الجمع بين رامان التصوير وتحليل متعدد المتغيرات لتصور اللجنين، السليلوز، وهيميسيلولوز في جدار الخلية النباتية

Summary

ويهدف هذا البروتوكول لتقديم طريقة عامة لتصور اللجنين، السليلوز، وهيميسيلولوز في جدران الخلايا النباتية باستخدام رامان التصوير وتحليل متعدد المتغيرات.

Abstract

تطبيق رامان التصوير إلى الكتلة الحيوية النباتية آخذ في الازدياد لأنه يمكن أن توفر المعلومات المكانية والتراكيب على المحاليل المائية. ولا يتطلب التحليل عادة إعداد عينات واسعة النطاق؛ يمكن الحصول على المعلومات الهيكلية والكيميائية دون وضع العلامات. ومع ذلك، كل صورة رامان يحتوي على آلاف الأطياف. وهذا يثير صعوبات عند استخراج المعلومات الخفية، وخاصة بالنسبة للمكونات ذات الهياكل الكيميائية مماثلة. يقدم هذا العمل تحليلا متعدد المتغيرات لمعالجة هذه المشكلة. بروتوكول يحدد طريقة عامة لتصور المكونات الرئيسية، بما في ذلك اللجنين والسليلوز، وهيميسيلولوز داخل جدار الخلية النباتية. في هذا البروتوكول، وصفت إجراءات لإعداد العينات، واكتساب الطيفية، ومعالجة البيانات. وهي تعتمد اعتمادا كبيرا على مهارة المشغل في إعداد العينات وتحليل البيانات. باستخدام هذا النهج، وتحقيق رامان يمكن أن يؤديها مستخدم غير متخصص لاكتساب هيغh- بيانات ذات جودة ونتائج ذات مغزى لتحليل جدار الخلية النباتية.

Introduction

Plant biomass is the most abundant renewable resource on Earth; is mainly composed of lignin, cellulose, and hemicellulose; and is considered an attractive source of bioenergy and bio-based chemicals¹. Unfortunately, it can resist degradation and confer hydrolytic stability or structural robustness to the plant cell wall. Such resistance is attributable to the accessible surface area, biomass particle size, degree of polymerization, cellulose crystallinity, and protective lignin². A comprehensive understanding of the structural and chemical nature of the plant cell wall is thus significant from the viewpoint of plant biology and chemistry, as well as from that of commercial utilization. Commonly used wet chemistry analyses, such as chromatography, mass spectrometry, and nuclear magnetic resonance spectroscopy, only provide average compositional data of the measured sample. Furthermore, these methods are invasive and destroy the original structure of the plant tissue³.

The Raman imaging technique is a powerful tool for the nondestructive visualization of spatially resolved chemical information⁴. It uses a laser light to cause inelastic scattering with a photon and relies on changes in polarizability arising from the molecular vibrations. In this case, water causes weak Raman scattering, which makes this approach suitable for in situ investigations of biological samples⁵. The application of the Raman imaging technique to the plant cell wall can elucidate the structure and composition of plant cell walls in their native state, with the resolution on the scale of the single cell and even of the cell wall layers⁶. A typical Raman imaging analysis of a plant cell wall generally consists of three steps: 1) sample preparation, 2) spectral acquisition, and 3) data processing.

Although one of the major advantages of Raman imaging is the ability to achieve label-free and non-destructive spectra with minimal sample preparation, physical sample sectioning is still necessary to expose the surface of interest. This process should be performed carefully to obtain a flat surface, since the technique depends on maintaining optical focus⁷. Spectral acquisition requires a balance between image quality and extensive acquisition times⁸. Data processing aims to effectively extract the chemical information from the image data, especially for the components with similar chemical structures, such as cellulose and hemicellulose. Due to the strong spectral overlap, the exact spectra are difficult to discern. In this case, multivariate analysis is a straightforward approach to effectively uncover the hiding structural and chemical information⁹. This work presents a general protocol describing the use of Raman imaging to visualize the main components in plant cell walls, including lignin, cellulose, and hemicellulose.

Protocol

1. إعداد العينة

1. قطع كتلة الأنسجة الصغيرة (حوالي 3 مم × 3 مم × 5 مم) من عينة النبات (على سبيل المثال، الجذعية الحور).
2. تزج الأنسجة في الماء المغلي منزوع الأيونات لمدة 30 دقيقة. نقل على الفور إلى الماء منزوع الأيونات في درجة حرارة الغرفة (رت) لمدة 30 دقيقة. كرر هذه الخطوة حتى يغسل الأنسجة إلى الجزء السفلي من الحاوية، مشيرا إلى أن الهواء في الأنسجة قد أزيلت وأن الأنسجة قد خففت.
   ملاحظة: للعينات التي تغرق إلى أسفل قبل هذه الخطوة، عموما تكرار هذه الدورة 3-5 مرات.
3. إعداد 20، 50، 70، 90٪ (ت / ت) أليكوتس من البولي ايثيلين جلايكول (بيج) في الماء منزوع الأيونات، وكذلك بيج النقي، والحفاظ على الحلول عند 65 درجة مئوية.
4. احتضان الأنسجة في سلسلة من حمامات بيج متدرج لتحل محل المياه والسماح لل بيج التسلل.
   ملاحظة: عادة، يستخدم بيج مع الوزن الجزيئي 2،000 (PEG2000) للتضمين.
   1. معالجة الأنسجة مع ز(أ) 20٪ بيج لمدة 1 ساعة، (ب) 50٪ بيج لمدة 1.5 ساعة، (ج) 70٪ بيج لمدة 2 ساعة، (د) 90٪ بيج لمدة 2 ساعة، و (ه) 100٪ بيج لمدة 10 ساعة.
5. قبل الحارة كاسيت في 65 درجة مئوية في الفرن. صب بيج تحتوي على كتلة في الكاسيت ثم ضع كتلة الأنسجة في الموضع المطلوب باستخدام ملاقط ما قبل تحسنت أو الإبر.
6. تبرد ببطء أسفل الكاسيت وتخزين الأنسجة في رت حتى الاستخدام.
7. تشريح كتلة بيج تحتوي على الأنسجة المستهدفة في كتلة صغيرة (حوالي 1 سم × 1 سم × 2 سم) باستخدام شفرة حلاقة حادة وتركيبه على مشراح.
8. قطع أجزاء رقيقة من كتلة بيج (عادة 3-10 ميكرون).
9. شطف القسم مع الماء منزوع الأيونات في ساعة الزجاج 10 مرات لإزالة بيج من الأنسجة.
10. تزج المقاطع مع التولوين / الايثانول (2: 1، الخامس / الخامس) لمدة 6 ساعات لإزالة المواد الاستخراجية. إعداد السائل التفاعل عن طريق خلط 65 مل من الماء منزوع الأيونات، 0.5 مل من حمض الخليك، و 0.6 غرام من الصوديوم كلوشعيرة في كوب. إضافة قسم واحد و 3 مل من السائل رد فعل إلى قارورة 5 مل. المسمار على الجزء العلوي من القارورة.
11. تسخين القارورة في حمام مائي في 75 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لإزالة اللجنين من الأنسجة. شطف القسم مع الماء منزوع الأيونات في ساعة الزجاج 10 مرات.
12. نقل القسم غير المعالجة / ديليغنيفيد إلى شريحة المجهر الزجاجي. قم بتفكيك القسم بعناية باستخدام الفرش أو الإبر. إزالة الماء منزوع الأيونات اضافية مع ورقة الأنسجة.
13. تزج القسم في D ₂ O. تغطية العينة مع زلة غطاء الزجاج. ختم غطاء زلة مع طلاء الأظافر لمنع تبخر D ₂ O.

2. اكتساب الطيفي

1. فتح برنامج التشغيل الصك المجهر رامان مبائر. بدوره على الليزر (الطول الموجي = 532 نانومتر)، والتركيز على سطح السيليكون البلورية مع الهدف المجهر 100X، وانقر على زر المعايرة لمعايرة الصك.
2. تبديل الصكإلى وضع المجهر الضوئي وتشغيل مصباح المجهر. جبل شريحة المجهر على خشبة المسرح، مع زلة غطاء تواجه الهدف.
3. عرض العينة مع الهدف المجهر 20X وتحديد مجال الاهتمام. تطبيق زيت الغمر إلى ساترة والتبديل إلى الهدف المجهر الغمر (60X، الفتحة العددية نا = 1.35). التركيز على سطح العينة.
4. تبديل الصك إلى وضع الاختبار رامان وإيقاف مصباح المجهر.
5. اختر منطقة رسم الخرائط باستخدام أداة مستطيلة. تغيير حجم الخطوة لتحديد عدد الأطياف التي تم الحصول عليها.
   ملاحظة: كن على بينة من حجم الخطوة (عادة أكبر من القطر بقعة يحسبها الفتحة العددية للهدف؛ نظريا 1.22λ / نا). الأحجام أدناه هذا سوف يؤدي إلى الإفراط.
6. وقم بتعيين المعلمات الطيفية المثلى للحصول على أفضل نسبة من الإشارة إلى الضوضاء (شنر) والجودة الطيفية في وقت اقتناء مناسب (عموما <8 h)، ديبندينغ على ملاءمة العينة. عموما، إدخال المعلمات التصوير في برنامج الصك على النحو التالي: ليزر (532 نانومتر)، تصفية (100٪)، حفرة (300)، شق (100)، مطياف (1،840 سم ^-1 )، الأخاديد (1200t)، الهدف ( 60X النفط)، ووقت الاستحواذ (2 ق).
7. حفظ البيانات الطيفية قبل معالجة البيانات وتحويلها إلى شكل عالمي (على سبيل المثال، ملفات تكست).

3. تحليل البيانات

1. تحميل البيانات الطيفية (ملفات تكست) في برنامج تحليل البيانات (على سبيل المثال، ماتلاب). تطبيق تقنية الحد من الضوضاء على مجموعة البيانات لتحسين شنر (على سبيل المثال، خوارزمية سافيتسكي غولاي أو خوارزمية المويجات)
2. استخدام عينات غير المعالجة لإنتاج الصور من اللجنين والسكريات. لتصوير اللجنين، والنظر في الذروة الطيفية حوالي 1600 سم ^-1 بسبب العطرية متماثل تمتد الاهتزاز. لتصوير السكاريد (بما في ذلك السليلوز وهيميسيلولوز)، واستخدام الذروة الطيفية أجولة 2،889 سم ^-1 بسبب تش و تش ₂ تمتد.
3. استخدام عينات ديليغنيفيد لتوليد الصور من السليلوز وهيميسيلولوز. أداء الذاتي النمذجة منحنى القرار (سمكر) على أطياف المكتسبة للتمييز أطياف السليلوز وهيميسيلولوز وصورة توزيعاتها.
4. إجراء تحليل المكون الرئيسي (يكا) وتحليل العنقودية على البيانات المكتسبة للتمييز بين أطياف رامان من مختلف طبقات جدار الخلية.

النتائج

الشكل 1 يقدم لمحة عامة عن نظام رامان نموذجي نموذجي لتصوير رامان من جدار الخلية النباتية. على سبيل المثال، أطياف رامان الأصلية من الحور ( بوبولوس نيغرا L.) لديها الانجرافات خط الأساس كبيرة والمسامير ( الشكل 2A ). بعد ?...

Discussion

جدار الخلية النباتية هو مركب الذي تم تنظيمه في عدة طبقات، بما في ذلك زاوية الخلية (سيسي)، الجدار الثانوي (سو، مع S1، S2، و S3 طبقات)، والمركبة لاميلا المتوسطة (سمل، لاميلا المتوسطة بالإضافة إلى الابتدائي المجاور الجدار)، مما يجعل من الصعب الحصول على سطح مستو أثناء إعداد ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtome	Thermo Scientific	Microm HM430
Confocal Raman microscope	Horiba Jobin Yvon	Xplora
Oven	Shanghai ZHICHENG	ZXFD-A5040