Combinazione di Raman Imaging e analisi multivariata per la visualizzazione di lignina, cellulosa e emicellulosa nella parete cellulare delle piante

Riepilogo

Questo protocollo mira a presentare un metodo generale per la visualizzazione della lignina, della cellulosa e dell'emicellulosa nelle pareti delle cellule vegetali utilizzando l'analisi Raman e l'analisi multivariata.

Abstract

L'applicazione di Raman imaging alla biomassa vegetale è in aumento in quanto può offrire informazioni spaziali e compositive sulle soluzioni acquose. L'analisi di solito non richiede un'ampia preparazione dei campioni; Informazioni strutturali e chimiche possono essere ottenute senza etichettatura. Tuttavia, ogni immagine Raman contiene migliaia di spettri; Ciò solleva difficoltà quando estrae informazioni nascoste, soprattutto per i componenti con strutture chimiche simili. Questo lavoro introduce un'analisi multivariata per affrontare questo problema. Il protocollo stabilisce un metodo generale per visualizzare i componenti principali, tra cui la lignina, la cellulosa e l'emicellulosa all'interno della parete cellulare delle piante. In questo protocollo sono descritte le procedure per la preparazione del campione, l'acquisizione spettrale e l'elaborazione dei dati. È altamente dipendente dall'abilità dell'operatore durante la preparazione del campione e l'analisi dei dati. Utilizzando questo approccio, un'indagine di Raman può essere eseguita da un utente non specializzato per ottenere higI dati di qualità h e risultati significativi per l'analisi delle pareti cellulari delle piante.

Introduzione

Plant biomass is the most abundant renewable resource on Earth; is mainly composed of lignin, cellulose, and hemicellulose; and is considered an attractive source of bioenergy and bio-based chemicals¹. Unfortunately, it can resist degradation and confer hydrolytic stability or structural robustness to the plant cell wall. Such resistance is attributable to the accessible surface area, biomass particle size, degree of polymerization, cellulose crystallinity, and protective lignin². A comprehensive understanding of the structural and chemical nature of the plant cell wall is thus significant from the viewpoint of plant biology and chemistry, as well as from that of commercial utilization. Commonly used wet chemistry analyses, such as chromatography, mass spectrometry, and nuclear magnetic resonance spectroscopy, only provide average compositional data of the measured sample. Furthermore, these methods are invasive and destroy the original structure of the plant tissue³.

The Raman imaging technique is a powerful tool for the nondestructive visualization of spatially resolved chemical information⁴. It uses a laser light to cause inelastic scattering with a photon and relies on changes in polarizability arising from the molecular vibrations. In this case, water causes weak Raman scattering, which makes this approach suitable for in situ investigations of biological samples⁵. The application of the Raman imaging technique to the plant cell wall can elucidate the structure and composition of plant cell walls in their native state, with the resolution on the scale of the single cell and even of the cell wall layers⁶. A typical Raman imaging analysis of a plant cell wall generally consists of three steps: 1) sample preparation, 2) spectral acquisition, and 3) data processing.

Although one of the major advantages of Raman imaging is the ability to achieve label-free and non-destructive spectra with minimal sample preparation, physical sample sectioning is still necessary to expose the surface of interest. This process should be performed carefully to obtain a flat surface, since the technique depends on maintaining optical focus⁷. Spectral acquisition requires a balance between image quality and extensive acquisition times⁸. Data processing aims to effectively extract the chemical information from the image data, especially for the components with similar chemical structures, such as cellulose and hemicellulose. Due to the strong spectral overlap, the exact spectra are difficult to discern. In this case, multivariate analysis is a straightforward approach to effectively uncover the hiding structural and chemical information⁹. This work presents a general protocol describing the use of Raman imaging to visualize the main components in plant cell walls, including lignin, cellulose, and hemicellulose.

Protocollo

1. Preparazione del campione

1. Tagliare un piccolo blocco di tessuto (circa 3 mm x 3 mm x 5 mm) dal campione vegetale ( ad es. Un gambo di pioppo).
2. Immergere il tessuto in acqua bollente di deionizzazione per 30 min. Trasferire immediatamente in acqua deionizzata a temperatura ambiente (RT) per 30 minuti. Ripetere questo passaggio finché il tessuto non si affonda sul fondo del contenitore, indicando che l'aria nel tessuto è stata rimossa e che il tessuto si è ammorbidito.
   Nota: Per i campioni che si affondano sul fondo prima di questo passaggio, ripetere generalmente questo ciclo 3-5 volte.
3. Preparare 20, 50, 70, 90% (v / v) aliquote di polietilenglicole (PEG) in acqua deionizzata, pure pure PEG e mantenere le soluzioni a 65 ° C.
4. Incubare il tessuto in una serie di bagni PEG classificati per spostare l'acqua e consentire l'infiltrazione del PEG.
   Nota: In genere, PEG con peso molecolare 2.000 (PEG2000) viene utilizzato per l'incorporamento.
   1. Processare il tessuto con g(A) 20% PEG per 1h, (b) 50% PEG per 1,5h, (c) 70% PEG per 2h, (d) 90% PEG per 2 ore e E) 100% PEG per 10 h.
5. Preriscaldare una cassetta a 65 ° C in un forno. Versare il PEG contenente il blocco nella cassetta e quindi posizionare il blocco di tessuto in una posizione desiderata utilizzando pinzette o aghi preriscaldati.
6. Lentamente raffreddare la cassetta e conservare il tessuto in RT fino all'uso.
7. Sezionare il blocco PEG contenente il tessuto bersaglio in un piccolo blocco (circa 1 cm x 1 cm x 2 cm) usando una lama raso tagliente e montarla sul microtomo.
8. Tagliare le sezioni sottili dal blocco PEG (tipicamente 3-10 μm).
9. Sciacquare la sezione con acqua deionizzata in un vetro da orologio 10 volte per rimuovere la PEG dal tessuto.
10. Immergere le sezioni con toluene / etanolo (2: 1, v / v) per 6 ore per rimuovere gli estrattivi. Preparare il liquido di reazione mescolando 65 ml di acqua deionizzata, 0,5 ml di acido acetico e 0,6 g di sodio chloRito in un bicchiere. Aggiungere una sezione e 3 ml di liquido di reazione a una fiala da 5 ml. Avvitare la parte superiore della fiala.
11. Scaldare la fiala in bagno d'acqua a 75 ° C per 2 ore per rimuovere la lignina del tessuto. Sciacquare la sezione con acqua deionizzata in un vetro da orologio 10 volte.
12. Trasferire la sezione non trattata / delignificata ad una vetrina del microscopio di vetro. Aprire con cura la sezione con spazzole o aghi. Rimuovere l'acqua extra deionizzata con carta velina.
13. Immergere la sezione in D ₂ O. Coprire il campione con una slitta di copertura in vetro. Sigillare il coperchio della copertura con smalto per prevenire l'evaporazione del D ₂ O.

2. Acquisizione spettrale

1. Aprire il software operativo dello strumento del microscopio Raman confocale. Accendere il laser (lunghezza d'onda = 532 nm), mettere a fuoco sulla superficie del silicio cristallino con un obiettivo microscopico 100X e fare clic sul pulsante di calibrazione per calibrare lo strumento.
2. Spostare lo strumentoAlla modalità microscopica ottica e accendere la lampada del microscopio. Montare la diapositiva del microscopio sul palco, con la slitta di copertura rivolta verso l'obiettivo.
3. Visualizzare il campione con un obiettivo del microscopio 20X e individuare l'area di interesse. Applicare olio di immersione sul coperchio e passare all'obiettivo del microscopio di immersione (60X, apertura numerica NA = 1,35). Focus sulla superficie del campione.
4. Passare lo strumento alla modalità di prova Raman e spegnere la lampada del microscopio.
5. Scegliere un'area di mappatura utilizzando uno strumento rettangolare. Modifica la dimensione del passo per determinare il numero di spettri ottenuti.
   Nota: tenere presente la dimensione del passo (di solito più grande del diametro del punto calcolato dall'apertura numerica dell'obiettivo, teoricamente 1.22λ / NA). Le dimensioni sotto di questo provocheranno un oversampling.
6. Impostare i parametri ottimali di spettro per ottenere il miglior rapporto segnale / rumore (SNR) e qualità spettrale in un opportuno tempo di acquisizione (generalmente <8 h), depeSulla conformità del campione. In genere, immettere i parametri di imaging nel software dello strumento come nel seguente modo: laser (532 nm), filtro (100%), foro (300), fessura (100), spettrometro (1.840 cm ^-1 ), scanalature (1200t) Olio 60X) e tempo di acquisizione (2 s).
7. Salvare i dati spettrali prima dell'elaborazione dei dati e convertirli in un formato universale ( ad esempio, file TXT).

3. Analisi dei dati

1. Caricare i dati spettrali (file TXT) nel software di analisi dei dati ( ad esempio, Matlab). Applicare una tecnica di riduzione del rumore sul set di dati per migliorare il SNR ( ad esempio, l'algoritmo Savitzsky-Golay o l'algoritmo wavelet)
2. Utilizzare campioni non trattati per produrre le immagini di lignina e polisaccaridi. Per l'imaging di lignina, considerare il picco spettrale di circa 1.600 cm ^{-1 a} causa della vibrazione simmetrica di stretching anulare. Per la formazione di polisaccaridi (inclusa la cellulosa e l'emicellulosa), utilizzare il picco spettrale aIntorno a 2.889 cm ^{-1 a} causa dei tratti CH e CH2.
3. Utilizzare campioni delignificati per generare le immagini di cellulosa e emicellulosa. Eseguire la risoluzione della curva di auto-modellizzazione (SMCR) sugli spettri acquisiti per discriminare lo spettro di cellulosa e emicellulosa e per rappresentare le loro distribuzioni.
4. Eseguire l'analisi dei componenti principali (PCA) e l'analisi clustering sui dati acquisiti per distinguere gli spettri Raman da diversi strati di parete cellulare.

Risultati

La figura 1 presenta una panoramica di un tipico sistema micro-Raman per l'imaging Raman di una parete cellulare. Ad esempio, gli spettri Raman originali del pioppo ( Populus nigra L.) presentano significative derive e spicchi di base ( Figura 2a ). Dopo aver eseguito il metodo automatico di pre-elaborazione per il set di dati Raman Imaging (APRI), questi due contaminanti spettrali vengono eliminati con successo ( <...

Discussione

La parete cellulare è un composito organizzato in diversi strati, tra cui l'angolo di cella (CC), la parete secondaria (SW, con gli strati S1, S2 e S3) e la lamella centrale composta (CML, lamella centrale e principale adiacente Parete) che rende difficile ottenere una superficie piana durante la preparazione del campione. Pertanto, i campioni di piante, in particolare l'erba, che hanno una struttura più complessa del legno, spesso devono essere solidificati per consentire una sezione sottile. PEG è una matri...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtome	Thermo Scientific	Microm HM430
Confocal Raman microscope	Horiba Jobin Yvon	Xplora
Oven	Shanghai ZHICHENG	ZXFD-A5040