Combinando imagem Raman e análise multivariada para visualizar Lignina, celulose e hemicelulose no muro celular da planta

Resumo

Este protocolo visa apresentar um método geral para visualizar lignina, celulose e hemicelulose em paredes celulares de plantas usando imagem de Raman e análise multivariada.

Resumo

A aplicação da imagem de Raman para planta de biomassa está aumentando porque pode oferecer informações espaciais e de composição sobre soluções aquosas. A análise geralmente não requer preparação extensiva de amostras; As informações estruturais e químicas podem ser obtidas sem rotulagem. No entanto, cada imagem Raman contém milhares de espectros; Isso levanta dificuldades ao extrair informações ocultas, especialmente para componentes com estruturas químicas semelhantes. Este trabalho apresenta uma análise multivariada para resolver esta questão. O protocolo estabelece um método geral para visualizar os principais componentes, incluindo lignina, celulose e hemicelulose dentro da parede celular da planta. Neste protocolo, são descritos os procedimentos para preparação de amostras, aquisição espectral e processamento de dados. É altamente dependente da habilidade do operador na preparação da amostra e análise de dados. Ao usar essa abordagem, uma investigação Raman pode ser realizada por um usuário não especialista para adquirirDados de qualidade h e resultados significativos para análise de parede celular vegetal.

Introdução

Plant biomass is the most abundant renewable resource on Earth; is mainly composed of lignin, cellulose, and hemicellulose; and is considered an attractive source of bioenergy and bio-based chemicals¹. Unfortunately, it can resist degradation and confer hydrolytic stability or structural robustness to the plant cell wall. Such resistance is attributable to the accessible surface area, biomass particle size, degree of polymerization, cellulose crystallinity, and protective lignin². A comprehensive understanding of the structural and chemical nature of the plant cell wall is thus significant from the viewpoint of plant biology and chemistry, as well as from that of commercial utilization. Commonly used wet chemistry analyses, such as chromatography, mass spectrometry, and nuclear magnetic resonance spectroscopy, only provide average compositional data of the measured sample. Furthermore, these methods are invasive and destroy the original structure of the plant tissue³.

The Raman imaging technique is a powerful tool for the nondestructive visualization of spatially resolved chemical information⁴. It uses a laser light to cause inelastic scattering with a photon and relies on changes in polarizability arising from the molecular vibrations. In this case, water causes weak Raman scattering, which makes this approach suitable for in situ investigations of biological samples⁵. The application of the Raman imaging technique to the plant cell wall can elucidate the structure and composition of plant cell walls in their native state, with the resolution on the scale of the single cell and even of the cell wall layers⁶. A typical Raman imaging analysis of a plant cell wall generally consists of three steps: 1) sample preparation, 2) spectral acquisition, and 3) data processing.

Although one of the major advantages of Raman imaging is the ability to achieve label-free and non-destructive spectra with minimal sample preparation, physical sample sectioning is still necessary to expose the surface of interest. This process should be performed carefully to obtain a flat surface, since the technique depends on maintaining optical focus⁷. Spectral acquisition requires a balance between image quality and extensive acquisition times⁸. Data processing aims to effectively extract the chemical information from the image data, especially for the components with similar chemical structures, such as cellulose and hemicellulose. Due to the strong spectral overlap, the exact spectra are difficult to discern. In this case, multivariate analysis is a straightforward approach to effectively uncover the hiding structural and chemical information⁹. This work presents a general protocol describing the use of Raman imaging to visualize the main components in plant cell walls, including lignin, cellulose, and hemicellulose.

Protocolo

1. Preparação da amostra

1. Corte um pequeno bloco de tecido (cerca de 3 mm x 3 mm x 5 mm) da amostra da planta ( por exemplo, uma haste de álamo).
2. Mergulhe o tecido em água desionizada fervente durante 30 min. Imediatamente transferi-lo para água desionizada à temperatura ambiente (RT) durante 30 min. Repita este passo até o tecido escorrer no fundo do recipiente, indicando que o ar no tecido foi removido e que o tecido se amaciou.
   Nota: Para as amostras que afundam no fundo antes desta etapa, geralmente repita este ciclo 3-5 vezes.
3. Prepare as alíquotas 20, 50, 70, 90% (v / v) de polietileno glicol (PEG) em água desionizada, bem como PEG puro e mantenha as soluções a 65 ° C.
4. Incube o tecido em uma série de banhos graduados de PEG para deslocar a água e permitir que o PEG se infiltre.
   Nota: Tipicamente, PEG com um peso molecular de 2.000 (PEG2000) é usado para incorporação.
   1. Processar o tecido com gPEG radiado num forno de secagem da seguinte forma: (a) 20% de PEG durante 1 h, (b) 50% de PEG durante 1,5 h, (c) 70% de PEG durante 2 h, (d) 90% de PEG durante 2 h e (E) 100% de PEG por 10 h.
5. Pré-aqueça uma cassete a 65 ° C no forno. Despeje o PEG que contém o bloco na cassete e, em seguida, coloque o bloco de tecido em uma posição desejada usando pinças pré-aquecidas ou agulhas.
6. Lixar lentamente a cassete e armazenar o tecido à TA até o uso.
7. Disseca o bloco de PEG contendo o tecido alvo em um pequeno bloco (cerca de 1 cm x 1 cm x 2 cm) usando uma lâmina afiada e montá-lo no microtomo.
8. Corte seções finas do bloco PEG (tipicamente 3-10 μm).
9. Enxague a seção com água desionizada em um vidro de relógio 10 vezes para remover o PEG do tecido.
10. Mergulhe as secções com tolueno / etanol (2: 1, v / v) durante 6 h para remover os extrativos. Prepare o líquido de reação misturando 65 mL de água desionizada, 0,5 mL de ácido acético e 0,6 g de chlo de sódioRito em um copo. Adicione uma seção e 3 mL de líquido de reação a um frasco de 5 mL. Aperte o topo do frasco.
11. Aqueça o frasco em banho-maria a 75 ° C durante 2 h para remover a lignina do tecido. Enxague a seção com água desionizada em um vidro de relógio 10 vezes.
12. Transfira a seção não tratada / desligada para uma lâmina de microscópio de vidro. Desdobre a seção com cuidado usando escovas ou agulhas. Remova a água extra desionizada com papel de seda.
13. Mergulhe a seção em D ₂ O. Cubra a amostra com uma cobertura de vidro. Selar a tampa com esmalte para evitar a evaporação do D ₂ O.

2. Aquisição espectral

1. Abra o software de operação do instrumento do microscópio Raman confocal. Ligue o laser (comprimento de onda = 532 nm), foco na superfície do silício cristalino com um objetivo de microscópio 100X e clique no botão de calibração para calibrar o instrumento.
2. Mude o instrumentoPara o modo microscópio óptico e acenda a lâmpada do microscópio. Monte o escorredor do microscópio no palco, com a tampa deslizante voltada para o objetivo.
3. Veja a amostra com um objetivo de microscópio 20X e localize a área de interesse. Aplique óleo de imersão na lamínula e mude para o objetivo do microscópio de imersão (60X, abertura numérica NA = 1.35). Concentre-se na superfície da amostra.
4. Mude o instrumento para o modo de teste Raman e desligue a lâmpada do microscópio.
5. Escolha uma área de mapeamento usando uma ferramenta retangular. Altere o tamanho do passo para determinar o número de espectros obtidos.
   Nota: Esteja ciente do tamanho do passo (geralmente maior do que o diâmetro do ponto calculado pela abertura numérica do objetivo, teoricamente 1,22λ / NA). Tamanhos abaixo disso resultarão em oversampling.
6. Defina os parâmetros espectrais ótimos para obter a melhor relação sinal-ruído (SNR) e qualidade espectral em um tempo de aquisição apropriado (geralmente <8 h), depeCom base na adequação da amostra. Em geral, insira os parâmetros de imagem no software do instrumento da seguinte forma: laser (532 nm), filtro (100%), furo (300), fenda (100), espectrômetro (1.840 cm ^-1 ), sulcos (1200t), objetivo ( Óleo 60X) e tempo de aquisição (2 s).
7. Salve os dados espectrales antes do processamento de dados e converta-os em um formato universal ( por exemplo, arquivos TXT).

3. Análise de dados

1. Carregue os dados espectrales (arquivos TXT) no software de análise de dados ( por exemplo, Matlab). Aplique uma técnica de redução de ruído no conjunto de dados para melhorar o SNR ( por exemplo, o algoritmo Savitzsky-Golay ou o algoritmo wavelet)
2. Use amostras não tratadas para produzir imagens de lignina e polissacarídeos. Para a imagem de lignina, considere o pico espectral em torno de 1.600 cm ^-1 devido à vibração de alongamento simétrica do anel aromático. Para imagens de polissacarídeos (incluindo celulose e hemicelulose), use o pico espectral aRodada 2.889 cm ^-1 por causa dos trechos CH e CH ₂ .
3. Use amostras deslocadas para gerar imagens de celulose e hemicelulose. Execute a resolução da curva de auto-modelagem (SMCR) nos espectros adquiridos para discriminar os espectros de celulose e hemicelulose e para a imagem de suas distribuições.
4. Execute análise de componentes principais (PCA) e análise de agrupamento nos dados adquiridos para distinguir os espectros Raman de camadas de parede celular diferentes.

Resultados

A Figura 1 apresenta uma visão geral de um sistema típico de micro-Raman para a imagem de Raman de uma parede celular de planta. Por exemplo, os espectros de Raman originais do álamo ( Populus nigra L.) têm derivações e espigas de linha de base significativas ( Figura 2a ). Depois de executar o método de pré-processamento automático para o conjunto de dados de imagem Raman (APRI), esses dois contaminantes espec...

Discussão

A parede celular da planta é um composto que é organizado em várias camadas, incluindo o canto da célula (CC), a parede secundária (SW, com as camadas S1, S2 e S3) e a lamela intermediária composta (LMC, lamela média mais a primária adjacente Parede), o que dificulta a obtenção de uma superfície plana durante a preparação da amostra. Assim, as amostras de plantas, especialmente a grama, que tem uma estrutura mais complicada do que a madeira, muitas vezes precisam ser solidificadas para permitir a separaçã...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtome	Thermo Scientific	Microm HM430
Confocal Raman microscope	Horiba Jobin Yvon	Xplora
Oven	Shanghai ZHICHENG	ZXFD-A5040