلين.
   4. بعد السماح للأنسجة لتسوية، يغسل مع 10 مل من HB/20% FBS، ومن ثم يغسل ثلاث مرات مع 10 مل غبطة.
   5. إعداد الحل الهضم من 137 كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 7 ملم Na2HPO ₄، و 25 ملم هيبيس، وضبط للرقم الهيدروجيني 7.2 مع 5 م هيدروكسيد الصوديوم. إزالة المادة طافية من هيبوكامبي. إضافة 10 مغ التربسين و 1 ملغ من الدناز إلى 2 مل من محلول الهضم، وتصفية من خلال غشاء عقيمة 0.22 ميكرومتر مباشرة على بيليه عينة-
   6. احتضان هيبوكامبي لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية، ثم يغسل مرتين مع 10 مل من HB/20% FBS، ويغسل مرة واحدة مع 10 مل غبطة.
   7. تنأى بالخلايا بملغ 6 مجسو ₄ ∙ 7 ح ₂ س و 1 ملغ من الدناز 2 مل غبطة وتصفية العقيمة على هيبوكامبي بيليه من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر عقيمة. بلطف ننأى بالخلايا بعناية تريتوراتينج، مع الحرص على تجنب إدخال فقاعات الهواء. السماح للجسيمات الأنسجة تسوية لمدة 2 دقيقة، وبعد ذلك ببطء نقل المادة طافية إلى أنبوب آخر.
   8. إضافة 3 مل HB/20% FBS إلى تعليق خلية، وأجهزة الطرد المركزي أو 10 دقيقة في 4 درجات مئوية و 1,000 لفة في الدقيقة. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند في مستنبت.
   الخلايا
   9. 60,000 لوحة علقت في 150 ميليلتر الثقافة المتوسطة في ساترة قطرها 25 ملم بولي-د-يسين المغلفة، دون انسكاب قبالة ساترة. إضافة 2 مل من قبل حرارة الثقافة المتوسطة ح 2 بعد الطلاء. تتم المحافظة على كوفيرسليبس في لوحات تثقيف 6-جيدا أو أطباق بتري معقمة.
   10. المحافظة على الخلايا عند 37 درجة مئوية في نسبة 5% CO ₂ هوميديفيد حاضنة في الثقافة المتوسطة لمدة 14-21 يوما قبل التسجيل. وخلال نمو الثقافة، تغيير النصف الأعلى من المتوسط مرتين في أسبوع-
2. تعداء
   1. 6-7 أيام بعد الطلاء، ترانسفيكت سينابتوفيسين-فلورين 2 X (SpH) أو VAMP2-فلورين في الخلايا العصبية هيبوكامبال. سف، استخدم مروج "الفيروس المضخم للخلايا" (CMV)، إدراج ناقل pcDNA3 ³⁰. بالنسبة VAMP2-فلورين، استخدم مروج CMV إدراجها ناقل pCI ³¹-
   ترانسفيكت
   2. أما ناقل الناقل المادة الدهنية إلى خلايا الهدف، باستخدام 1 ميكروغرام من بلازميد. استخدام الثقافة المتوسطة من البروتوكول خطوة 1.1.1، الذي يفتقر إلى المصل، تعداء. تغيير المتوسطة ح 2 بعد تعداء لتقليل السمية.
      ملاحظة: في حالة منخفضة من التعبير عن SpH في بتونس، زيادة تركيز الحمض النووي إلى 2 ميكروغرام أو وقت الحضانة مع الناقل الدهن، إذا لم تكن الخلايا غير صحية. نموذجياً، 4-10 خلايا (0.006-0.008%) من الخلايا العصبية تم transfected.
3. الخفيفة الميكروسكوب
   1. تحضير المحلول الملحي العادي يتألف من 119 مم كلوريد الصوديوم، 2 مم كاكل ₂، 2.5 ملم بوكل، حبيس (درجة الحموضة 7.4)، الجلوكوز 30 مم، 2 مم مجكل ₂، 25 مم (0.01 مم 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione كنقكس)، و 0.05 ملم حمض DL-2-أمينو-5-فوسفونوفاليريك (AP5). تأخذ ساترة من صفيحة متوسطة الثقافة والمكان في دائرة لتصوير تسمح التحفيز الميدانية، واستخدام زيوت التشحيم وتسرب لتجنب تسرب. تجنب ترك الزجاج الجاف أثناء نقل ساترة من اللوحة إلى الدائرة عن طريق إضافة فورا 750 المحلول الملحي العادي ميليلتر.
      ملاحظة: استخدمت كنقكس و AP5 لحظر نشاط بوستسينابتيك، الذي ينطوي على إمكانات لنشاط متكرر. قبل وضع دائرة على مجهر مقلوب الأسفار، استخدام تنظيف الأنسجة للتأكد من أن الدائرة لا تسرب. تسريب بطيء يسبب تغييرات التركيز أثناء التسجيل بخلط النفط المالحة والغمر العادي، مما يؤدي إلى تغيرات في الانكسار.
   2. التحفيز وتسجيل
      1. الصورة في مجهر مقلوب ويديفيلد مع 60 X (1.4 الفتحة العددية) النفط غمر عدسة مع مصباح هاليد معدني. تصور فلورين مع عامل تصفية مجموعة لذروة إثارة 480 نانومتر، 490 نانومتر تمرير طويل مرآة، عامل تصفية انبعاث 500-550 نانومتر، ومصراع الوجه يدوي. التقاط الصور كل مرض التصلب العصبي المتعدد 100، مع 2 × 2 binning، باستخدام كاميرا إلكترون تتضاعف تهمة إلى جانب جهاز (امككد)-
         ملاحظة: ينبغي النظر العديد من الميزات لتحقيق الظروف الملائمة لتجنب فوتوبليتشينج، بما في ذلك فترة التقاط الصورة، وتصفية و binning، التي تعتمد على المعدات. في حالة التصوير [كنفوكل]، ينبغي النظر في وقت الليزر السلطة والتعرض لتجنب فوتوبليتشينج. مصممة الإعداد بعد تسجيل على الأقل 3 دقائق بدون حافز، وتم إجراء التسجيل لمالا يقل عن 10 s دون حافز للتحقق من فوتوبليتشينج-
      2. اختيار منطقة بكثافة عالية من بتونس وتيسيرا للتحليل في كل تجربة. تحديد خلايا ترانسفيكتيد بإشارة الفلورية الخضراء، مع التركيز على أنماط التعبير مستديرة أو بيضاوية بوتون والتعبير المستمر بين بتونس-
      3. الالتقام الحث بتنشيط الحقل استخدام 1 نبضة، 20 mA العمل المحتملة (أ فب) المقدمة من نبض مشجعا وتسليمها عن طريق قطب البلاتين ضمن وحدة عزل التحفيز. صورة النشاط الأسفار على مدى التحفيز وأثناء استرداد الخلية.
         ملاحظة: في حالة الخلايا الميتة، التعبير أقوى من بوتونس الحية وأظهرت نمطاً متفاوتاً بين بوتونس-
4. تحليل الصور
   1. لتحليل كثافة fluorescence في بوتون واحد، تعيين يصل المنطقة للفائدة (ROI) ك 1.5 x 1.5 ميكرومتر مربع؛ حجم بوتون على مسافة حوالي 1.5 ميكرومتر. استخدام آثار قبل التحفيز للتحقق من فوتوبليتشينج وطرح كخلفية.
   تغيير
   2. fluorescence تطبيع (ΔF) مع المعادلة:
      حيث و _ماكس وو ₀ تشير إلى الزيادة القصوى بعد التحفيز وخط الأساس الأسفار، على التوالي. قياس معدلات الالتقام كمعدل الاضمحلال خلال الأول s 4-10 بعد نقطة الحد الأقصى من الأسفار فلورين. الحصول على وقت ثابت (τ) من الالتقام باحتواء الانحلال fluorescence فلورين من الزيادة القصوى لخط الأساس مع دالة آسيه مونو-

2. المجهر الإلكتروني

1. تحضير بولي-د-يسين المغلفة صفيحة 6-جيدا قبل تطبيق 1.5 مل من 0.01 ٪ العقيمة التي تمت تصفيتها بولي-د-يسين الحل لكل بئر ح 1 في درجة حرارة الغرفة، ثم الغسل ثلاث مرات بالماء المعقم. تشريح، والثقافة، والمحافظة على الخلايا العصبية هيبوكامبال كما هو الحال في الخطوات 1.1.1 و 1.1.2 و 1.1.3، على التوالي.
2. تحضير حلاً تحفيز ك ⁺ عالية مع برنامج الصحة الإنجابية ملم 31.5 كلوريد الصوديوم، 2 مم كاكل ₂، 90 مم بوكل، 25 مم حبيس (درجة الحموضة 7.4)، الجلوكوز 30 مم، 2 مم مجكل ₂ ومم 0.01 كنقكس 0.05 مم AP5 5 ملغ/مل برنامج الصحة الإنجابية، ثم ضبط على درجة الحموضة 7.4 مع م 5 هيدروكسيد الصوديوم.
   1. الحث ثقافة العصبية هيبوكامبال بارتفاع 1.5 مل ك ⁺ الحل التحفيز في درجة حرارة الغرفة (يشار إلى ك ⁺) بالإضافة إلى 1.5 مل لكل بئر ل 90 ثانية. في حالة الراحة (المشار إليها كالبحث والتطوير)، تنطبق نفس تركيز 5 ملغ/مل HRP 90 s، ولكن مع المحلول الملحي العادي. للحصول على نموذج الاسترداد، تطبيق الحل التحفيز ك ⁺ عالية كما هو الحال مع العينة ك ⁺، ثم سرعة تغسل ويستبدل المحلول الملحي العادي واحتضانها للحد الأدنى 10
3. وتثبيت وتلطيخ
   1. إعداد 0.1 م غ كاكوديلاتي المخزن المؤقت باستخدام 21.4 غرام/لتر كاكوديلاتي نا على درجة الحموضة 7.4. إصلاح الخلايا مع 4 ٪ glutaraldehyde في 0.1 م غ كاكوديلاتي المخزن المؤقت على الأقل 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. أغسل ثلاث مرات مع 0.1 م نا كاكوديلاتي المخزن المؤقت لمدة 7 دقائق.
   2. الحل ديامينوبينزيديني إعداد (DAB)، تتألف من 0.5 ملغ/مل من الدأب مع 0.3 ٪ ح ₂ س ₂ في ddH ₂ س، وتصفية مع عامل تصفية 0.22 ميكرومتر. تطبيق الحل الدأب 1.5 مل لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. يغسل ثلاث مرات مع 0.1 م نا كاكوديلاتي المخزن المؤقت لمدة 7 دقائق.
      تنبيه: الدأب مادة مسرطنة سامة والمشتبه فيهم. الرجاء استخدام قفازات ومعاطف المعمل.
      ملاحظة: وسم مع الدأب يحدث نتيجة للأكسدة، ح ₂ س ₂، كما حفزت ببرنامج الصحة الإنجابية. تؤدي الزيادات الصغيرة في المكونات إشارة زيادة في العينة. زيادة تركيز HRP يسرع تأثير المحفز. تجمعات كبيرة بما فيه الكفاية من ح ₂ س ₂ تسمح المنهكة ردود فعل الجانب مع برنامج الصحة الإنجابية، التي تحول دون تأثير وسم ³². في هذا العمل، وتركيزات هذا النظام وضع العلامات اختيرت استناداً إلى البحوث المتاحة حاليا ^{33 ، 34}-
   3. احتضان الخلايا العصبية مع 1.5 مل من 1% أوسو ₄ في 0.1 م غ كاكوديلاتي المخزن المؤقت لح 1 في 4 درجات مئوية كمرحلة ما بعد التثبيت. أغسل ثلاث مرات مع 1.5 مل من 0.1 م نا كاكوديلاتي المخزن المؤقت لمدة 7 دقائق.
      تنبيه: نظراً لسمية ومفاعليه أوسو ₄، حفظ العينة على الجليد في غطاء كيميائية الأفضل في كثير من الحالات إلى استخدام ثلاجة للاحتضان.
   4. تحضير م 0.1 الصوديوم خلات المخزن المؤقت مع 13.61 غرام/لتر صوديوم اسيتات و 11.43 مل/لتر الجليدية حمض الخليك على درجة الحموضة 5.0. تغسل ثلاث مرات مع 1.5 مل م 0.1 خلات المخزن المؤقت على درجة الحموضة 5.0 لكل 7 دقائق واحتضان مع خلات اليورانيل 1% 1.5 مل م 0.1 خلات المخزن المؤقت على درجة الحموضة 5.0 ح 1 في 4 ° أغسل جيم ثلاث مرات مع 1.5 مل م 0.1 خلات المخزن المؤقت لمدة 7 دقائق.
4. الإيبوكسي التضمين
   1. يذوي ثقافة العصبية مع يغسل واحد 1.5 مل من الإيثانول 50%، 70%، و 90 في المائة، لمدة 7 دقائق في كل مجال وثم يغسل 3 من الإيثانول 100% 1.5 مل ل 7 دقيقة في غطاء دخان.
   2. ميكس 485 مل/لتر bisphenol-A-(epichlorhydrin) الإيبوكسي الراتنج، 160 مل/لتر دوديسينيل succinic الخل (دسا)، 340 مل/لتر الفينول 2,4,6-تريس (ديميثيلامينوميثيل) الخل (دكتور)، و 15 مل/لتر الميثيل-5-نوربورنيني-2, 3-ديكاربوكسيليك (برنامج إدارة الكوارث-30) لإنشاء في الإيبوكسي راتنج. المزيج جيدا، ثم تخزين تحت الفراغ لإزالة فقاعات الهواء-
      ملاحظة: أنها حاسمة لإزالة فقاعات الهواء في الراتنج، لا سيما تلك التي أصغر من رؤيته بالعين المجردة، نظراً لأنها يمكن أن تسبب تسوس الأسنان في الراتنج خلال تمزيقها.
   3. ارتشاح الراتنج العينة بالاستعاضة عن الإيثانول مع الإيبوكسي 50% في الإيثانول مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر، ثم 70% الإيبوكسي الراتنج في الإيثانول مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر.
   4. التبديل الإيبوكسي الراتنج الحل مع الراتنج الإيبوكسي 100% واحتضان لمدة 10 دقيقة في 50 درجة مئوية. تنفيذ اثنين التبادلات راتنج الإيبوكسي 100% جديدة مع إينكوباتيونس ح 1 في 50 درجة مئوية. إضافة جديدة 100% الإيبوكسي الراتنج والسماح تتصلب عند 50 درجة مئوية بين عشية وضحاها، ومن ثم في 60 آند #17 6؛ (ج) لما يزيد على 36 ح تتصلب.
5. إزالة كل عينة من لوحة موتى، حسنا مع صائغ ' s المنشار. تحديد المناطق ذات الاهتمام، تجمعات كثيفة من الخلايا، باستخدام مجهر ضوء مقلوب، وثم قطع 70 إلى 80 نانومتر كتل لتمزيقها مبضع. جبل منطقة قطع في تشاك مبضع وتحميل مبضع. ضع تشاك في مبضع وجبل سكين الماس مع حافة موازيا لسطح الكتلة. جمع الفروع من 70 إلى 80 نانومتر سمك مباشرة على الشبكات الفردية-
6. يذوب خلات اليورانيل في المياه لحل 1% بالوزن، ويذوب بشكل منفصل سترات الرصاص في المياه لحل 3% بالوزن. كونتيرستين المقاطع بغمر مع خلات اليورانيل مائي 1% لمدة 15 دقيقة ومن ثم سترات الرصاص مائي 3% لمدة 5 دقائق لتحسين تباين العينات.
7. تصوير م
   1. دراسة المقاطع مع مجهر إلكترون انتقال وتسجيل الصور مع كاميرا رقمية اتفاقية مكافحة التصحر في تكبير الأولية من 10,000-20، 000 X ³.
8. الإحصاءات
   1. أداء تي-اختبار لتحديد فوارق كبيرة بمقارنة متوسط والخطأ المعياري للقياس (s.e.m.) بين التحكم والعينات التجريبية.

النتائج

استخدام أسلوب الناقل الدهن، أعرب SpH في هيبوكامبال الخلايا العصبية، مما يسمح لتحديد بوتونس (الشكل 1a). التحفيز الكهربائي للخلايا التي يسببها الرقابة، وإلى زيادة مقابلة في كثافة الأسفار. الزيادة في الأسفار (ΔF) أوقف قبل إنهاء الحافز (الشكل 1b). ...

Discussion

هنا نظهر طريقتين لرصد الالتقام حويصلة متشابك. في الطريقة الأولى، يمكننا رصد فلورين تنصهر مع بروتين حويصلة متشابك في transfected الخلايا العصبية وحفزت كهربائياً في وقت لاحق. ثانيا، قمنا باستخدام التصوير م من الإقبال على برنامج الصحة الإنجابية كما فعل بوكل. نحن استخدام المحفزات المختلفة لسببين....

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine LTX with Plus	Thermo Fisher	15338-100	Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin
neurobasal medium	Thermo Fisher	21103-049	Growth medium for neuron, Warm up to 37°C before use
B27	Thermo Fisher	17504-044	Gradient for neuronal differentiation
Glutamax	Thermo Fisher	35050-061	Gradient for neuronal culture
Poly-D-Lysine coated coverslip	Neuvitro	GG-25-pdl	Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin
Trypsin XI from bovine pancrease	Sigma	T1005	Neuronal culture-digest hippocampal tissues
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma	D5025	Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension
pulse stimulator	A-M systems	model 2100	Apply electrical stimulation
Slotted bath with field stimulation	Warner Instruments	RC-21BRFS	Apply electrical stimulation
stimulus isolation unit	Warner Instruments	SIU102	Apply electrical stimulation
lubricant	Dow corning	111	pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber
AP5	Tocris	3693	Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity
CNQX	Tocris	190	Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity
Illuminator	Nikon	C-HGFI	Metal halide light source for pHluorin
EMCCD camera	Andor	iXon3	pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity
Inverted microscopy	Nikon	Ti-E	Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells
NIS-Elements AR	Nikon	NIS-Elements Advanced Research	Software for imaging acquisition and analysis
Igor Pro	WaveMetrics	Igor pro	Software for imaging analysis and data presentation
imaging chamber	Warner Instruments	RC21B	pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells
poly-l-lysine	Sigma	P4832	Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times
Horseradish peroxidase(HRP)	Sigma	P6782	Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use
Na cacodylate	Electron Microscopy Sciences	12300	Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N
3,3′-Diaminobenzidine(DAB)	Sigma	D8001	Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use
Hydrogen peroxide solution	Sigma	H1009	Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use
glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16365	Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use
TEM	JEOL	200CX	Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes
CCD digital camera	AMT	XR-100	Electron microscopy, capturing images
Lead citrate	Leica microsystems	16707235	Electron microscopy, grid staining